流感病毒實驗室檢測

1、流感病毒實驗室檢測技術流感病毒實驗室檢測技術及盲樣考核結(jié)果分析及盲樣考核結(jié)果分析湖南省疾病預防控制中心微生物檢驗科黃一偉2013-12-27流感監(jiān)測目的 （一）監(jiān)測流感活動水平和流行動態(tài)； （二）及時發(fā)現(xiàn)流感病毒變異并作出預警； （三）為全球及我國流感疫苗毒株的預測和推薦提供依據(jù)。流感監(jiān)測內(nèi)容 （一）流感樣病例監(jiān)測 （二）流感樣病例暴發(fā)疫情監(jiān)測流感樣病例監(jiān)測標本采集 采集對象： 流感樣病例流感樣病例 發(fā)熱（體溫發(fā)熱（體溫3838），伴咳嗽或咽痛之一者），伴咳嗽或咽痛之一者 采集時間：病人發(fā)病的頭3天內(nèi)采集 采集地點：國家級流感樣病例監(jiān)測哨點醫(yī)院 采集數(shù)量：根據(jù)就診ILI病例數(shù)的多少，每家哨點醫(yī)

2、院每周至少采集515份流感樣病例的標本(根據(jù)流行季節(jié)、流行強度、防控工作需要實時調(diào)整）暴發(fā)疫情標本采集 （1）1周內(nèi)，在同一學校、幼兒園或其他集體單位發(fā)生30例及以上流感樣病例；或發(fā)生5例及以上因流感樣癥狀住院病例（不包括門診留觀病例）；或發(fā)生2例及以上有流行病學關聯(lián)的死亡病例； （2）在某一社區(qū)內(nèi)（如同一鄉(xiāng)或街道）1周內(nèi)出現(xiàn)流感樣病例異常增多。 每一起暴發(fā)疫情一般應當采集10份左右咽、鼻拭子標本（如果現(xiàn)癥病例在10例以下的，應當盡量全部采樣）。采集標本類型 常規(guī)常規(guī)特殊特殊咽拭子咽拭子 鼻咽/呼吸道吸取物鼻拭子鼻拭子 鼻洗液痰液 呼吸道灌洗液 肺組織活檢標本 尸檢標本采樣液 常用的采樣液有：

3、PH 7.4-7.6的Hanks液或MEM； 標本采集后應立即放入適當?shù)牟蓸右褐械蜏乇４妫瑫r加入抗菌素（入慶大霉素 50 mg/mL，多粘菌素B 250g/mL ）咽拭子采集咽拭子咽拭子 用滅菌棉簽（最好用聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子）擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁，將棉簽頭部浸入含3-4ml采集液的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。標本的保存與運送 標本采集后應在4條件下，盡快（哨點監(jiān)測48小時疫情24小時內(nèi)）運送至流感監(jiān)測網(wǎng)絡實驗室 未能送至實驗室的，應置-70或以下保存，一周內(nèi)送實驗室 凍存的標本，盡量避免其反復凍融，在冷藏條件下送到實驗室實驗室生物安全要求l季節(jié)性流感病毒分離鑒定在生物安全級實驗室進行

4、。l流感病毒分離鑒定及其它檢測過程中所有能夠產(chǎn)生感染性氣溶膠的過程必須在生物安全級實驗室的生物安全柜里操作。l用滅活的抗原進行血清學檢測時可以在生物安全級實驗室進行標本的接收 接收標本時必須核對送檢表 流感監(jiān)測網(wǎng)絡實驗室的工作人員接到標本后，24小時內(nèi)將“流感/人禽流感監(jiān)測病例標本原始登記送檢表”（表2）錄入到“監(jiān)測信息系統(tǒng)”標本的處理 標本送至實驗室后，立即進行處理，未加抗菌素的加入適量的抗菌素。 將原始標本一分為三份，一份（1ml）用于MDCK細胞接種，一份（1ml）用于雞胚接種，一份（1ml）保存待復核。（根據(jù)檢測程序?qū)崟r調(diào)整）實驗室檢測核酸檢測病毒分離和鑒定：雞胚分離和細胞培養(yǎng)膠體金快

5、速檢測檢測流程臨床標本采集臨床標本采集接種接種MDCK細胞細胞接種雞胚接種雞胚紅細胞凝集抑制試驗，鑒定病毒紅細胞凝集抑制試驗，鑒定病毒紅細胞凝集試驗紅細胞凝集試驗寄送國家流感中心寄送國家流感中心流感病毒核酸檢測陽性流感病毒核酸檢測陽性核酸檢測核酸提取- QIAamp Viral RNA Mini Kit1）在1.5ml 離心管中加入AVL（病毒裂解液）560ul。2）取采樣液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培養(yǎng)物（雞胚尿囊液或細胞培養(yǎng)液）140ul加入上述離心管中（糞便標本用10懸液的上清），震蕩15s，室溫放置10min。3）稍離心后，加入560ul無水乙醇，震蕩15s。4）將Viral R

6、NA Mini spin柱子取出，將步驟3的混合液吸取630ul加入柱子中，8000rpm離心1min。棄離心液。5）重復步驟4。6）將吸附柱放入一新的2ml 套管中，加入500ul AW l液，8000 rpm離心1min。棄套管及其離心液。7）將吸附柱放入一新的2ml 套管中，加入500ul AW 2液，13000rpm離心3min，棄套管及其離心液。8）將吸附柱放入一新的1.5ml 離心管中，于柱中加入60ul的AVE液，室溫靜置13分鐘，8000rpm離心1min，收集離心液即為提取的病毒RNA，立即實驗或20以下保存。熒光定量PCR 第一次使用前引物稀釋1引物工作濃度（40M）配制方

7、法： （1）將新合成的引物開蓋前短暫離心（12000rpm，15s）。 （2）用RNase Free Water溶解，加水量為10總摩爾數(shù)總摩爾數(shù)，充分混勻，此時引物濃度為100M，可作為儲存液。（例如：假設合成引物每管2OD，若2OD的量為9.1 nmol ，加水量為109.191l） （3）將100M的引物2.5倍稀釋，此時濃度為40M，可作為工作濃度。2探針工作濃度（10/20M/）配制方法： （1）將新合成的探針管開蓋前短暫離心（12000rpm，15s）。 （2）用RNase Free Water溶解，加水量為10總摩爾數(shù)，充分混勻，此時引物濃度為100M，可作為儲存液。 （3）將1

8、00M的探針10/5倍稀釋，此時濃度為10/20M，可作為工作濃度。熒光定量PCR 引物和探針 稀釋好的冰凍的引物和探針進行融化（已融的探針避光2-8可保存多達3個月，不要對探針反復凍融）； 渦旋振蕩引物和探針； 瞬時離心引物和探針，之后置于冰架上。 real-time RT-PCR的試劑 QIAGEN公司 QuantiTect Probe RT-PCR Kit， Cat No. 204443 注意：在試驗過程中，保持所有的試劑在冰架上保持低溫。熒光定量PCR 反應體系和條件試劑：Invitrogen SuperScript III Platinum One-Step Quantitative

9、 Kit （公司： Invitrogen，貨號：11732-020或11745-100） 分子級無菌蒸餾水 (無RNA酶和DNA酶) 正反向引物 (40M) 雙重標記探針(10M)反應條件：逆轉(zhuǎn)錄50 30min95 2min （95 15s 55 30s*）45反應體系為25ul注：*在55 度這一步驟中要收集熒光信號（FAM）熒光PCR結(jié)果陽性樣品熒光PCR結(jié)果陰性樣品熒光PCR結(jié)果可疑樣品病毒分離-MDCK細胞3335培養(yǎng)接種流程清洗MDCK 細胞臨床采樣標本接種細胞Hanks液清洗細胞，一般清洗2遍3335度吸附12小時Hanks液清洗細胞加入病毒生長液，3335度培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時后

10、，觀察細胞病變。當細胞病變?yōu)?+或4+時，即75100%細胞出現(xiàn)病變時進行收獲，收獲之前將細胞凍融12次，以提高收獲標本的病毒滴度。即使無細胞病變也應該于第7天收獲 （細胞病變情況：細胞病變的特征是細胞腫脹圓化，細胞間隙增大，細胞核固縮或破裂，嚴重時細胞部分或全部脫落 ）根據(jù)使用的細胞瓶的大小，決定接種量，一般的小細胞瓶接種0.5ml的臨床標本流程圖MDCK細胞病毒分離lCPE出現(xiàn)時間與感染病毒的型別、毒株的差異、感染量的大小和MDCK細胞的敏感性有關l每日觀察細胞病變(CPE)l標本接種后7天還未出現(xiàn)CPE，維持液經(jīng)HA試驗陰性者，繼續(xù)盲傳12代后，HA試驗仍為陰性者，則MDCK細胞病毒分離

11、為陰性，標本可棄去 細胞病變圖雞胚病毒分離檢卵標本準備雞胚分離方法-試劑準備1) 91) 91111日齡雞胚日齡雞胚2) 2) 照蛋燈照蛋燈3) 70%3) 70%7575酒精酒精4) 1ml 4) 1ml 一次性注射器一次性注射器5) 5) 雞蛋開孔器雞蛋開孔器6) 6) 無菌膠布或蠟無菌膠布或蠟7) 10ml 7) 10ml 試管和試管架試管和試管架8) 10ml 8) 10ml 移液管或移液管或1ml1ml移液器及無菌吸尖移液器及無菌吸尖9) 9) 無菌鑷子無菌鑷子10) 10) 無菌眼科剪無菌眼科剪雞胚分離方法-標記雞胚 檢視標記雞胚 用照蛋燈檢視雞胚，判斷雞胚狀態(tài) 血管：活胚血管清晰

12、；死胚模糊，成淤血帶或淤血塊 胎動：活胚有明顯的自然運動，死胚無胎動 絨毛尿囊膜發(fā)育界限：密布血管的絨毛尿囊 膜與雞胚胎的另一面形成明顯的界限 標記出雞胚的氣室與尿囊的界限、胚胎頭部的位置 如果雞胚是死胚、沒有受精、有裂痕、發(fā)育不全、或表面有好多滲水孔，應棄掉 接種病毒方法接種病毒方法 單腔接種 盲種雙腔接種 燈下接種 開窗接種雞胚分離方法雞胚分離方法雞胚分離流程（1） 將標記好的雞胚的氣室朝上放置在蛋盤上，通常每個樣本接種3個雞胚 用70%75酒精消毒雞胚，在氣室端鉆孔，開10 x6mm窗口 用注射器吸200l處理過的臨床標本，裝上16 號針頭 從窗口中滴入無菌的液體石蠟，然后輕輕晃動雞胚，

13、讓液體石蠟在雞胚殼膜內(nèi)層鋪開，此時在照蛋燈下即 可清楚的看到雞胚胎的位置。將注射針頭刺入胚胎的 鄂下胸前，用針頭輕輕撥動下顎及腿，當進入羊膜腔時，能看到雞胚隨著針頭的撥動而動，即可注射100l標本。將針頭退出至 寸，將另外100 l標本 注入雞胚尿囊腔雞胚分離流程（2）用同一注射器和針頭將同一標本依上法接種另外的兩枚雞胚將針頭棄于合適的生物安全裝置中用消毒過的醫(yī)用膠布封口 3335oC 溫箱培養(yǎng)雞胚23 天。臨床采樣標本通常培養(yǎng)3天，病毒傳代通常培養(yǎng)2天 雞胚進行病毒分離培養(yǎng)時，每天檢查雞胚生長情況，24小時內(nèi)死亡的雞胚，認為是非特異死亡應棄去雞胚分離流程（3）收獲尿囊液和羊水收獲尿囊液和羊水

14、雞胚在收獲前應4過夜或至少放置4小時標記15ml 無菌塑料管與相應的雞胚編號一致用70%75酒精消毒雞胚頂部用無菌鑷子撕破雞胚氣室蛋殼，推開雞胚尿囊膜。用10ml 吸管吸取雞胚尿囊液置于相應的收集管中。用吸管刺破雞胚羊膜，盡量吸取羊水放置于另外的管中。羊水較少時也可以將3個雞胚的羊水合并雞胚病毒鑒定l 經(jīng)HA試驗陰性者，將羊水和尿囊液混合，繼續(xù)盲傳1代（72小時），如仍為陰性，則雞胚病毒分離為陰性，標本可棄去雞胚收獲HA試驗病毒鑒定 紅細胞凝集 紅細胞凝集抑制試驗病毒鑒定流程紅細胞凝集試驗4個凝集單位配制“回滴”紅細胞凝集抑制試驗判定流感病毒型別紅細胞凝集試驗（HA）l MDCK細胞或雞胚收獲

15、的標本分離物首先用雞、豚鼠或人紅細胞進行紅細胞凝集試驗（HA），確定病毒滴度l 原理：流感病毒顆粒表面的血凝素蛋白原理：流感病毒顆粒表面的血凝素蛋白（HA）含）含有能結(jié)合并識別紅細胞表面含唾液酸的糖蛋白或脂有能結(jié)合并識別紅細胞表面含唾液酸的糖蛋白或脂蛋白結(jié)構(gòu)，許多哺乳動物和禽的紅細胞表面均含有蛋白結(jié)構(gòu)，許多哺乳動物和禽的紅細胞表面均含有這兩種成分。因此流感病毒能與其結(jié)合并識別，產(chǎn)這兩種成分。因此流感病毒能與其結(jié)合并識別，產(chǎn)生凝集現(xiàn)象。當血清中有特異性抗體與病毒血凝素生凝集現(xiàn)象。當血清中有特異性抗體與病毒血凝素結(jié)合后，可以抑制凝集現(xiàn)象出現(xiàn)結(jié)合后，可以抑制凝集現(xiàn)象出現(xiàn)紅細胞紅細胞雞雞火雞火雞豚鼠豚

16、鼠人人 O 型 血 紅型 血 紅細胞細胞馬馬適用范圍流感和禽流感病毒流 感 和 禽流感病毒流感病毒流感病毒禽流感病毒終 濃 度（）0.5（1%）0.5（1%）0.75（1.5%）/0.5（1%）0.75（1.5%）/0.5（1%）0.5（1%）孔底部形狀U或V型U或V型U型U型U型孵育時間30min30min45min45min60min細胞對照細胞沉積成圓點狀，傾斜時細胞向下流成淚滴狀細 胞 沉 積成圓點狀，傾 斜 時 細胞 向 下 流成淚滴狀細胞沉積成環(huán)狀細胞沉積成環(huán)狀細胞沉積成環(huán)狀AHBCDEFG100ul病毒液50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50

17、ul50ul50ul稀釋完病毒液后加入稀釋完病毒液后加入50ul紅細胞懸液紅細胞懸液50ulPBS稀釋病毒加入配制好的紅細胞懸液充分混勻，置室溫孵育30-60分鐘觀察記錄結(jié)果病病毒毒原原液液1：21：128HA： 32HA128 HA： 4紅細胞凝集試驗（HA）lHA滴度8，進行紅細胞凝集抑制（HI）試驗；HA滴度8者，繼續(xù)在敏感的MDCK細胞系或雞胚上進行傳代培養(yǎng)，使其HA滴度8后，再進行HI測定l若傳12代后，HA滴度仍8者，可應用核酸檢測方法進行鑒定紅細胞凝集抑制（HI）試驗 HA試驗完成后，用國家流感中心每年提供的抗A（H1N1）、抗A（H3N2）、抗B（Victoria系）和抗B（Y

18、amagata系）4種標準參照血清，進行紅細胞凝集抑制（HI）試驗，確定病毒的型別和亞型，進行HI試驗時，需同時進行4種標準抗原對照。紅細胞凝集抑制試驗步驟 4個凝集單位的配制和檢測 稀釋血清 加入25ul 4個血凝單位抗原，室溫孵育15-30分鐘 每孔加入50ul紅細胞懸液，充分搖勻。室溫孵育30-60分鐘 觀察記錄結(jié)果4個凝集單位的配制和檢測 4個凝集單位的配制 讀取紅細胞凝集試驗的結(jié)果 計算所須的4個凝集單位的病毒用量 用50ul檢測4個凝集單位時，用凝集效價除以8，所得商即為4個單位的稀釋度 用紅細胞凝集試驗“回滴”，復核4個凝集單位 用50ul，前4孔完全凝集 。此時的抗原即為4個凝

19、集單位紅細胞凝集抑制試驗稀釋血清紅細胞凝集抑制試驗稀釋血清12765349810H1血清50ulH3血清50ul50ulPBSB血清50ul25ulPBS25ul25ul25ul25ul25ul25ul25ul25ulB血清50ulH3血清50ulH1血清50ul流感病毒的型別判定 標準參照血清對待鑒定病毒的抑制效價20才可以算為陽性 一個待鑒定病毒不能同時被兩種或兩種以上的標準血清抑制 待鑒定病毒與標準參照血清有交叉抑制，但與一種標準參照血清抑制效價大于其他參照血清4倍以上時，可以判定為此型別的流感病毒紅細胞凝集抑制試驗-質(zhì)量控制 使用的試劑可靠無誤 處理后的血清有無殘余非特異性凝集素 讀取HA試驗的結(jié)果是否正確 4個血凝單位是否準確 紅細胞陰性對照 待鑒定病毒確保沒有被細菌污染 稀釋血清、病毒、紅細胞懸液加入量準確結(jié)果錄入 流感監(jiān)測網(wǎng)絡實驗室的工作人員在完成病毒分離后，24小時內(nèi)將病毒分離結(jié)果錄入“監(jiān)測信息系統(tǒng)”中的“病毒分離、鑒定結(jié)果登記一覽表” 中 。毒株的送檢 系統(tǒng)自動生產(chǎn)的送檢單，省里和國家均送檢 時限要求 包裝要求省級參比中心開始啟動9個（30%）