單寧酸-氯化鐵法對SHR血管密度的觀察

1、單寧酸-氯化鐵法對SHR血管密度的觀察                        【摘要】 目的 探討高血壓病時多器官微血管密度的變化，以及它與高血壓的因果關系。方法 用單寧酸-氯化鐵組織化學方法媒染成年（12月）及幼年（4周）SHR、WKY 4組大鼠腦、腎、骨骼肌毛細血管，并對血管密度進行定量分析。結果 與成年組WKY相比，成年組SHR腦、腎、骨骼肌微

2、血管密度均有所減低（P<0.01）；血壓尚未升高的幼年組SHR與幼年組WKY相比，腎皮質(zhì)毛細血管密度有所減低（P<0.01）。結論 成年SHR存在微血管稀少的現(xiàn)象是高血壓的結果；幼年SHR腎皮質(zhì)微血管減少可能是高血壓病的一個早期征象，同時推測微血管減少也可能是高血壓病的原因之一?！娟P鍵詞】 高血壓病 微血管稀少 自發(fā)性高血壓大鼠 單寧酸 氯化鐵【Abstract】 Objective: To investigate the change of micro-vascular density of SHR, and its relationship with hypertension.

3、 Methods：Tannic acid-ferric chloride was applied to micro-vascular in brains, kidneys and skeletal muscles respectively from two experimental groups of adult (12m) and young (4w) SHR and two control groups of adult and young WKY with normal blood pressure, and then the image analysis system was used

4、 to analyzed the capillary densities quantitatively.Results：The data showed that the micro vascular densities of the adult SHR group were less than that of adult WKY group（P<0.01）. So was the young SHR group with their micro-vascular densities of the renal cortex（P<0.01）.Conclusion：The rarefac

5、tion in the number of micro vascular of the adult SHR may result from hypertension and that in the renal cortex of the young SHR is a sign of the early stage hypertension and it may be one of the reasons of hypertension.【Key words】Hypertension Micro vascular Rarefaction SHR Tannic Acid Ferric Chlori

6、de 目前對高血壓病血管病變的研究主要集中在對“重構”、功能改變及其機理的研究上，也有少數(shù)研究發(fā)現(xiàn)高血壓時血管的數(shù)量也會發(fā)生改變，即微血管減（?。┥?。但是否高血壓時各器官普遍存在微血管變少，以及它與高血壓病發(fā)生的先后（因果）關系，仍研究不夠。而且研究方法主要局限在傳統(tǒng)的墨汁灌注法。本實驗采用單寧酸-氯化鐵組織化學方法媒染血管2和圖像分析技術對不同齡高血壓大鼠和正常血壓對照組大鼠腦、腎、骨骼肌微血管的密度進行定量分析，以進一步明確高血壓狀態(tài)時微血管密度的變化，以及它與高血壓發(fā)生發(fā)展的因果關系。 1 材料和方法 1.1實驗動物 選用自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertens

7、ive rats，SHR)和正常血壓的東京Wistar大鼠（Wistar-Kyoto,WKY）4周齡和12月齡各10只。上述動物均購自協(xié)和醫(yī)科大學實驗動物研究所，動物飼養(yǎng)級別為一級。 1.2 血壓測量 全部大鼠均采用尾部光電測壓法測量收縮期血壓（systolic blood pressure，SBP）,測量時間固定于每日上午8點12點，連續(xù)測量3d，取其平均值。 1.3單寧酸工作液血管灌注-氯化鐵呈色 以上4組大鼠，經(jīng)0.4%戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，置于恒溫電熱板上剖胸，暴露心臟。從左心室插入灌注針至升主動脈，并剪開右心耳。由主動脈快速注入熱（3742）0.9%NaCl溶液200 ml沖凈血管，

8、再緩慢灌注1%單寧酸工作液（含2%戊二醛）200 ml。灌流1h后分別取腦、腎、腓腸肌做連續(xù)冰凍切片，片厚20m，隔5張取1張。切片經(jīng)雙蒸水漂洗2次，入2%FeCl3溶液于室溫下呈色20min，再經(jīng)雙蒸水漂洗3次，終止反應。常規(guī)脫水、透明、封片。 1.4圖像分析 用HMIAS-2000數(shù)碼顯微鏡計算機圖像分析系統(tǒng)對毛細血管密度進行定量分析。每只大鼠每個器官選取5張切片，每張切片隨機選取3個視野，在10×20放大倍數(shù)視野下,將全部顯影的毛細血管進行圖像攝取,用全自動分割方法，測得每個視野內(nèi)全部微血管面積,再除以視場面積即得到微血管的密度：（血管的面積/視場面積）×100%；每

9、張腎臟切片再選5個淺表腎單位的腎小球用手動測量方法測量其面積。                              1.5統(tǒng)計學處理 所得測量數(shù)據(jù)應用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，各種數(shù)據(jù)比較采用t檢驗。 2 結果 2.1血壓 4周齡組SHR大鼠的血壓同WKY成年組及幼年組相比差異無顯著性，表明該高血壓大

10、鼠在4周齡前尚無血壓升高；12月齡的SHR大鼠血壓較同齡WKY組相比差異具有顯著性。文獻報道SHR血壓一般從第58周開始升高。 2.2血管密度 經(jīng)單寧酸-氯化鐵組織化學染色后, 可見各組切片中的毛細血管均呈黑色網(wǎng)狀，輪廓清晰，分布及顯色均勻，用圖像分析系統(tǒng)統(tǒng)計分析血管密度結果如下。 3 討論 單寧酸-氯化鐵媒染血管可完整地顯示出各級血管的形貌。單寧酸分子小，溶解性好，經(jīng)過過濾后不易堵塞小血管，可灌注到全部毛細血管，且不改變血管原有的形態(tài)，顯色清楚，與背景對比良好，是研究微血管構筑的理想方法。 高血壓在進程過程中主要損害的靶器官有心、腦、腎。本實驗研究了成年及幼年SHR和正常血壓對照組WKY大鼠

11、腦、腎、骨骼肌的毛細血管密度。骨骼肌并非高血壓主要損害的靶器官,但作為全身較大的、血管較豐富的器官對其血管密度的觀察也可反應全身各器官在高血壓時的變化情況。本實驗結果表明：成年SHR大鼠確定普遍存在以上器官的微血管稀少的現(xiàn)象。Hutchins等1于1974年首次發(fā)現(xiàn)微血管稀少是高血壓病的重要特征，對高血壓的發(fā)生、發(fā)展有重要影響。許多研究用墨汁灌注、熒光造影、免疫組化等方法發(fā)現(xiàn)成年高血壓大鼠存在部分器官微動脈稀少的現(xiàn)象3-6。本實驗首次用單寧酸氯化鐵顯色法和計算機圖像分析技術，較客觀準確地進一步驗證了先前對人及動物個別器官的觀察。導致微血管稀少的根本原因目前尚不完全清楚，推測可能是由壓力因素所致

12、。高血壓時血管重塑和血管功能的異常，會導致血管管腔變窄，微循環(huán)灌流量下降，一方面部分毛細血管發(fā)生功能性關閉；另一方面持續(xù)的微循環(huán)灌流量下降，局部缺血缺氧，將引起微血管變性萎縮直至閉鎖消失。因此微血管稀少可分功能性微血管稀少和器質(zhì)性微血管稀少兩個階段。功能性微血管稀少是由于血管收縮導致的無灌注狀態(tài)，此時的微血管稀少是可逆的。器質(zhì)性微血管稀少即微血管數(shù)目在解剖學上的減少，是不可逆性的7。功能性微血管稀少發(fā)展為器質(zhì)性微血管稀少被認為是高血壓導致靶器官結構損害的第一步?？梢源_定一定程度一定時間的血壓升高會導致部分器官的微血管數(shù)量的減少8，微血管稀少是血壓升高所致，但同時本實驗結果亦顯示，在幼年SHR高

13、血壓尚未形成前腎皮質(zhì)已出現(xiàn)微血管減少和腎小球面積減少的現(xiàn)象。推測此時的微血管減少為功能性減少，但會導致腎血流量下降。有實驗報道腎血流的下降在高血壓時期、甚至在高血壓前期即已出現(xiàn)9，此結果與本實驗結果一致。還有實驗表明高血壓父母所生的子女，盡管血壓正常，但已出現(xiàn)腎血流下降，濾過分數(shù)上升，高度提示腎臟低灌注是原發(fā)性高血壓早期的征象，甚至可能是高血壓發(fā)生發(fā)展的必備前提10。由此推測，微血管稀少既可能是高血壓病的結果，也可能是高血壓形成的原因之一。微血管稀少在幼年SHR腎臟分布的這種區(qū)域性與腎小球前小動脈的收縮，阻力增高有密切關系。此種微血管稀少有可能是遺傳因素引起的，但在遺傳性高血壓大鼠或高血壓病人

14、體內(nèi)是否存在微血管稀少的有關基因還不得而知；另外一個原因是腎臟對RAS及交感神經(jīng)存在著明顯的高敏感狀態(tài)11，因此對于血壓升高及微血管結構、數(shù)量的變化也較為敏感12。其它器官在高血壓早期并未出現(xiàn)明顯的微血管數(shù)量的變化，推測與其對血壓變化的敏感程度有關。這對于高血壓及其并發(fā)癥的防治有重要意義，也對研究高血壓時身體重要器官的保護指出了新的方向13。 參 考 文 獻1Hutchins PM,Darnell AE.Observation of decreased number of small arterioles in spontaneously hypertension ratsJ. Circ Re

15、s, 1974, 34/35(suppl I): 161-166.                             2孔祥玉,趙淑敏.一種媒染血管的新方法單寧酸-氯化鐵J.解剖學雜志,2001,24(1):91-92.3吳強.自發(fā)性高血壓大鼠的微血管改變及其與血管內(nèi)皮細胞損傷的關系J.中國微循環(huán),1998,2(

16、3):154-156.4張富洪，黃如訓，蘇鎮(zhèn)培.腎血管性高血壓大鼠腦微血管形態(tài)學的觀察J.中風與神經(jīng)疾病雜志,1997,14(1)33-34.5Struyker Boudier HA,Le Noble JL,Slaaf DW,et al.Microcirculatory changes in cremaster muscle during early spontaneous hypertension in the ratJ. Hypertension suppl, 1988, 6(4):S185-187.6江時森,顧小平,李輝.自發(fā)性高血壓大鼠多器官微血管稀少動態(tài)觀察J.微循環(huán)技術雜志,199

17、6,4（2）：73-75.7Prewitt R L. Autoregulation of blood flow, endothelial nitric oxide synthase and microvascular rarefaction J. Hypertension, 2002, 20(2): 177-178.8Acker T,Beck H,Plate K H ,et al.Cell type specific expression of vascular endothelial growth factor and angiopoietin-1 and -2 suggests an im

18、portant role of astrocytes in cerebellar vascularization. Mech Dev, 2001, 108(1-2): 45-57.9Hebert LE,Kusek JW,Green T,et al.Effects of blood pressure control on progressive renal disease in blacks and whitesJ.Hypertension,1998,30(suppl I):428-435.10Rieder MJ,Roman RJ, Greene AS .Reversal of microvascular rarefaction and reduced renal mass hypertensionJ. Hypertension, 1997, 30(1 Pt 1): 120-127.11Rodins Karl, Cheale Michelle,Coleman Nicholas,et al .Minichromosome