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1、內(nèi)內(nèi) 容容 ELISA的概念 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的反應(yīng)原理及操作中注意事項(xiàng) 常見(jiàn)問(wèn)題原因分析及解決 結(jié)果的報(bào)告解釋第1頁(yè)/共48頁(yè)ELISA的概念的概念 ELISA屬于標(biāo)記免疫學(xué)技術(shù)的一種，1971年由荷蘭和瑞典的學(xué)者提出，操作過(guò)程簡(jiǎn)單易行并可以定量，從而使其在免疫學(xué)檢測(cè)中得到了廣泛的應(yīng)用。 ELISA是一種免疫測(cè)定（immunoassay，IA） 。基礎(chǔ):抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進(jìn)行定性或定量分析。第2頁(yè)/共48頁(yè)抗原抗體反應(yīng) 可逆性 抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過(guò)程是一種動(dòng)態(tài)平衡，其

2、反應(yīng)式為：Ag+AbAgAb 抗體的親和力（affinity），可以用平衡常數(shù)K表示：K=AgAbAgAb ,AgAb的解離程度與K值有關(guān)。高親和力抗體的抗原結(jié)合點(diǎn)與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固，不易解離。解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性。第3頁(yè)/共48頁(yè)特異性 抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點(diǎn)之間?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型互補(bǔ)關(guān)系，具有高度的特異性。 測(cè)定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。第4頁(yè)/共48頁(yè)最適比例 第5頁(yè)/共48頁(yè)敏感性化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml水平酶反應(yīng)測(cè)定法的敏感度約為5-10g/ml免疫測(cè)定中凝膠擴(kuò)散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)

3、法相仿標(biāo)記的免疫敏感度可提高數(shù)千倍，達(dá)ng/ml水平例如，HBsAg，其敏感度可達(dá)0.1ng/ml。第6頁(yè)/共48頁(yè)常見(jiàn)問(wèn)題常見(jiàn)問(wèn)題ELISA技術(shù)掌握不好-較大的技術(shù)難題 白 板 花 板 灰 區(qū) 假 陰 性 假 陽(yáng) 性第7頁(yè)/共48頁(yè)第8頁(yè)/共48頁(yè)白白 板板第9頁(yè)/共48頁(yè)花花 板板第10頁(yè)/共48頁(yè)均均 板板第11頁(yè)/共48頁(yè)灰灰 區(qū)區(qū)第12頁(yè)/共48頁(yè)競(jìng)爭(zhēng)法競(jìng)爭(zhēng)法第13頁(yè)/共48頁(yè)ELISAELISA檢驗(yàn)方法相關(guān)項(xiàng)目檢驗(yàn)方法相關(guān)項(xiàng)目 乙肝抗原、抗體 丙肝抗體 梅毒抗體 艾滋抗體-第14頁(yè)/共48頁(yè)ELISA ELISA 常見(jiàn)類型常見(jiàn)類型1.雙抗體夾心法（用于測(cè)抗原）HBsAg2.間接法（

4、用于測(cè)抗體） HBsAb3.競(jìng)爭(zhēng)法（用于測(cè)小分子抗原/半抗原和抗體）HBeAb4.捕獲法（用于測(cè)血清中某抗體的亞型）特異IgG第15頁(yè)/共48頁(yè)第16頁(yè)/共48頁(yè)第17頁(yè)/共48頁(yè) 鉤狀效應(yīng) 強(qiáng)陽(yáng)性-假陰性方法：稀釋后再測(cè)特點(diǎn)：不易發(fā)現(xiàn)避免：結(jié)果回顧、診斷提示、臨床溝通第18頁(yè)/共48頁(yè)第19頁(yè)/共48頁(yè)間接法的影響因素間接法的影響因素第20頁(yè)/共48頁(yè)正常血清中所含的高濃度的非特異性抗體對(duì)間接法的影正常血清中所含的高濃度的非特異性抗體對(duì)間接法的影響響 假陽(yáng)性 鑒別 結(jié)果回顧、診斷提示、臨床溝通 復(fù)檢 必要時(shí)另一試劑盒復(fù)檢第21頁(yè)/共48頁(yè)小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)第22

5、頁(yè)/共48頁(yè)抗原的固相化既可以直接進(jìn)行，亦可以通過(guò)相應(yīng)特異抗體而間接固相化第23頁(yè)/共48頁(yè)酶及底物酶及底物酶酶 底底 物物顯色反應(yīng)顯色反應(yīng) 測(cè)定波測(cè)定波長(zhǎng)長(zhǎng) 辣根過(guò)氧化物酶辣根過(guò)氧化物酶 鄰苯二胺鄰苯二胺四甲替聯(lián)苯胺四甲替聯(lián)苯胺氨基水楊酸氨基水楊酸鄰聯(lián)苯甲胺鄰聯(lián)苯甲胺2,2-2,2-連胺基連胺基-2(3-2(3-乙基乙基- -并并噻唑啉磺酸噻唑啉磺酸-6)-6)銨鹽銨鹽 橘紅色橘紅色黃色黃色棕色棕色蘭色蘭色藍(lán)綠色藍(lán)綠色492492450450449449425425642642堿性磷酸酯酶堿性磷酸酯酶 4-4-硝基酚磷酸鹽硝基酚磷酸鹽(PNP)(PNP)萘酚萘酚-AS-Mx-AS-Mx磷酸鹽

6、磷酸鹽+ +重氮鹽重氮鹽 黃色黃色紅色紅色 400400500 500 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖+ +甲硫酚嗪甲硫酚嗪+ +噻唑蘭噻唑蘭 黃色黃色深藍(lán)色深藍(lán)色 405405420 420 -半乳糖苷半乳糖苷酶酶 甲基傘酮基半乳糖苷甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)(4MuG)硝基酚半乳糖苷硝基酚半乳糖苷(ONPG) (ONPG) 熒光熒光黃色黃色 360,450360,450420420 第24頁(yè)/共48頁(yè)對(duì)照設(shè)定 u 陽(yáng)性對(duì)照品 陽(yáng)性對(duì)照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測(cè)標(biāo)本的組成相一致，多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)。u 陰性對(duì)照品 陰性對(duì)照

7、品須先行檢測(cè)確定不含待測(cè)物質(zhì)。第25頁(yè)/共48頁(yè)ELISAELISA操作中的注意事項(xiàng)操作中的注意事項(xiàng)標(biāo)本采集、保存試劑準(zhǔn)備加樣溫育洗板顯色比色結(jié)果判斷第26頁(yè)/共48頁(yè) 溶血標(biāo)本及混有紅細(xì)胞的血清易產(chǎn)生假陽(yáng)性,因溶血血清中含有過(guò)氧化酶,造成假陽(yáng)性 受細(xì)菌污染因菌體中可能含有內(nèi)源性辣根過(guò)氧化物酶,造成假陽(yáng)性 在冰箱中保存過(guò)久的標(biāo)本，在間接法ELISA測(cè)定中會(huì)導(dǎo)致本底過(guò)深,造成假陽(yáng)性 EDTA、酶抑制劑(如NaN3)可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過(guò)氧化物酶活性,造成假陰性 標(biāo)本凝固不全,形成肉眼可見(jiàn)的纖維蛋白塊，易造成假陽(yáng)性結(jié)果 標(biāo)本中有內(nèi)源性干擾物, 不同程度影響檢測(cè)結(jié)果。常見(jiàn)的干擾物質(zhì)有：類風(fēng)濕因

8、子、補(bǔ)體、交叉反應(yīng)物質(zhì)和其他物質(zhì)等標(biāo)本采集、保存第27頁(yè)/共48頁(yè)試劑的準(zhǔn)備試劑的準(zhǔn)備 選擇高質(zhì)量的試劑是保證結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵 室溫平衡 所用蒸餾水或去離子水應(yīng)保證質(zhì)量試劑準(zhǔn)備第28頁(yè)/共48頁(yè) 加加 樣樣 應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部。每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸頭。震蕩充分混勻。從滴瓶中滴加試劑，要注意滴加角度和滴加速度。避免標(biāo)本“交叉污染”問(wèn)題。 加樣第29頁(yè)/共48頁(yè) 溫育常采用的溫度有43、37、室溫和4（冰箱溫度）。 37是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。 溫育時(shí)間足夠。 保溫的方式一般采用水浴或電熱塊。 溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。保 溫第30頁(yè)/共48

9、頁(yè)洗洗 板板分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物洗板的方式：自動(dòng)洗板儀；手工操作有浸泡式和流水沖洗式傾倒液體的方式 甩干孔內(nèi)液體：應(yīng)注意交叉污染和個(gè)人防護(hù) 吸干孔內(nèi)液體：吸干應(yīng)徹底，可用水泵或真空 泵抽吸（推薦） 如本底較高，可增加洗滌次數(shù)或延長(zhǎng)浸泡時(shí)間。第31頁(yè)/共48頁(yè)顯色顯色顯色是ELISA中的最后一步溫育反應(yīng)，此時(shí)酶催化無(wú)色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時(shí)間是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可保持無(wú)色，而陽(yáng)性孔則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈色加強(qiáng)。OPD底物顯色一般在37反應(yīng)20-30分鐘。TMB約40分鐘顯色達(dá)頂峰。第32頁(yè)/共48頁(yè) 比比 色色 p 加酸終止顯色反應(yīng)后，比色測(cè)定前應(yīng)振蕩混勻。p

10、正確選擇波長(zhǎng)和參比波長(zhǎng)。p 酶標(biāo)儀使用前先預(yù)熱儀器15-30分鐘，測(cè)讀結(jié)果更穩(wěn)定。第33頁(yè)/共48頁(yè)結(jié)果判定定性測(cè)定的結(jié)果判斷是對(duì)受檢標(biāo)本中是否含有待測(cè)抗原或抗體作出“有”或“無(wú)”的簡(jiǎn)單回答，分別用“陽(yáng)性”、“陰性”表示?！瓣?yáng)性”表示該標(biāo)本在該測(cè)定系統(tǒng)中有反應(yīng)?！瓣幮浴眲t為無(wú)反應(yīng)。定性測(cè)定結(jié)果確定的依據(jù)在于陽(yáng)性陰性判定值（Cut-off）的建立。在實(shí)驗(yàn)條件（包括試劑）較難保證恒定的情況下，這種判斷法較為合適。在得出標(biāo)本（S）和陰性對(duì)照（N）的A值后，計(jì)算S/N值。第34頁(yè)/共48頁(yè) 定量測(cè)定的結(jié)果判定是每批測(cè)試均須用一系列不同濃度的參考標(biāo)準(zhǔn)品在相同的條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)本的吸光度值不同來(lái)

11、確定待測(cè)物的濃度。 在間接法和夾心法ELISA中，陽(yáng)性孔呈色深于陰性孔。在競(jìng)爭(zhēng)法ELISA中則相反，陰性孔呈色深于陽(yáng)性孔。第35頁(yè)/共48頁(yè)灰區(qū)概念 把定量分析的正常值范圍引入定性分析建立灰區(qū)概念，即將CO值上下的一段區(qū)域定為陽(yáng)性可疑，需重復(fù)實(shí)驗(yàn)或換試劑重測(cè)以確定其陰陽(yáng)性，如仍落在灰區(qū)范圍內(nèi)則報(bào)告+（陽(yáng)性）。第36頁(yè)/共48頁(yè) 酶標(biāo)儀是垂直光路測(cè)定吸光度。垂直光的特點(diǎn)是樣本吸光度受液體濃縮或稀釋的影響小，不足之處是易受被測(cè)樣本液面是否水平，酶標(biāo)板透光性孔底是否平整等的影響較大。 酶標(biāo)儀在用單波長(zhǎng)測(cè)定吸光度時(shí)，受到測(cè)定干擾（樣本的濁度、干擾色等）、電路干擾（包括噪音、漂移、電壓等）和液體表面張力

12、的影響也很大。酶標(biāo)儀單、雙波長(zhǎng)檢測(cè)的比較酶標(biāo)儀單、雙波長(zhǎng)檢測(cè)的比較 第37頁(yè)/共48頁(yè) 雙波長(zhǎng)的測(cè)定時(shí)采用兩個(gè)不同波長(zhǎng)(測(cè)定波長(zhǎng)450和參比波長(zhǎng)630)同時(shí)測(cè)定一個(gè)樣品的吸光度，它們的差值是樣品相對(duì)準(zhǔn)確的吸光度，這樣就會(huì)減少了測(cè)定干擾和電路干擾。 雙波長(zhǎng)差吸光度法具有可以克服一些外界環(huán)境的影響共存組分吸收譜疊加的干擾，以及減少比色的光學(xué)不均一性等特點(diǎn)，吸光度在一定的范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。 雙波長(zhǎng)測(cè)定明顯比單波長(zhǎng)更適合于生物活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)，其可以提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析的準(zhǔn)確度，減少實(shí)驗(yàn)誤差。第38頁(yè)/共48頁(yè)結(jié)果的解釋結(jié)果的解釋乙肝五項(xiàng)的結(jié)果解釋 1,3,5或1,3 大三陽(yáng) 1,4,5或1,5 小三陽(yáng)

13、 全陰或Sb陽(yáng)性 除此之外一律復(fù)查第39頁(yè)/共48頁(yè) 丙肝抗體ELISA檢測(cè)試劑現(xiàn)已發(fā)展至第三代試劑，第三代試劑的靈敏度和特異性比前兩代試劑都高。第一代試劑利用來(lái)自HCV病毒基因組中的部分NS3和NS4區(qū)重組表達(dá)抗原（C100）作為固相包被進(jìn)行檢測(cè)；第二代試劑利用來(lái)自HCV基因組NS3區(qū)的C33C和部分NS4區(qū)的融合表達(dá)抗原（C200）、再加上C區(qū)的核心抗原C22-3作為固相包被進(jìn)行檢測(cè)；第三代試劑在第二代抗原的基礎(chǔ)上，又加入了來(lái)自NS5區(qū)的重組表達(dá)抗原，另外，部分公司的產(chǎn)品中又引進(jìn)了合成肽抗原。第40頁(yè)/共48頁(yè) 初篩用的HIV ELISA試劑目前已經(jīng)發(fā)展到第四代檢測(cè)試劑。第一代試劑主要以病

14、毒裂解物或部分純化的病毒抗原包被反應(yīng)板，以檢測(cè)血清中的抗體。由于包被的抗原不很純,假陽(yáng)性率較高。第二代試劑使用基因工程方法得到的重組抗原和合成肽包被反應(yīng)板，由于純化抗原的使用，特異性有了很大提高。第三代試劑使用雙抗原夾心法檢測(cè)抗體，進(jìn)一步提高了敏感性。第四代試劑則在第三代的基礎(chǔ)上進(jìn)一步增加了P24抗原的檢測(cè)，把HIV抗原和抗P24的抗體同時(shí)包被反應(yīng)板，可同時(shí)檢測(cè)血清中的HIV抗體和P24抗原。第41頁(yè)/共48頁(yè) 梅毒螺旋體感染的免疫測(cè)定 非特異性實(shí)驗(yàn)（類脂質(zhì)抗原血清學(xué)實(shí)驗(yàn)） 梅毒螺旋體在破壞機(jī)體組織的過(guò)程中，體內(nèi)釋 放出一種心磷脂抗原，這種抗原可刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體即反應(yīng)素，其與牛心中提取的

15、心磷脂在體外可產(chǎn)生免疫結(jié)合反應(yīng)。此類試驗(yàn)包括 VDRL ,USR(顯微鏡觀察) RPR,TRUST(肉眼觀察) RPR主要用于治療效果的監(jiān)測(cè)。 第42頁(yè)/共48頁(yè) 特異性試驗(yàn) 梅毒螺旋體抗體檢測(cè)主要包括 熒光密螺旋體抗體吸收試驗(yàn)FTA-ABS、 梅毒螺旋體血凝試驗(yàn)TPHA、 梅毒螺旋體明膠凝集試驗(yàn)TPPA和ELISA。 臨床中常用的有TPPA試驗(yàn)和ELISA法。第43頁(yè)/共48頁(yè) TPPA結(jié)果的判定方法 反應(yīng)圖像判定粒子成紐扣狀凝集，呈現(xiàn)出外周邊緣均勻且光滑的圓形（-） 粒子形成小環(huán)狀，呈現(xiàn)出外周邊緣均勻且平滑的圓形（） 粒子環(huán)明顯變大，其外周邊緣不均勻且雜亂地聚集在周?chē)?） 產(chǎn)生均一的凝集，凝集粒子在底部整體上呈膜狀延展（+） 第44頁(yè)/共48頁(yè)HIV和和