建庫測序流程表

1、一、血漿分離、游離DNA抽提區(qū)步驟操作內(nèi)容備注試劑區(qū)1.DNA 提取試劑配制口蛋白酶K+磁珠：提前30分鐘恢復到室溫。配制裂解液：裂解液（20ml）瓶中加入14ml異丙醇，顛倒混勻，室溫存放。要充分混勻配制清洗液清洗液1:用前加入25ml無水乙醇， 顛倒混勻， 室溫存放。清洗液2:用前加入64ml無水乙醇， 顛倒混勻， 室溫存放。2.蛋白酶K和磁珠的分裝口1.2ml淺孔板，排槍加：105混勻蛋白酶K145混勻磁珠先加入蛋白酶K,后加入磁珠，加磁珠時要注意混勻。樣本 制備區(qū)11.m口移液器、離心機、生物安全柜，試驗臺的消毒，75%酒精噴灑、擦拭。2.低速低溫分離血漿口4C,1600g離心10分鐘

2、， 安全柜內(nèi)分離血漿，每個樣本分離出5管：3x1.6ml血漿管（其中2管用于儲存），1.6ml白細胞層儲存管（混勻分裝2X0.8ml）,3.高速低溫分離血漿口1.6ml血漿實驗管，4C,16000g離心10分鐘，由后向前依次轉(zhuǎn)入對應(yīng)的樣本號管內(nèi)（每管1.6mL）,-80C保存血漿和血細胞管。4.加血漿口1.2ml淺孔板對應(yīng)孔內(nèi)各加入2005高速離心分離的血漿上清。質(zhì)控：陽性、陰性、空白、已檢陽性。5.加裂解液并混勻排槍加裂解液280n/孔（2X140田,每3分鐘混勻一次（吹打15次），混勻次數(shù)3次。共15分鐘，注意實驗室溫度的影響。6.磁力分離口置于磁力架上5分鐘至澄清，棄上清7.清洗口7.1

3、清洗1:用排槍加入320PL（2X160pL）清洗液1,吹打6次，置磁力架30s至澄清，棄上清。7.2清洗2：使用清洗液2,操作流程同7.1。7.3清洗3:重復7.2.清洗3結(jié)束后要充分棄除殘液并室溫晾干 （使用手電筒觀察磁珠表面尢反光現(xiàn)象即為晾干）。博昊有天醫(yī)學檢驗實驗室文件編號：BHYT-4-107/03版本/修訂號：A/0主題內(nèi)容游離DNA文庫制備及測序流程記錄表生效日期：20190918第 1 頁共 8 頁主題內(nèi)容游離DNA文庫制備及測序流程記錄表8.洗脫獲得核酸溶液口下磁力架，加425洗脫液，吹打6次，室溫5分鐘，上磁力架至澄清。若直接進行建庫則將40ML上清直接轉(zhuǎn)入裝有末端修復的P

4、CR板或八連排；若就此停止則轉(zhuǎn)入PCR板或八連排備用。配制陰/陽對照：按1.51原樣+38.5L純水封板，可暫行葉-20C二、末端修復區(qū)步驟操作內(nèi)容備注試劑區(qū)1.試劑解凍口試劑盒內(nèi)試劑室溫融化，混勻瞬離酶，放冰盒待用。其它組分室溫解凍，震蕩混勾離心，冰上待用。2.在冰上配制并分裝， 端修復反應(yīng)混合液口配制人份用量（1.5mlEP 管，多配 10%人份富余量）：ERATBufferMix 科 lERATEnzymeMix6MIX 墊手混勻并分裝至 PCR 板/八連排中備用。每人份用量 10ul:ERATBufferMix：9.4 科ERATEnzymeMix0.6 科|羊&ki1.加樣本口將提好

5、的 DNA 與配置好的陰/陽對照轉(zhuǎn)入裝有 105 末端修復 MIX的 PCR 板或八連排中并吹打混勻， 確認液聞尢異常后封膜離心，進行末端修復。反應(yīng)體系：505。2.設(shè)置修復條件熱蓋 70C,37C(10min)-65c(15min)一 4c(Hold)3.末端修復反應(yīng)結(jié)束瞬離，收集反應(yīng)液至管底。末端修復產(chǎn)物可以放在-20c 過夜，但產(chǎn)量會下降 20%三、接頭連接區(qū)步驟操作內(nèi)容備注試劑區(qū)“冰上配制接頭連接反應(yīng)混合液口配制_人份用量（1.5mlEP 管，多配 10 私份富余量）：LigationBufferMixpLLigationEnzymepLMIX槍混或墊手混勻。每人份用量：連接緩沖液 M

6、ix245連接 Enzyme1（iL樣本 制備區(qū)11.加接頭口在 DNAC 端修復好的 PCR 板或八連排（505）中力口入 5 對應(yīng)的 AdaptersMix（Barcode0148）2.加接頭連接混合液加入 255 配制好的接頭連接反應(yīng)混合液。吹打混勻，確認液面無異常后封膜離心。反應(yīng)體系 80 口含 PEG 粘稠，需緩慢吸取。3.設(shè)置連接條件口熱蓋 OFF,23C(20min)4c(Hold)4.接頭連接反應(yīng)結(jié)束口瞬時離心（八連排可用掌上離心機）。連接產(chǎn)物可以放-20C過夜，但產(chǎn)量會下降。博昊有天醫(yī)學檢驗實驗室文件編號：BHYT-4-107/03版本/修訂號：A/0主題內(nèi)容游離DNA文庫制

7、備及測序流程記錄表生效日期：20190918第 2 頁共 8 頁主題內(nèi)容游離DNA文庫制備及測序流程記錄表區(qū)步驟%連接產(chǎn)物純化與PCR擴增體系建立操作內(nèi)容備注試 劑區(qū)純化試劑準備口提前 30min 取出純化珠于室溫，并裝 40(/孔于1.2mL淺孔板中備用。在冰上配 PCR 反應(yīng)混合液口配制人份用量：PCREnzymeMix：pLPCRPrimerMix:LMIX槍混并分裝至PCR板或八連排中。母人份用里 29pL:PCREnzymeMix255PCRPrimerMix4L.樣本制備區(qū)11.磁珠純化將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入裝有 40 人磁珠的1.2mL淺孔板中，輕輕吹打至少 10 次，完全混勻，最舟-次

8、應(yīng)確保將吸頭中所有液體及磁珠都打入管中。2.孵育室溫靜置 10min3.棄上清4.乙醇漂洗上磁力架，靜置 10min,帶溶液澄清后棄上清。淺孔板保持于磁力架上，加入 1805 新鮮配制的75 叱醇吹打 6 次，棄上清5.再次漂洗口重復步驟 4,充分棄去殘液。6.干燥口室溫晾干，約 5min,使用手電筒照射磁珠表面無反光即為干燥。1.%2.洗脫口2.%2.孵育口向淺孔板中加入 235 洗脫緩沖液，浸濕磁珠，下架，反復吹打混勻至溶液呈均一狀態(tài)。室溫 10min,每 5min 進行次吹打混勻。9.移入 PCRf 口置于磁力架上至澄清，取 21 人上清液，加入到配制好的 PCR 反應(yīng)液中，反復吹打混勻

9、，反應(yīng)體系 50pLo停止點：連接產(chǎn)物純化后可置-20C 冰箱儲存。10.轉(zhuǎn)實驗區(qū)口通過室內(nèi)傳遞窗轉(zhuǎn)運到擴增區(qū) 1博昊有天醫(yī)學檢驗實驗室文件編號：BHYT-4-107/03版本/修訂號：A/0主題內(nèi)容游離DNA文庫制備及測序流程記錄表生效日期：20190918第 3 頁共 8 頁主題內(nèi)容游離DNA文庫制備及測序流程記錄表博昊有天醫(yī)學檢驗實驗室文件編號：BHYT-4-107/03版本/修訂號：A/0主題內(nèi)容游離DNA文庫制備及測序流程記錄表生效日期：20190918第 4 頁共 8 頁五、PCR擴增區(qū)步驟操作內(nèi)容備注擴 增區(qū)11 設(shè)置 PCR 條件熱蓋 105C,98C2min1 循環(huán)98C15

10、s-56c15s-72c30s12 循環(huán)72c5min1 循環(huán)4CHold2 轉(zhuǎn)實驗區(qū)擴增管經(jīng)過道傳遞窗轉(zhuǎn)運到擴增區(qū) 2。擴增區(qū)不能有開管操作六、文庫的純化區(qū)試 劑區(qū)步驟純化磁珠的準備口操作內(nèi)容提前 30min 取出純化磁珠至室溫。使用前充分震蕩混勻，排槍分裝 50 山/孔磁珠至 1.2mL 淺孔板?？商崆鞍旬敶笠眉兓噭┓旁跀U增區(qū) 2 冰箱擴 增區(qū)21.移入純化板口擴增后的產(chǎn)物瞬時離心，收集反應(yīng)液至管底。將全部產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)移至已分裝好 50L純化磁珠的 1.2mL 淺孔板中。2.磁珠吸附用帶濾芯吸頭輕輕吹打至少 15 次至完全混勻，最次應(yīng)確保將吸頭中所有液體及磁珠都打入管中， 靜置10分鐘。

11、于磁力架吸附 10 分鐘至液體澄清，棄上清。3.乙醇漂洗于磁力架上，加入 180pL75 叱醇漂洗磁珠，吹打 6 次，靜置30s 后棄上清注意加乙醇時清洗孔壁5.再次漂洗口6.干燥口重復步驟 3,充分棄去孔內(nèi)殘液。保持純化板在磁力架上，室溫晾干（使用手電筒照射磁珠表面尢反光現(xiàn)象即為葉燥）。6.洗脫口保持淺孔板于磁力架上，加 32PL 洗脫緩沖液浸濕磁珠表面，下架，輕輕吹打混勻，室溫靜置 10 分鐘，中間5 分鐘混勻一次。7.移入新管口上架至溶液澄清， 吸取 30L上清液轉(zhuǎn)移到新 PC做或八連排中。停止點：PCR 純化后產(chǎn)物，可置-20C 冰箱儲存博昊有天醫(yī)學檢驗實驗室文件編號：BHYT-4-1

12、07/03版本/修訂號：A/0主題內(nèi)容游離DNA文庫制備及測序流程記錄表生效日期：20190918第 5 頁共 8 頁七、DNB制備與質(zhì)檢區(qū)步驟操作內(nèi)容備注試 劑區(qū)準備試劑口取出環(huán)化反應(yīng)緩沖液、連接酶、DNB 制備緩沖液、DNB 聚合酶混合液 I、DNB 聚合酶混合液 II、TE 緩沖?和 DNB 終止液、DNB加載緩沖液 kDNB 加載緩沖液 II,經(jīng) PCR 通道傳遞窗轉(zhuǎn)移到擴增區(qū) 2連接酶、DNB 聚合酶混合?夜II、 DNA 聚合酶混合液存放于-20C,現(xiàn)用現(xiàn)拿。 其它試劑 4C解凍。測序試劑板 II 及 DNB加載試劑板常溫解凍即可。測序試齊 IJ 板 I、測序試齊【J 板 II、D

13、NB 力口載試齊 IJ 板、DNA 聚合酶混合液、 dNTP 混合液 kdNTP 混合液 II 于試劑區(qū)融化備用，測序芯片室溫平衡，DNB 加載前經(jīng) PCR 通道傳遞窗轉(zhuǎn)移至測序區(qū)。擴 增區(qū) 2.1.PCR 義庫質(zhì)檢加樣：口1dsDNA 檢測試劑配制：染料工作液配制：熒光染料/buffer=1/199染料分裝：定標管 S1、S2 各分裝 190 口樣本管各分裝 198Lo1標準品 S1、S2 各加 101,對應(yīng)樣本管加樣 2 人。1U 盤導出定量結(jié)果，按時間排序后導入定量表。要求最終 PCR 產(chǎn)物文庫濃度2ng/pLo2.混合文庫與環(huán)化：pooling變性單鏈環(huán)化反應(yīng)d797d4f1-Numb

14、ered_289ab90d-964d-443b-b93c-464f3a8a861d-Numbered_dfc5a9c1-1e40-4158-901e-496f9bce6efe根據(jù)任務(wù)單中 DNAOt 量結(jié)果， 將待測文庫根據(jù)標簽接頭編號確定合適的 pmoL 數(shù)進行等質(zhì)量混合， 并使用洗脫緩沖液統(tǒng)一稀釋至濃度為 3.33ng/科 L。d797d4f1-Numbered_289ab90d-964d-443b-b93c-464f3a8a861d-Numbered_dfc5a9c1-1e40-4158-901e-496f9bce6efe取48dL 混合文庫于 PCRf 中， 置于 PCR 儀上 95C

15、 變性 6min,在反應(yīng)進行到 5min 處即刻取出 PCRf 插入碎冰冷卻，放入-20c 冰箱23min 后取出。d797d4f1-Numbered_289ab90d-964d-443b-b93c-464f3a8a861d-Numbered_dfc5a9c1-1e40-4158-901e-496f9bce6efe每個 PCRt 加 12.1L 環(huán)化反應(yīng)液，混勻，瞬離 5s。反應(yīng)條件：熱蓋：Off,體積：60L,37C,30min。直接將樣本濃度導入任務(wù)單的電子表格即可計算出各樣本需要用于POOLING的體積。每條 lane 用里酶：0.55buffer:11.6 小每張芯片用量酶：1.1bu

16、ffer:25.52 人3.DNB 生成取 2.3 步驟環(huán)化 DNA 義庫 205（約 6ng）到 0.2mLPCRt。力口 20PLDNB 制備緩沖液，渦漩混勻，瞬離，置 PCR儀反應(yīng)條件：熱蓋：105C,體積：405，95C1min,65C1min,40c1min,4CHold。當溫度達到 4c 時取出 PCR 管，瞬離 5s,力口 40LDNB 聚合酶混合液 I 和 4nDNB 聚合酶混合液 II,槍混。瞬離。反應(yīng)條件：熱蓋：Off,體積：84 山，30C20min,4CHold。達 4c 后立即取出 PCR 管置冰盒上，即刻加 20 人 DNB 終止緩沖液，闊口吸頭滴混 58 次，4c

17、 備用。注意：混勻 DNB 時 f 要用闊口吸頭輕柔吹打，劇烈吹打會破壞DNB。終體積：20+20+40+4+20=10454.DNB 質(zhì)檢4.1ssDNA 檢測試齊 1J 準備：配制與分裝同 dsDNAo40ng/5（不是由于博昊有天醫(yī)學檢驗實驗室文件編號：BHYT-4-107/03版本/修訂號：A/0主題內(nèi)容游離DNA文庫制備及測序流程記錄表生效日期：20190918第 6 頁共 8 頁4.2 標準品 S1、S2 各加 10 時對應(yīng)的樣本各加樣 25。4.3 濃度 8ng/540ng/上范圍內(nèi)合格。DNB反應(yīng)時間過長導致），用DNB加載液I稀釋到20ng/（1。5.測序的加載準備準備兩個八

18、連排管做好標記。加入 325DNB加載緩沖液II,和1pLDNB聚合酶混合液II.將上述3.3樣本全部轉(zhuǎn)入八連排中，闊口吸頭滴混58次。經(jīng)過 PCR 過道傳遞窗轉(zhuǎn)移到測序區(qū)八、DNB加載區(qū)步驟操作內(nèi)容備注測序區(qū)加載.清洗 DL-50:進行加載前對儀器進行清洗，12 次，最斤-次使用進行預(yù)載的底座進行清洗。.放置芯片：檢查全自動樣品加載系統(tǒng)墊片、芯片底座是否正常，并將測序芯片安裝在芯片底座上，確保上下左右無法晃動。測序芯片反面定位凸起與樣品加載系統(tǒng)上的凹槽吻合后卡住芯片。.放置加載試劑板：揭開試劑板封口膜，放置在加載系統(tǒng)試劑板位（試劑標簽粘貼處應(yīng)朝外）。.放置測序樣品管：將樣本放于加載系統(tǒng)指定 DNB 放置區(qū)，選擇 DNB 加載程序 Sample2.0,點擊開始，等待加載完成。.加載完成后，保持芯片在加載系統(tǒng)上室溫孵育 30min。取下芯片，上機測序或存放于 4c 冰箱備用。DNB 加載過程中切勿移動芯片。九、Halos關(guān)聯(lián)信息導入?yún)^(qū)步驟內(nèi)容備注測序區(qū)1、導入樣本信息表核對信息，制作樣本信息表，點擊【樣本中心】-【導入】按鈕，導入樣本信息表2、導入 Pooling 信息核對信息，制作 pooling 信息表，點擊【實驗中心】-【導入】按鈕，導入 Pooling 信息表。3、補錄關(guān)聯(lián)口:核又 DNBID 順序，點擊【補錄關(guān)聯(lián)】輸入相關(guān)信息，需英文字