S-腺苷甲硫氨酸高產(chǎn)菌株的篩選、誘變選育及其培養(yǎng)條件的優(yōu)化_

1、四川師范大學(xué)碩士學(xué)位論文S-腺苷甲硫氨酸高產(chǎn)菌株的篩選、誘變選育及其培養(yǎng)條件的優(yōu)化姓名：葉盛申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：李維20070601四師范大學(xué)碩士畢業(yè)論文腺苷甲硫氨酸高產(chǎn)菌株的篩選、誘變選育及其培養(yǎng)條件優(yōu)化研究生物化學(xué)與分子生物學(xué)專業(yè)研究生葉盛指導(dǎo)教師李維摘要一腺苷甲硫氨酸（，簡稱為）廣泛存在于各種生物體內(nèi)，是人體內(nèi)重要的生理活性物質(zhì)，參與轉(zhuǎn)甲基作用、多胺合成、轉(zhuǎn)硫基作用等反應(yīng)。在臨床上，對于治療肝病、抑郁癥、關(guān)節(jié)炎等都具有一定的療效，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。但由于價格昂貴，目前還未能得到廣泛的應(yīng)用。為獲得高產(chǎn)菌株，本論文展開了以下幾方面的工作。首先，從自然界

2、中采集到個樣品，從中分離得到株酵母菌菌株。通過對該株進(jìn)行紙層析法初篩和法復(fù)篩，篩選獲得株產(chǎn)量相對較高的菌株，命名為￥，其胞內(nèi)含量為。對分離到的菌株￥進(jìn)行了多輪誘變選育。通過對菌株￥進(jìn)行亞硝基胍（）誘變、乙硫氨酸篩選，獲得抗性菌株株，其中突變株的胞內(nèi)含量為，較菌株提高了倍。突變菌株一經(jīng)誘變和低濃度（肛）制霉菌素篩選，獲得制霉菌素抗性菌株株，其中突變株的胞內(nèi)含量為。突變株再經(jīng)紫外（）誘變和高濃度（肛）制霉菌素抗性篩選，分離到抗性菌株株，并從中獲得高產(chǎn)突變株一，其胞內(nèi)含量為，較出發(fā)菌株￥提高了。突變菌株產(chǎn)的最佳培養(yǎng)基成分為：（：，。（），酵母粉，蔗糖，胰蛋白胨，蛋氨四川師范大學(xué)碩士畢業(yè)論文酸。突變菌

3、株在優(yōu)化條件下發(fā)酵小時，胞內(nèi)產(chǎn)量可達(dá)幾，菌體生物量為。關(guān)鍵詞：一腺苷甲硫氨酸酵母菌分離誘交培養(yǎng)基優(yōu)化四拜巷大學(xué)碩士畢業(yè)論文：（哪，￥，蠹！，￥一（），四川師范大學(xué)碩士畢業(yè)論文，一。（）￥一，一一一，一一（），皿吼，：；：四川師范大學(xué)學(xué)位論文獨創(chuàng)性及使用授權(quán)聲明本人聲明：所呈交學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師奎綞副數(shù)握指導(dǎo)下，獨立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品或成果。對本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人承諾：已提交的學(xué)位論文電子版與論文紙本的內(nèi)容一致。如因不符而引起的學(xué)術(shù)聲譽上的損失由本人自負(fù)。本人同

4、意所撰寫學(xué)位論文的使用授權(quán)遵照學(xué)校的管理規(guī)定：學(xué)校作為申請學(xué)位的條件之一，學(xué)位論文著作權(quán)擁有者須授權(quán)所在大學(xué)擁有學(xué)位論文的部分使用權(quán)，即：）己獲學(xué)位的研究生必須按學(xué)校規(guī)定提交印刷版和電子版學(xué)位論文，可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索；）為教學(xué)和科研目的，學(xué)?？梢詫⒐_的學(xué)位論文或解密后的學(xué)位論文作為資料在圖書館、資料室等場所或在校園網(wǎng)上供校內(nèi)師生閱讀、瀏覽。論文作者簽名卞壺年只四川師范大學(xué)硬士畢業(yè)論文第一章文獻(xiàn)綜述一腺苷甲硫氨酸（），又名一腺苷蛋氨酸，是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的重要代謝中間物質(zhì)“閣，也是人體內(nèi)一種重要的生理活性物質(zhì)，參與了多種生化反應(yīng)洲，其常用縮寫形式有，等。

5、首先由沁”發(fā)現(xiàn)，其分子式為，乩，分子量，分子結(jié)構(gòu)圖如圖所示嘲。圖腺苷甲硫氨酸分子結(jié)構(gòu)圖（）一腺苷甲硫氨酸的生物學(xué)功用一腺苷甲硫氨酸的生物學(xué)功用主要體現(xiàn)在轉(zhuǎn)甲基、轉(zhuǎn)硫以及轉(zhuǎn)氨丙基三個方面。轉(zhuǎn)甲基作用是體內(nèi)重要的甲基供體，參與體內(nèi)許多物質(zhì)的合成與代謝“。在甲基轉(zhuǎn)移酶（）催化下，提供甲基后生成（腺苷高半胱氨酸）州。麗生成的是轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)的競爭性抑制劑，在含量上升以及含量降低或與比值降低的情況下都將抑制轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)。許多含物質(zhì)如：肌酸、松果素、膽堿、腎上腺素、甲氧腎上腺素、鵝肌肽、肉堿、肌堿、甲基組胺、四川師范大學(xué)碩士畢業(yè)論文甲菸酰胺等在生物合成時需從上獲得甲基“一。此外，還參與核酸、蛋白質(zhì)、磷脂、多糖、

6、多胺等的甲基化修飾“比如說，參與中核糖羥基和堿基上的氨基的甲基化，而的甲基化修飾也越來越受到關(guān)注“”。在對蛋白質(zhì)甲基化修飾時，專門作用于肽鏈游離氨基上，而對小肽或氨基酸則無作用“。參與的甲基化反應(yīng)為細(xì)胞膜提供磷脂，調(diào)節(jié)或維持某些酶活性，維持高激素以及神經(jīng)遞質(zhì)（如多巴胺，褪黑素，血清素）的水平等“”。轉(zhuǎn)硫作用在脫甲基后生成的腺苷高半胱氨酸經(jīng)隨后的代謝生成半胱氨酸，半胱氨酸又可代謝轉(zhuǎn)交為（谷胱甘肽）。是體內(nèi)硫儲存庫和細(xì)胞主要的抗氧化物質(zhì)，在慢性肝病患者中，水平降低的部分原因就是合成減少所致。轉(zhuǎn)氨丙基作用經(jīng)脫羧后生成的腺苷甲基硫丙胺轉(zhuǎn)氨丙基給腐胺或亞精胺則生成相應(yīng)的亞精胺和精胺，這些都是真核生物中重

7、要的多胺，而一甲基硫腺苷是副產(chǎn)物嘲。在正常的條件下，此代謝途徑在體內(nèi)代謝中所占份額不超過，而在肝移植和早期肝癌患者中，則發(fā)現(xiàn)此代謝途徑會被誘導(dǎo)加強“”。一腺苷甲硫氨酸在臨床上的應(yīng)用在臨床上的應(yīng)用主要表現(xiàn)在對肝病、關(guān)節(jié)炎、抑郁癥、等有很好的療效“”。大量的臨床表明，在改善肝功能以及對于各種原因引起的肝功能異常都有很好的功用。比如說，對膽汁淤積、酒精肝造成的肝損傷、肝功能紊亂等都有療效，尤其可以顯著降低肝硬化的死亡率“刪?？梢蕴岣吣X內(nèi)羥色胺和一羥吲哚乙酸的水平，對各種抑郁癥，尤其是產(chǎn)后抑郁癥有療效。與其它抗抑郁癥相比，具有見效快、無成癮性、無不良反應(yīng)、耐受性好等優(yōu)點，在與標(biāo)準(zhǔn)抗抑郁藥（如米安巴林、

8、丙咪嗪等）聯(lián)合使用時比單獨用藥起效快】。關(guān)節(jié)炎患者在接受治療兩周后癥狀就能得到改善，其療效與酮洛芬相當(dāng)，但副作用卻小得多，且見效快。此外，還有如下功用：增強不四川師范大學(xué)碩士畢業(yè)論文育男性的精子活力伽，有助于治療偏頭痛嘲、肌纖維痛和冠心病嘛堋，減輕腦震蕩后遺癥，治療多發(fā)性硬化、帕金森氏病、亞急性脊髓交性以及引起的神經(jīng)性并發(fā)癥，并且還具有抗衰老、改善睡眠等多重功效淵。腺苷甲硫氨酸的獲取方法的方法主要有化學(xué)合成法、酶促轉(zhuǎn)化法和微生物發(fā)酵法等種。化學(xué)合成法化學(xué)合成最常用的方法是用甲基供體碘甲烷（）甲基化一腺苷高半胱氨酸。但由于其產(chǎn)率低，反應(yīng)產(chǎn)物又為（±）腺苷甲硫氨酸的混旋物，且難以分離得到

9、有活性的（一）構(gòu)型產(chǎn)物等明顯缺點，故而很少被實際應(yīng)用。酶促轉(zhuǎn)化法酶促轉(zhuǎn)化法主要利用合成酶（，又稱：。），催化底物卜甲硫氨酸和生成（一）型，且合成酶有三磷酸酶活性，使三磷酸分解為焦磷酸和磷酸，酶促反應(yīng)如下式所示：“首先用從大鼠肝臟細(xì)胞中提取的合成酶催化合成，催化底物甲硫氨酸和合成出。隨后又有人從大腸桿菌和酵母中分離合成酶。洶等從組織和曼中分離合成酶合成具有生物活性的；隨著固定化技術(shù)的發(fā)展，固定化合成酶被用于合成阻螄：”等利用基因工程手段，將合成酶克隆到（）中表達(dá)，并利用從該工程茵中提取的酶合成。該法具有反應(yīng)產(chǎn)物純度高、分離提純?nèi)菀住⒎磻?yīng)周期短以及無污染等優(yōu)點，但是，合成酶在動植物和微生物體內(nèi)含量

10、少，酶活不高，成本太高，且分離純化困難，所以一般只用于合成同位素標(biāo)記的啪捌。西川師范大學(xué)碩士畢業(yè)論文微生物發(fā)酵法某些微生物可以在細(xì)胞內(nèi)積累，通過對這些微生物的發(fā)酵，尤其是在培養(yǎng)基中添加一定量的甲硫氨酸的情況下，可以獲得大量的。因此通過微生物的發(fā)酵，再從中提取精制是目前工業(yè)生產(chǎn)的主要途徑。從富含的面包酵母提取，但產(chǎn)物含量低，分離純化困難，沒法形成可行的生產(chǎn)工藝；啪通過篩選多株不同的菌株，分離到一株菌，該菌在發(fā)酵罐中培養(yǎng)天后的產(chǎn)量高達(dá)（菌體生物量達(dá)到）。這是目前從各種專利和期刊上所查到的最高產(chǎn)量。的分離純化由圖所示的一腺苷甲硫氨酸分子結(jié)構(gòu)可知，中含有多個帶電基團(tuán)，這為它的分離純化提供了一個很好的途

11、徑一離子交換法。離子交換法簡介離子交換法被廣泛應(yīng)用于物質(zhì)的分離，主要對象為帶有電荷、離子形式的物質(zhì)。常利用離子交換填料的帶電性與分離物親電吸附，根據(jù)不同物質(zhì)吸附強度的不同，從而達(dá)到洗脫分離的目的”。二十世紀(jì)年代，離子交換材料取得重要突破，各種離子交換材料相繼出現(xiàn)并逐步發(fā)展，如大孔交聯(lián)聚苯乙烯離子交換樹脂、熱再生樹脂和鰲合樹脂等新型材料，為離子交換法的應(yīng)用開辟了廣闊前景。二十世紀(jì)末，離子交換法第一次應(yīng)用于生物物質(zhì)的分離，從蛋白質(zhì)水解液中分離氨基酸啪。近年來，離子交換法分離的對象也由簡單的金屬離子、小分子化合物擴展到大分子以及各種普遍的生物物質(zhì)。離子交換材料的合成和離子交換法的應(yīng)用技術(shù)互相推動，迅

12、速在工業(yè)、冶金、環(huán)保、生物、醫(yī)藥、食品等許多領(lǐng)域取得了巨大成功。離子交換樹脂作為一種常用填料，是三元網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子聚合物。它由三部分組成：不溶性的三維空間網(wǎng)絡(luò)骨架，連接在骨架上的功能基團(tuán)和功能基團(tuán)所帶的相反電荷的可交換離子”刪。由功能基團(tuán)所帶的電荷的不同，可將其四川師范大學(xué)碩士畢業(yè)論文分為陽離子交換樹脂、陰離子交換樹脂：根據(jù)功能基團(tuán)解離性的不同，可將離子交換樹脂進(jìn)一步劃分為：強酸型陽離子交換樹脂（出等）、弱酸型陽離子交換樹脂（等）、強堿型陰離子交換樹脂（，）。等）和弱堿型陰離子交換樹脂（。）?？山粨Q離子在骨架中進(jìn)進(jìn)出出，發(fā)生離子交換。離子交換過程可以看作是可逆多相化學(xué)反應(yīng)。一般來說包括三個步

13、驟：外部擴散、內(nèi)部擴散、化學(xué)交換。影響離子交換過程選擇性的因素有很多，比如說，離子和材料閫的親和力越大，越容易被吸附，越難洗脫，當(dāng)吸附離子后，材料的膨脹度減小，親和力加大。親和力過大，不容易洗脫，而親和力太小，則選擇性差啪一。離子的化合價、溶液的酸堿度、樹脂的交聯(lián)度及膨脹度等對離子交換都有很大的影響。此外，有機溶劑對離子交換過程選擇性也有影響，當(dāng)有機溶劑存在時，對有機離子的選擇性降低，易吸附無機離子。影響交換容量的因素主要有以下幾點：交換基團(tuán)的數(shù)目和性質(zhì)，這是決定交換容量的根本因素。環(huán)境的酸堿度，它對強酸或強堿性材料的交換容量影響不大，而對弱酸或弱兩性材料的影響大。溶液離子強度太高會與目的物競

14、爭，減少交換容量。有機溶劑，它會減弱材料對離子的吸附。離子交換法在棚分離中的應(yīng)用除具有一個帶正電荷的锍外，還有三個可離子化的基團(tuán)：分別為，的氨基酸鏈上的羧基和氨基，為的嘌呤上的氨基。在酸性條件下帶正電荷，能和陽離子交換樹脂進(jìn)行離子交換。因此，通過離子交換法，可與雜質(zhì)分開。工在原來的基礎(chǔ)上對洗脫流程進(jìn)行了一些改進(jìn)。先利用雷氏鹽對的高氯酸提取液沉淀除雜質(zhì)，再將除雜后的腺苷甲硫氨酸于可柱上經(jīng)不同濃度的書。分段洗脫，并用磷鎢酸和，、，進(jìn)行先后沉淀，最終得到較純的一腺苷甲硫氨酸。上利用一分離德到腺苷甲硫氨酸和腺苷同型半胱氨酸。劉惠等“報道利用苦味酸等結(jié)合有機試劑結(jié)晶沉淀方法來沉淀、分離，獲得穩(wěn)定、純度較

15、高的硫酸鹽。四川師范大學(xué)碩士畢業(yè)論文一腺苷甲硫氨酸的穩(wěn)定性研究一腺苷甲硫氨酸是雙手性物質(zhì)，有種異構(gòu)體：（，）一和（，）一。失活機理其中只有（，）一才具有生物活性的失活反應(yīng)可按照以下種不同的機理進(jìn)行“”。其一，也是最主要的失活反應(yīng)。是通過氨基酸鏈上的羧基氧對一碳原子進(jìn)行分子內(nèi)親核攻擊，從而裂解形成，甲硫腺苷（。）和高絲氨酸（）內(nèi)酯，隨后，內(nèi)酯水解。其二，（，）一通過自發(fā)消旋變成非生物活性的（，）一，但其消旋機理尚未得到闡明。锍會通過自發(fā)的消旋作用失去手性，而锍的消旋與生成的非酶促水解是同時發(fā)生，彼此相互競爭的。生物體內(nèi)的裂解反應(yīng)和水解反應(yīng)在某種程度上平衡了（，）一的消旋反應(yīng)，從而防止了（，）一的

16、過量累積”“。其三，水解生成腺嘌呤（）和一戊糖甲硫氨酸（）。影響一腺苷甲硫氨酸穩(wěn)定性的因素包括酸度、濕度、溫度等。就酸度的影響而言，由于有多個可解離基團(tuán)，因此值對其失活反應(yīng)有著很大的影響，因此，總的來說，酸性條件可以減少的失活。另外，低溫和保持干燥也有利于的穩(wěn)定。鹽的穩(wěn)定性鹽的穩(wěn)定性關(guān)鍵取決于分子中的陰離子的性質(zhì)，提高陰離子的立體障礙可增加其穩(wěn)定性洶。大分子量的陰離子通過靜電作用與結(jié)合，利用其空間位阻限制氨基酸鏈的自由旋轉(zhuǎn)，從而使得的穩(wěn)定性得到提高“剮。按照鹽的溶解性，可將其分為下列兩大類：水溶性聚陰離子鹽和脂溶性多陰離子鹽。，水溶性聚陰離子鹽具有高度穩(wěn)定性。通過與鹽酸鹽、對甲苯磺酸硫酸鹽的熱

17、穩(wěn)定性比較實驗發(fā)現(xiàn)，固態(tài)聚陰離子鹽在時，能長期穩(wěn)定存在，而在時的穩(wěn)定性卻各不相同，但它們在時的穩(wěn)定性均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于鹽酸鹽和對甲苯磺酸硫酸鹽。穩(wěn)定、非水溶性鹽，是由牛磺酸酞胺衍生物與碳原子數(shù)為的脂四川師蓖大學(xué)碩士畢業(yè)論文肪酸化學(xué)合成的具有高立體障礙的多陰離子鹽。塒?；王Ｅ；撬徕c具有高度穩(wěn)定性，在任何值下，其穩(wěn)定性均表現(xiàn)得比硫酸鹽樣品要高：在室溫下貯存于開口瓶中時，?；王Ｅ；撬徕c樣品中的量在個月后只減少了，在個月后仍有的存在，而對甲苯磺酸硫酸鹽個月就降低了：如若真空貯存或干燥劑（：魄）中貯存，酰化油酰?；撬徕c樣品中的腿量在個月屠仍為嘶。“。新型大陰離子鹽不但大幅度提高了其穩(wěn)定性，而且其生物利用率亦

18、有所提高，因此具有良好的應(yīng)用前景。腺苷甲硫氨酸的市場需求情況早在年代末，作為臨床處方藥就已出現(xiàn)在歐洲醫(yī)藥市場上。當(dāng)時是用作治療關(guān)節(jié)炎的抗炎止痛藥物。國外抗炎藥物品種極多，而并未占有什么優(yōu)勢。年代中，在歐淵被推薦為抗憂郁癥的精神病藥物。年在美國通過了的隨機雙盲法驗證。在國外，已應(yīng)用的非常廣泛。藥用由德國基諾（）藥廠在世紀(jì)年代首先用于臨床，目前已在意大利、德國、美國、西班牙、俄羅斯、法國和中國等國作為抗抑郁藥、關(guān)節(jié)炎藥和肝病藥應(yīng)用于臨床。同時在食品添加劑中也有廣泛應(yīng)用。在年，在意大利作為抗抑郁處方藥用量排名第三：年美國的和兩家公司首次從歐洲進(jìn)口，到年上半年，在公司全美各大藥房銷售總量排名第位；根據(jù)

19、統(tǒng)計的美國銷售額數(shù)據(jù)，在年特殊營養(yǎng)補充品的銷售額中名列第四。在國內(nèi)的市場也非常廣闊。我國是肝炎流行的大國，乙肝病毒攜帶者約億，加上酒精和藥物對肝損害的患者，人群更是巨大。而我國目前尚無一種能真正改善肝細(xì)胞代謝的生化藥物。在人體內(nèi)是由肝臟細(xì)胞合成的，而肝臟又是發(fā)揮其生物學(xué)作用的主要場所。在肝細(xì)胞功能有障礙時，必然會損傷到的生物合成和代謝作用，因此，應(yīng)該是肝病治療的理想藥物。據(jù)報道，不僅有利于各種急、慢性肝病的治療，而且對實驗性動物早期肝癌也有預(yù)防作用。此外，我國各類關(guān)節(jié)炎患者達(dá)到億，抑郁癥患者四川師范大學(xué)碩士畢業(yè)論文萬，隨著生活節(jié)奏的加快和工作壓力的增加，抑郁癥患者也明顯增多。據(jù)估算，我國的年用

20、量應(yīng)在噸左右。此外，在保健和化妝品行業(yè)也有很大的應(yīng)用前景。作為生化試劑，在國內(nèi)早已有商品供應(yīng)。目前，在國內(nèi)銷售的只有德國基諾藥廠生產(chǎn)的“思美泰”，作為肝病治療藥物，在國內(nèi)銷售價格昂貴。據(jù)年網(wǎng)上最新報價，片劑每日最大服用單價約為元，粉針劑約為元。由此可見，臨床推廣應(yīng)用的關(guān)鍵在于降低其生產(chǎn)成本。一腺苷甲硫氨酸的研究背景。對實驗室保藏的株不同類型的菌進(jìn)行含量檢測后發(fā)現(xiàn)，相對其余種細(xì)菌，只有有較高的含量。，嘲在對余株菌株胞內(nèi)含量的檢測后發(fā)現(xiàn)，胞內(nèi)含量高于的菌株只出現(xiàn)在酵母菌中，其中余株胞內(nèi)含量超過；而擔(dān)子菌、霉菌、細(xì)菌、放線菌、乳酸菌等其余類菌株的胞內(nèi)含量均低于。因此，在他們之后的研究都主要集中在對酵

21、母菌的研究上，以期獲得產(chǎn)量的提高。迄今為止，通過誘變方式來有效提高酵母菌中產(chǎn)量的報道相對較少。通過對誘變處理和制霉菌素抗性篩選，分離得到麥角固醇合成缺陷型突變菌株，這些突變株可以通過減少的消耗量從而達(dá)到在菌體內(nèi)富集的目的。由該結(jié)果可以推知，對其它酵母菌進(jìn)行制霉菌素抗性篩選，可能也會篩選到高產(chǎn)菌株。此外，上酬通過乙硫氨酸的抗性篩選，也分離得到一株富集的乳糖利用型突變菌株（。最近，董函竹“”等對誘變選育的釀酒酵母產(chǎn)生的搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，產(chǎn)量可達(dá)；陳小龍嘞等人對土壤中篩選到的酵母菌培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，產(chǎn)量最高達(dá)；申麗”等人對重組的廳曲婦搖瓶發(fā)酵天后，產(chǎn)量可達(dá)（干細(xì)胞），這是目前國內(nèi)報道的最高搖

22、瓶產(chǎn)量。嘲對分離到的在發(fā)酵罐中培養(yǎng)天后，產(chǎn)量高達(dá)（菌體生物量達(dá)到），四【師范大學(xué)碩士畢業(yè)論文這也是目前報道的最高產(chǎn)量。目前國內(nèi)尚未實現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)，開展利用多種不同來源的微生物有效生產(chǎn)的研究是十分必要的。本研究先從自然界中分離到株高產(chǎn)菌株，對其進(jìn)行多輪復(fù)合誘變篩選。最后，對篩選獲得的株高產(chǎn)突變株進(jìn)行搖瓶優(yōu)化培養(yǎng)研究，為下一步的研究打下堅實基礎(chǔ)。四川師范大學(xué)碩士畢業(yè)論文第二章一腺苷甲硫氨酸高產(chǎn)菌株的篩選及誘變育種摘要利用分離培養(yǎng)基從采集到的個各種不同來源樣品中分離得到株酵母菌菌株。通過對該株酵母菌菌株進(jìn)行紙層析法初篩和法復(fù)篩，獲得株一腺昔甲硫氨酸高產(chǎn)株￥，其產(chǎn)量為。通過對菌株￥的亞硝基胍（）誘變和

23、乙硫氨酸抗性篩選，分離到抗性菌株株，其中突變菌株的胞內(nèi)含量為，較菌株￥提高了倍。突變菌株經(jīng)亞硝基胍誘變和低濃度（¨）制霉菌素的抗性篩選，獲得制霉菌素抗性菌株株，其中突變菌株一的胞內(nèi)含量為。突變菌株一再經(jīng)紫外（）誘變和高濃度（崛）制霉菌素的抗性篩選，分離得到抗性菌株株，其中突變菌株一胞內(nèi)含量為，較出發(fā)菌株一提高了。關(guān)鍵詞：腺苷甲硫氨酸酵母菌篩選誘變，￥（），￥一（），一（）匹師范大學(xué)碩士畢業(yè)論文一。一一一，肛、卜魁：一（）：；引言一腺苷甲硫氨酸（。簡稱為）是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的重要生理活性物質(zhì)，作為甲驀供體參與了體內(nèi)許多生物化學(xué)反應(yīng)，涉及到核酸、蛋白質(zhì)、磷脂、多糖、多胺等的合成。參

24、與的甲基化反應(yīng)為細(xì)胞膜提供磷脂，調(diào)節(jié)或維持某些酶活性，維持高激素以及神經(jīng)遞質(zhì)（如多巴胺，褪黑素。血清素）的水平等“。在臨床上，已作為處方藥物用于治療抑郁癥、關(guān)節(jié)炎、肝功能紊亂等嘲。在保健和化妝品行業(yè)也有很大的應(yīng)用前景。但由于價格昂貴，國內(nèi)尚未實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，因此很有必要對提高產(chǎn)量進(jìn)行研究。倘的方法主要有化學(xué)合成法、酶促轉(zhuǎn)化法和微生物發(fā)酵法等種化學(xué)合成由于其產(chǎn)率低，反應(yīng)產(chǎn)物為（±）腺苷甲硫氨酸的混旋物，且難以分離得到有活性的（）構(gòu)型產(chǎn)物，故而很少被實際應(yīng)用踟。酶促轉(zhuǎn)化法具有反應(yīng)產(chǎn)物純度高、分離提純?nèi)菀?、反?yīng)周期短以及無污染等優(yōu)點，但是，合成酶在動植物和微生物體內(nèi)含量少，酶活不高，成本太

25、高，且分離純化困難，所以一般只用于合成同位素標(biāo)記的峨“。某些微生物可以在細(xì)胞內(nèi)積累，通過對這些微生物的發(fā)酵，尤其是在培養(yǎng)基中添加一定量的甲硫氨酸的情況下?？梢垣@得大量的，因此通過微生物的發(fā)酵，再從中提取精制是目前工業(yè)生產(chǎn)的主要途徑。嘲對實驗室保藏的株不同類型的菌進(jìn)行含量檢測后發(fā)現(xiàn)，四川師范大學(xué)碩士畢業(yè)論文相對其余種細(xì)菌，只有有較高的含量。嘲在對余株菌株胞內(nèi)含量的檢測后發(fā)現(xiàn)，胞內(nèi)含量高于的菌株只出現(xiàn)在酵母菌中，其中余株胞內(nèi)含量超過；而擔(dān)子菌、霉菌、細(xì)菌、放線菌、乳酸菌等其余類菌株的胞內(nèi)含量均低于。因此，在他們之后的研究都主要集中在對酵母菌的研究上，以期獲得產(chǎn)量的提高。迄今為止，通過誘變方式來有效

26、提高酵母菌中產(chǎn)量的報道相對較少?！啊蓖ㄟ^對誘變處理和制霉菌素抗性篩選，分離得到麥角固醇合成缺陷型突變菌株，這些突變株可以通過減少的消耗量從而達(dá)到在菌體內(nèi)富集的目的。由該結(jié)果可以推知，對其它酵母菌進(jìn)行制霉菌素抗性篩選，可能也會篩選到高產(chǎn)菌株。此外?？谝猿巴ㄟ^乙硫氨酸的抗性篩選，也分離得到一株富集的乳糖利用型突變菌株。因此，開展利用多種不同來源的微生物有效生產(chǎn)的研究是十分必要的。材料樣品來源樣品分別從四川師范大學(xué)校園區(qū)、成都市周邊區(qū)縣農(nóng)田、菜地、果園、污水溝、乳品廠、污水處理廠等處采集獲得，并對采集到的樣品當(dāng)天采集當(dāng)天分離。主要設(shè)備恒溫培養(yǎng)箱、恒溫震蕩搖床、磁力攪拌器、恒溫水浴鍋、分光光度計、島津

27、（）一分光光度計、微量電子天平、分析天平、酸度計、無菌操作臺、紫外誘變箱（自制，紫外燈管，波長）、高壓滅菌鍋、高速冷凍離心機、高效液相色譜島津（）型。培養(yǎng)基（）完全培養(yǎng)基（）：酵母粉，蛋白胨，葡萄糖：自來水配四舜蓖大學(xué)碩士畢業(yè)論文制，自然。（固體培養(yǎng)基另加瓊脂）（）酵母菌分離培養(yǎng)基（）：葡萄糖。酵母粉，尿素，。，卿吼，（）。，嘎。，瓊脂；。，虎紅（水溶液）（）豆芽汁培養(yǎng)基（）：葡萄糖，瓊脂，豆芽汁（稱取豆芽于水中煮沸后用四層紗布過濾，取濾液），定容至。（）計數(shù)培養(yǎng)基：在完全培養(yǎng)基中加入虎紅（每升培養(yǎng)基中加入虎紅溶液）配制而成。（）抗性篩選培養(yǎng)基：根據(jù)需要在完全培養(yǎng)基中加入適當(dāng)濃度的一乙硫氨酸（

28、）或制霉菌素（）。（）發(fā)酵培養(yǎng)基鼬（）：葡萄糖，酵母粉，蛋白胨，甲硫氨酸；自來水配制，自然。主要藥品及耗材葡萄糖、尿素、氯化鈉、檸檬酸、檸檬酸三鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、瓊脂、硫酸銨、硫酸鎂、硫酸亞鐵、無水乙醇、冰乙酸、丙酮、高氯酸、鹽酸等藥品均為國產(chǎn)分析純試劑；一甲硫氨酸（進(jìn)口分裝）：胰蛋白胨（公司）、酵母粉（公司）；乙硫氨酸（公司）；制霉菌素（公司）；腺苷甲硫氨酸標(biāo)品（）（公司）；亞硝基胍（日本東京化成工業(yè)株式會社）；新華一號層析濾紙。主要試劑（）生理鹽水：稱取氯化鈉溶于雙蒸水中，。滅菌備用。（）檸檬酸緩沖液：檸檬酸鈉，檸檬酸溶于雙蒸水中，于滅菌備用。（）亞硝基胍（）母液：稱取溶于丙酮中

29、，加入檸檬酸緩沖液，配制成濃度為的母液。（）紙層析展開液嘲：正丁醇：乙酸：水：。（）印洗脫液嘲：甲酸銨一甲酸緩沖溶液，。，四川師范大學(xué)碩士畢業(yè)論文（）醇堿液：，乙醇方法亞硝基胍誘變處理取生長對數(shù)期菌液于、離心，用生理鹽水洗滌次，再用檸檬酸緩沖液洗滌次并懸浮菌體于此緩沖液中，調(diào)節(jié)菌體濃度至個左右。加入亞硝基胍母液至終濃度“，于。避光處理一段時間后加入生理鹽水稀釋終止反應(yīng)。用生理鹽水洗滌次，懸浮菌體于生理鹽水中。取涂布抗性平皿，平皿置于避光培養(yǎng)天。紫外線誘變處理取生長對數(shù)期菌液于、離心，用生理鹽水洗滌次，再用生理鹽水懸浮菌體并調(diào)節(jié)菌體濃度至×個左右。吸取菌懸液于直徑的無菌平皿中，將平皿置

30、于磁力攪拌器上，在紫外燈（距離）下攪拌照射一段時間。分兩組涂布抗性平皿，一組直接稀釋后取涂布平皿；另一組則經(jīng)液體培養(yǎng)基活化過夜（避光，）后稀釋，取涂布平皿?？剐云矫笾糜诒芄馀囵B(yǎng)天。誘變流程出發(fā)菌株豎透童絲壟乙硫氨酸抗性平皿分離篩選獲得產(chǎn)量提高的突變菌株堅透變絲§低濃度制霉菌素平皿初篩獲得產(chǎn)量進(jìn)一步提高的突變菌株盟透鑾絲墨高濃度制霉菌素平皿復(fù)篩獲褥高產(chǎn)變異菌株含量的測定取發(fā)酵菌液離心、無菌水洗滌后，加入兒高氯酸混勻紙層析法后于室溫下靜置，離心，取此上清液于新華濾紙上點樣、層析。”。吹四川師范大學(xué)碩士畢業(yè)論文干層析濾紙，于冊紫外燈下標(biāo)記出的位置，剪切回收。用鹽酸洗滌回收濾紙，洗滌液于測定

31、紫外吸收值。最后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出含量。法取發(fā)酵菌液離心洗滌后，用無菌水懸浮菌體，加入高氯酸混勻后于室溫下靜置。、離。，上清液轉(zhuǎn)管并加入和，離心，取虬上清液上柱（。柱）淵。洗脫液流速為菌體生物量的測定取發(fā)酵菌液于條件下離一，用無菌蒸餾水洗滌菌體，于烘干后稱重。由烘干前后的重量差計算生物量。誘變劑致死率的計算將誘變和未經(jīng)誘變的菌液分別稀釋涂布于計數(shù)培養(yǎng)基平皿上，于條件下培養(yǎng)后計數(shù)。誘變菌株在平皿上長出的菌落數(shù)×誘變劑致死率同梯度下未誘變菌株在平皿上長出的菌落數(shù)菌體麥角固醇的提取及其含量測定取發(fā)酵液，離，棄上清液，沉淀用無菌水洗滌次后轉(zhuǎn)入三角瓶中，加入醇堿液，于水浴中皂化中途振蕩次。冷

32、卻至室溫后加入石油醚，振蕩后靜置，取上層石油醚在姍處測定紫外吸收值隗剮。總麥角固醇含量（囂。）細(xì)胞生物量（）一脫氫麥角固醇含量（。）細(xì)胞生物量麥角固醇含量總麥角固醇含量（）一脫氫麥角固醇含量”注：公式中的，分別為麥角固醇，（）一脫氫麥角固醇的（。）四川師范大學(xué)碩士畢業(yè)論文值；為樣品量×稀釋倍數(shù)。結(jié)果與討論一腺苷甲硫氨酸高產(chǎn)菌株的篩選精確稱取腺苷甲硫氨酸標(biāo)品左右于中，定容至紙層析法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制制成母液，用梯度稀釋成三組標(biāo)液（表）。分別測定各標(biāo)液在處的紫外吸收值，以吸光值為縱軸，標(biāo)液濃度為橫軸繪制腺苷甲硫氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖）。表標(biāo)液濃度樣號濃度（）¨¨飄耵紙卯札弘她掘

33、觚紙岳鰓！耋墨“¨號號號號號號號號號號號隴由圖可知，標(biāo)線的回歸方程為：（方程中的為濃度，單位；為值）；相關(guān)因子為：。酵母菌菌株的分離將采集到的個樣品中的固體樣品分別稱取置于生理鹽水中，經(jīng)玻璃珠振蕩打散后梯度稀釋，取虬涂布于酵母菌分離培養(yǎng)基、豆芽汁培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)天。對于液體樣品則直接梯度稀釋，取兒涂布于酵母菌分離培養(yǎng)基、豆芽汁培養(yǎng)基上。對獲得的菌株分別進(jìn)行光學(xué)顯微鏡鏡檢、菌落培養(yǎng)特征分析，最終分離得到株酵母菌，保藏于斜面上。捌昌譬標(biāo)漬濃度（，）圖腺苷甲硫氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線腺苷甲硫氨酸高產(chǎn)菌株的篩選株酵母菌分別經(jīng)活化后，轉(zhuǎn)種于發(fā)酵培養(yǎng)基中振動培養(yǎng)，培養(yǎng)基裝液量為每三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵液

34、經(jīng)紙層析法初篩和法復(fù)篩，檢測出菌株胞內(nèi)含量。各酵母菌菌株含量的篩選結(jié)果如表所示。由表可知，在所有測定的株酵母菌中，株酵母菌菌株胞內(nèi)含量為，占所有被測菌株的。株酵母菌菌株胞內(nèi)含量低于，約占所測菌株的。由測定結(jié)果可知，在測定酵母菌菌株中，不同菌株胞內(nèi)的積累水平在較大的范圍內(nèi)波動，且絕大多數(shù)酵母菌胞內(nèi)的含量都不太高。經(jīng)迸一步的檢測。發(fā)現(xiàn)株被命名為的酵母菌菌株胞內(nèi)積累量最高，其單位體積含量為，單位菌體含量是，菌體生物量為。￥菌株含量相對較高，故選擇菌株作為誘變出發(fā)菌株。該菌株由采集自乳品廠的淤泥樣品中分離獲得，經(jīng)生理生化鑒定以及和分子鑒定，發(fā)現(xiàn)酵母菌菌株￥屬于熱帶假絲酵母（）（菌種鑒定的具體過程略，其

35、細(xì)胞形態(tài)見圖）。表各酵母菌胞內(nèi)含量調(diào)查嘲對實驗室保藏的株不同類型的菌進(jìn)行含量檢測后發(fā)現(xiàn)，相對其余種細(xì)菌，只有有較高的含量?！翱诔趯τ嘀昃臧麅?nèi)含量的檢測后發(fā)現(xiàn)，胞內(nèi)含量高于的菌株只出現(xiàn)在酵母菌中，其中胞內(nèi)含量最高的是一組。此外，通過乙硫氨酸的抗性篩選，也分離得到一株富集的乳糖利用型突變菌株。而用其他種類菌株高產(chǎn)的報道相對較少。本研究發(fā)現(xiàn)，熱帶假絲酵母（）的胞內(nèi)含量也相對較高，這為以后的研究提供了更多的可選菌種。四川師范大學(xué)碩士畢業(yè)論文圖菌株￥的顯徽照片（）￥（×）一腺苷甲硫氨酸高產(chǎn)菌株的誘變選育乙硫氨酸抗性菌株的篩選乙硫氨酸抗性菌株的初篩為了確定原始菌株￥對乙硫氨酸的抗性水平，分別將其涂布于含有，和一乙硫氨酸的抗性篩選固體培養(yǎng)基上。與多