高效液相色譜法測(cè)定大氣顆粒物中的雜環(huán)胺

1、高效液相色譜法測(cè)定大氣顆粒物中的雜環(huán)胺         11-04-22 16:13:00     編輯：studa20                   作者：董雪玲劉大錳 高少鵬【摘要】  建立了大氣顆粒物中雜環(huán)胺的高效液相色譜檢測(cè)方法。采用ODS C18色譜柱(250 mm

2、5;4.6 mm， 5 m)，乙腈0.01 mol/L三乙胺緩沖溶液(pH 4.0 )為流動(dòng)相，非線性梯度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫30 ，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)263 nm，并優(yōu)化熒光激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)條件，實(shí)現(xiàn)了6種雜環(huán)胺的基線分離和4種雜環(huán)胺的高靈敏度熒光檢測(cè)。本方法中熒光和紫外檢測(cè)器的檢出限分別為0.00180.0084 mg/L和0.0930.609 mg/L(S/N=3)，相關(guān)系數(shù)在0.99200.9999之間，RSD小于5.9%，平均回收率為75.3%111.6%，回收率相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7%2.3%，具有較高的精確度和準(zhǔn)確度。 【關(guān)鍵詞】  雜環(huán)胺，高效液相色譜法，大氣顆

3、粒物           1 引 言雜環(huán)胺(Heterocyclic amines，HAs)是一類在肉類、家禽、魚類等食物烹調(diào)加工時(shí)產(chǎn)生的具有致突變性和致癌性的化合物1。其致癌性比黃曲霉毒素、亞硝酸胺高幾十倍，也遠(yuǎn)高于苯并(a)芘(BaP)。大多數(shù)雜環(huán)胺已被證明可致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物多種器官的癌變(如肝癌、腸癌、肺癌、乳腺癌、皮膚癌、口腔癌和胃癌等)2。國(guó)外自20世紀(jì)70年代開始陸續(xù)出現(xiàn)雜環(huán)胺的研究報(bào)道，多集于食物方面35，并且已從烹調(diào)食品中分離鑒定了近20種雜環(huán)胺，但含量極低(以ng/g計(jì))5。文獻(xiàn)68

4、報(bào)道，HAs還存在于大氣顆粒物、雨水、土壤、香煙煙霧、柴油機(jī)排放顆粒物、垃圾處理廠焚燒的飛灰中，這些事實(shí)充分說明這類物質(zhì)可能是普遍存在的環(huán)境污染物，并由各種物質(zhì)如食物、垃圾、木材、草、石油等燃燒形成。隨著人們對(duì)環(huán)境中致突變和致癌性物質(zhì)健康效應(yīng)和環(huán)境效應(yīng)的逐漸關(guān)注，HAs的形成及影響因素9、暴露水平及評(píng)價(jià)10、生物標(biāo)志物11,12、生物活性13、作用機(jī)理14,15、降解與活化16等各方面的研究日益深入。為了評(píng)價(jià)HAs對(duì)人類的潛在危險(xiǎn)性，分離和檢測(cè)食品和環(huán)境樣品中的HAs非常重要。鑒于樣品的復(fù)雜成分及HAs的痕量水平，通過色譜技術(shù)進(jìn)行分析成為了較好的研究手段。目前，對(duì)HAs研究的方法主要有氣相色譜

5、質(zhì)譜法(GCMS)、液相色譜質(zhì)譜法(LCMS)和高效液相色譜法(HPLC)等17,18。GCMS被認(rèn)為是分析HAs最靈敏的技術(shù)，但是許多雜環(huán)胺屬極性、難揮發(fā)的物質(zhì)，需要衍生為低極性化合物才利于吸收，而目前提出的?；?、烷基化、硅烷化等衍生化技術(shù)大多處于發(fā)展階段19，限制了該方法的推廣。LCMS已成功應(yīng)用于大多數(shù)HAs的檢測(cè)，但LCMS需要繁雜和/或昂貴的儀器，許多實(shí)驗(yàn)室達(dá)不到要求，故也有用液相色譜熒光光譜法(LCFL)20和液相色譜電化學(xué)法(LCED)21分析HAs的研究報(bào)道。相比較而言，HPLC成為分析HAs的較為理想的檢測(cè)手段。因所有HAs都具有紫外吸收光譜和電化學(xué)氧化性，一部分還有熒光特

6、性，可用紫外(UV)、電化學(xué)(ED)或熒光(FL)檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)22,23。雜環(huán)胺的大多數(shù)定量分析方法是基于HPLCUV，對(duì)于具有熒光的HAs，采用FL和UV聯(lián)用，有助于排除干擾，提高定性分析的準(zhǔn)確性。我國(guó)自20世紀(jì)80年代開展了食物中HAs的研究，但僅有極少報(bào)道24,25，而對(duì)于環(huán)境樣品中HAs的分析一直處于空白階段。本研究利用高效液相色譜熒光紫外串聯(lián)技術(shù)對(duì)已報(bào)道在環(huán)境樣品中含量較高的6種HAs進(jìn)行了分析，建立了快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確檢測(cè)大氣顆粒物PM10中HAs的高效液相色譜法，為開展雜環(huán)胺的相關(guān)研究提供了參考。2 實(shí)驗(yàn)部分2.1 儀器與試劑Aglient 1100型高效液相色譜儀、紫外檢測(cè)器(

7、VWD)和熒光檢測(cè)器(FLD)、Agilent 化學(xué)色譜工作站(美國(guó)Aglient公司);pH3C型精密pH計(jì)(上海雷磁儀器廠);十萬分之一電子天平(德國(guó)Sartorius公司);RE52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)。6種雜環(huán)胺(純度>99%，加拿大 Toronto Research Chemicals公司)，其名稱、結(jié)構(gòu)及美國(guó)化學(xué)文摘服務(wù)登陸號(hào)(CAS) 見表1;乙腈、二氯甲烷、三乙胺(TEA)和H3PO4(色譜純，美國(guó) Dima Technology 公司);正己烷、甲醇及三氯甲烷 (北京化工廠);Al2O3 (100120目，在馬弗爐中400 烘4 h )和層析硅膠(6080

8、目，在馬弗爐中150 烘4 h) 為分析純。水為二次蒸餾水。表1 雜環(huán)胺標(biāo)樣的名稱、分子量及結(jié)構(gòu)2.2 樣品采集與前處理樣品采集使用PM10PM2.5型顆粒物采樣器(北京迪克機(jī)電技術(shù)有限公司)，校正流速77.49 L/min，流量誤差5 %，采樣時(shí)間72 h，檢出限為0.09 g/m3。采樣用的玻璃纖維濾膜( 90 mm，使用前于馬弗爐500 灼燒2 h ) 在采樣前后用天平準(zhǔn)確稱量，質(zhì)量差即為顆粒物重量，然后濾膜放入冰箱避光、冷凍(-20 )保存。大氣顆粒物中有機(jī)質(zhì)的提取參照文獻(xiàn)26并加以改進(jìn)。將采樣濾膜用二次精餾的三氯甲烷索氏抽提72 h，提取液濃縮至4 mL左右，轉(zhuǎn)移，吹干，放入干燥器中

9、干燥并恒重，然后添加正己烷濾去不溶的瀝青質(zhì)。濾液濃縮后移至硅膠 Al2O3層析柱中，分別用正己烷、正己烷二氯甲烷(12，V/V)、乙醇三氯甲烷依次沖淋出飽和烴、芳烴和非烴組分。各組分進(jìn)一步濃縮、吹干，于-20 冷凍保存。野外空白和實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)空白中主要污染物為鄰苯二甲酸酯，但不影響待測(cè)物的分析。2.3 溶液配制精密稱取6種HAs標(biāo)準(zhǔn)品各1.0 mg，分別用乙腈溶解定容至10 mL，配成濃度為0.1 g/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，將儲(chǔ)備液采用逐級(jí)稀釋法配成一系列濃度的混合標(biāo)樣。用二次蒸餾水將1.39 mL三乙胺定容至1000 mL，并用H3PO4調(diào)節(jié)pH值。將冷凍保存的非烴樣品取出，放置至室溫，用1 mL乙腈

10、溶解，配制成一定濃度的溶液，待上機(jī)分析。2.4 色譜條件Aglient ODS C18色譜柱( 250 mm×4.6 mm， 5 m );流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.01 mol/L三乙胺(H3PO4調(diào)節(jié)pH=4.0)緩沖液，非線性梯度淋洗，優(yōu)化后的梯度淋洗程序見表2。柱溫： 30 ;流速：1 mL/min;進(jìn)樣體積：20 L。紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：263 nm。表2 梯度洗脫程序3 結(jié)果與討論3.1 色譜條件的確定3.1.1 流動(dòng)相的選擇 采用乙腈0.01 mol/L三乙胺(H3PO4調(diào)節(jié)pH=3.4)為二元流動(dòng)相。向流動(dòng)相中加入少許堿性物質(zhì)(三乙胺)，可消除拖尾影響，縮短保留時(shí)間，提高

11、譜峰的對(duì)稱性?？疾炝薞(乙腈)V(H3PO4三乙胺)=595， 1090， 2080， 3070， 4060及5050的情況。隨著乙腈比例提高，保留時(shí)間縮短，峰形得到改善，但6種HAs無法分離;而當(dāng)配比低于1090時(shí)，主峰變寬，分離效果下降。鑒于6種HAs化學(xué)結(jié)構(gòu)、性質(zhì)以及在色譜柱中的保留時(shí)間相近，確定非線性梯度淋洗，優(yōu)化后的梯度淋洗程序見表2，在此條件下AC和MeAC已完全分離，IQ與MeIQ基本分離(分離度R=1.91)，PhIP和TrpP2未完全分離，但已獲得較好分離效果，故以此條件作為下一步實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。3.1.2 pH值的選擇 將H3PO4TEA緩沖溶液的pH值分別設(shè)為3.0，3.4，

12、3.8，4.0和4.4，結(jié)果表明：當(dāng)pH=3.0時(shí)，各HAs的保留時(shí)間前移，較低的pH值有助于減小氨基化合物與硅膠表面硅羥基的作用，使峰形更尖銳。在此情況下，IQ與MeIQ的分離度為1.68，但PhIP和TrpP2不能有效分離，在FLD上合為一個(gè)峰。逐步提高pH值，PhIP和 TrpP2間分離度增大(表3)。當(dāng)pH=4.4 時(shí)，PhIP和TrpP2已達(dá)到完全基線分離，但各峰的峰形變寬，靈敏度下降。綜合考慮，選擇pH=4.0的H3PO4TEA緩沖溶液。表3 pH值對(duì)PhIP和TrpP2分離的影響3.1.3 流動(dòng)相流速的選擇 流動(dòng)相的流速對(duì)各物質(zhì)的保留時(shí)間有較大影響。分別設(shè)定流速為0.5， 1.0和1.5 mL/min。結(jié)果表明，隨著流速增加，柱壓增高，保留時(shí)間縮短，但分離度降低。綜合考慮分離度、保留時(shí)間和峰形等因素，流動(dòng)相的流速定為1.0 mL/min，6種物質(zhì)在20 min內(nèi)即可完成分離。3.1.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 由于IQ與MeIQ不能發(fā)射熒光，而其它4種HAs能夠發(fā)射熒光，故采用熒光紫外串聯(lián)檢測(cè)，保證6種組分均能定量分析，同時(shí)雙檢測(cè)器有助于排除干擾，提高準(zhǔn)確性。經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，確定紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為263