細菌內(nèi)毒素檢測方法驗證

1、細菌內(nèi)毒素檢測方法驗證方案一般內(nèi)毒素的驗證包括：1 鱟試劑靈敏度的驗證， 目的是復核鱟試劑的靈敏度，如果使用國家標準品，必須與USP標準品進行確認2 干擾實驗，衡量樣品是否有干擾，將標準品加入到樣品溶液中系列樣品加入鱟試劑是否有影響將內(nèi)毒素標準加入不同樣品濃度3 樣品測試稀釋輩數(shù)的確認4 結果判斷起 草 人 起草日期 審 核 人 審核日期 批 準 人 批準日期 細菌內(nèi)毒素檢測方法驗證方案目的-范圍-責任人-內(nèi)容-1.實驗材料及用具-2 實驗準備-3.具體驗證步驟-3.1. 鱟試劑靈敏度復核-3.2.干擾實驗-3.3.供試品細菌內(nèi)毒素檢查-4. 驗證結論-附：表1.鱟試劑靈敏度復核記錄表2. 干

2、擾試驗記錄表3.細菌內(nèi)毒素檢查記錄細菌內(nèi)毒素檢測方法驗證方案目的：為確保鹽酸羅哌卡因一水合物細菌內(nèi)毒素檢測方法的專屬性、靈敏度，保證檢測結果可符合質量標準要求，特制定此方案。范圍：鹽酸羅哌卡因一水合物細菌內(nèi)毒素檢測方法責任人：細菌內(nèi)毒素檢驗員、QC主管內(nèi)容：1.實驗材料及用具1.1. 電子天平1.2. 電熱干燥箱1.3. 恒溫水浴箱1.4.水銀溫度計1.5. 旋渦混合器1.6. 鱟試劑應提供供應商，批號，規(guī)格等信息（具有國家主管部門的批準文號）1.7.細菌內(nèi)毒素工作標準品如果使用國家標準品，必須增加國家標準品與USP標準品的對應變化確認，即他們具有相同的變化趨勢(由中國藥品生物制品檢定所統(tǒng)一發(fā)

3、放的標準品)1.8.細菌內(nèi)毒素檢查用水1.9. 實驗用具:移液管、凝集管、三角瓶、試管、試管架、洗耳球、時鐘、75%酒精棉、剪刀、砂輪。2 實驗準備2.1. 玻璃器皿的洗滌將玻璃器皿放入鉻酸洗液或其他熱原滅活劑或清洗液中充分浸泡，然后取出將洗液空干，用自來水將殘留洗液徹底洗凈，再用蒸餾水反復沖洗三遍以上，空干后放入適宜的密閉金屬容器中或用錫箔紙包好后再放入金屬容器內(nèi)，放置入烤箱。2.2. 除去玻璃器皿表面可能存在的外源性內(nèi)毒素玻璃器皿置烤箱后，將烤箱調至250，待烤箱溫度升至設定的溫度后開始計時，干烤至少1 小時。達到規(guī)定時間后，關斷電源，待烤箱溫度自然降至室溫。在不打開金屬容器的情況下，可在

4、兩天內(nèi)使用；如果玻璃器皿用錫箔紙包裝，在不打開包裝的情況下可在兩周內(nèi)使用，否則須再次干烤除去可能存在的外源性內(nèi)毒素。3.具體驗證步驟3.1. 鱟試劑靈敏度復核3.1.1. 實驗操作3.1.1.1.細菌內(nèi)毒素標準溶液的制備USP和CP標準的等效性取細菌內(nèi)毒素工作標準品一支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開，啟開過程中應防止玻璃屑落入瓶內(nèi)。按照標準品說明書，加入規(guī)定量的細菌內(nèi)毒素檢查用水溶解其內(nèi)容物，用封口膜將瓶口封嚴，置旋渦混合器上混合15分鐘。然后進行稀釋，制備成4個濃度的細菌內(nèi)毒素標準溶液，即2、0.5、0.25（為所復核的鱟試對的標示靈敏度）

5、，每稀釋一步均應在旋渦混合器上混合30 秒鐘。3.1.1.2.待復核鱟試劑的準備取規(guī)格為0.1ml/ 支的鱟試劑18支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開備用，防止玻璃屑落入瓶內(nèi)。每支加入0.1ml 檢查用水溶解，輕輕轉動瓶壁，使內(nèi)容物充分溶解，避免產(chǎn)生氣泡。3.1.1.3.加樣將已充分溶解的待復核鱟試劑18支（管）放在試管架上，排成5列，其中4列4支（管），1列2支（管）。4 支（管）4 列每列每支分別加入0.1ml 的2、0.5、和0.25的內(nèi)毒素標準溶液；另2支（管）加入0.1ml檢查用水。3.1.1.4.加樣結束后，將鱟試劑用封口膜封口，輕輕振動混

6、勻，避免產(chǎn)生氣泡，連同試管架放入37±1水浴或適宜恒溫器中，試管架保持水平狀態(tài)，保溫60±2 分鐘。3.1.1.5. 觀察并記錄結果。將試管架從水浴中輕輕取出，避免振動，將每管拿出緩緩倒轉180°觀察，管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形，不從管壁滑脫者為陽性，記錄為（+）；未形成凝膠或凝膠不能保持完整并從管壁滑脫者為陰性，記錄為（）3.1.2. 實驗結果計算如最大濃度2.04管均為陽性，最低濃度0.254管均為陰性，陰性對照為陰性時實驗為有效，按下式計算反應終點濃度的幾何平均值即為鱟試劑靈敏度的復核結果（c）。 c = lg-1 (X/4)式中x為反應終點濃度的對數(shù)值（

7、lg）。反應終點濃度是系列遞減的內(nèi)毒素標準溶液中最后一個呈陽性結果的濃度。3.1.3結果判斷3.1.3.1.判斷標準當c在0.52（包括0.5和2）時判定該批鱟試劑靈敏度復核合格，可用于干擾實驗和供試品細菌內(nèi)毒素檢查，并以（標示靈敏度）為該批鱟試劑的靈敏度。3.1.3.2.判斷結果：（記錄附后） 3.2.干擾實驗3.2.1. 操作方法3.2.1.1.目的是檢驗在某一濃度下的供試品對于鱟試劑與內(nèi)毒素的反應有無干擾作用。使用的供試品溶液應為未檢驗出內(nèi)毒素且不超過所使用的鱟試劑的最大有效稀釋倍數(shù)的溶液。3.2.1.2.制備內(nèi)毒素標準對照溶液取1支細菌內(nèi)毒素標準品，用細菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成4個濃度的

8、標準溶液即2、0.5、0.25（方法同3.1.1.1.）。3.2.2.3.制備含內(nèi)毒素的供試品溶液將供試品稀釋至預實驗中確定的不干擾稀釋倍數(shù)，再用此稀釋液將3.2.3.1.中的同支細菌內(nèi)毒素標準品稀釋成4個濃度即2、0.5、0.25的含內(nèi)毒素的供試品溶液。3.2.2.4.鱟試劑的準備取規(guī)格為0.1ml/支的鱟試劑36支，輕彈壁使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開備用，防止玻璃屑落入瓶內(nèi)。每支加入0.1ml檢查用水溶解，輕輕轉動瓶壁，使內(nèi)容物充分溶解，避免產(chǎn)生氣泡。3.2.2.5.加樣將準備好的鱟試劑取其中18支（管）放在試管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管

9、）。其中的4支4列每列每支分別加入0.1ml的2.0、1.0、0.5、0.25的內(nèi)毒素標準溶液，另一列2支（管）加入0.1ml檢查用水作為陰性對照。將另外18支（管）鱟試劑放在試管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。其中的4支4列每列每支分別加入0.1ml的含2.0、1.0、0.5、0.25的內(nèi)毒素的供試品溶液，另一列2支（管）加入0.1ml供試品溶液作為樣品陰性對照。加樣結束后，用封口膜封口，輕輕振動混勻，避免產(chǎn)生氣泡，連同試管架放入37±1水浴或適宜恒溫器中，保溫60±2分鐘后，觀察并記錄結果。3.2.3.實驗結果計算如兩組最大濃度2.0均為陽性，最低濃度0

10、.25均為陰性，陰性對照, 管均為陰性時，按下式計算用檢查用水制成的內(nèi)毒素標準溶液的反應終點濃度的幾何平均值(Es)和用供試品溶液或稀釋液制成的內(nèi)毒素溶液的反應終點濃度的幾何平均值(Et).Es= lg-1 (Xs/4)Et= lg-1 (Xt/4)Xs、Xt分別為用檢查用水和供試品溶液或稀釋液制成的內(nèi)毒素溶液的反應終點濃度的對數(shù)值（lg）。3.2.4.結果判斷3.2.4.1.判斷標準當Es在0.52.0（包括0.5和2.0）時，且Et在0.5 Es2.0Es（包括0.5 Es和2.0Es）時，則認為供試品在該濃度下不干擾實驗，可在該濃度下對此供試品進行細菌內(nèi)毒素檢查。當Et不在0.5 Es2

11、.0Es（包括0.5 Es和2.0Es）時，則認為供試品在該濃度下干擾實驗。3.2.4.2.判斷結果：（記錄附后） 。3.3.供試品細菌內(nèi)毒素檢查在細菌內(nèi)毒素檢查中，每批供試品必須做2支供試品管和2支供試品陽性對照，同時每次實驗必須做2支陽性對照和2支陰性對照。3.3.1.操作方法3.3.1.1.供試品溶液的制備：（稀釋倍數(shù)不得超過MVD） 3.3.1.2. 陽性對照溶液的制備用檢查用水將內(nèi)毒素標準品稀釋制成2濃度的內(nèi)毒素標準溶液（方法同3.1.1.1.）。3.3.1.3.供試品陽性對照溶液的制備用待檢測的供試品溶液或其稀釋液將內(nèi)毒素標準品制成2濃度的內(nèi)毒素溶液。（方法同3.2.1.3.2.

12、供試品陽性對照溶液的制備）。3.3.1.4.陰性對照液用細菌內(nèi)毒素檢查用水3.3.1.5.鱟試劑的準備取規(guī)格為0.1ml/支的鱟試劑8支，輕彈瓶壁使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開備用，防止玻璃屑落入瓶內(nèi)。每支加入0.1ml檢查用水溶解，輕輕轉動瓶壁，使內(nèi)容物充分溶解，避免產(chǎn)生氣泡。3.3.1.6.加樣取8支（管）溶解好的鱟試劑，其中2支加入0.1ml供試品溶液或其稀釋液（其稀釋倍數(shù)不得超過MVD需要提供具體稀釋要求）作為供試品管，2支加入0.1ml陽性對照溶液作為陽性對照管（PC），2支加入0.1ml檢查用水作為陰性對照管（NC），2支加入0.1ml供試品陽性對照

13、溶液作為供試品陽性對照管（PPC）。3.3.1.7.將試管中溶液輕輕混勻后，用封口膜封閉管口，垂直放入37±1水浴或適宜恒溫器中，保溫60±2分鐘。保溫和取放試管過程應避免受到振動造成假陰性結果。3.3.2. 結果判斷3.3.2.1.判斷標準當陽性對照都為陽性、供試品陽性對照都為陽性且陰性對照都為陰性時，實驗有效。若供試品2管均為陰性，認為該供試品符合規(guī)定；如供試品2 管均為陽性，應認為不符合規(guī)定；如2 管中1管為陽性，1 管為陰性，按上述方法另取4支供試品管復試，4管中如有1管為陽性，即認為不符合規(guī)定。若第一次實驗時供試品的稀釋倍數(shù)小于MVD而結果出現(xiàn)2 管均為陽性或2管

14、中1管為陽性時，按同樣方法復試，復試時要求將其稀釋至MVD。3.3.2.2.判斷結果：（記錄附后） 4.驗證結論 附：表1鱟試劑靈敏度復核記錄檢驗目的檢驗日期檢驗依據(jù)室溫試劑名稱生產(chǎn)單位批號靈敏度/效價規(guī)格鱟試劑EU/ml細菌內(nèi)毒素標準品EU/支細菌內(nèi)毒素檢查用水實驗操作標準品稀釋：反應結果保溫時間（ ）內(nèi)毒素濃度EU/ml2 0.5 0.25（ ）（ ）（ ） （ ）陰性對照終點濃度結果計算結果判斷檢驗人員校對人員表2干擾試驗記錄檢品名稱檢驗日期生產(chǎn)單位室溫供樣單位規(guī)格批號包裝檢驗依據(jù)內(nèi)毒素限度試劑名稱生產(chǎn)單位批號靈敏度/效價規(guī)格鱟試劑EU/ml細菌內(nèi)毒素標準品EU/支細菌內(nèi)毒素檢查用水實驗操作1.標準品稀釋：2. 供試品制備：3. 含供試品內(nèi)毒素溶液的制備：反應結果保溫時間（ ）內(nèi)毒素濃度EU/ml2 0.5 0.25（ ）（ ）（ ） （ ）陰性對照終點濃