蛋白質(zhì)含量測(cè)定

1、蛋白質(zhì)的定量分析是生物化學(xué)和其他生命學(xué)蛋白質(zhì)的定量分析是生物化學(xué)和其他生命學(xué)科最常涉及的分析內(nèi)容，是臨床上診斷疾科最常涉及的分析內(nèi)容，是臨床上診斷疾病及檢查康復(fù)情況的重要指標(biāo)，也是許多病及檢查康復(fù)情況的重要指標(biāo)，也是許多生物制品，藥物、食品質(zhì)量檢測(cè)的重要指生物制品，藥物、食品質(zhì)量檢測(cè)的重要指標(biāo)。在生化實(shí)驗(yàn)中，對(duì)樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)標(biāo)。在生化實(shí)驗(yàn)中，對(duì)樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確可靠的定量分析，則是經(jīng)常進(jìn)行的行準(zhǔn)確可靠的定量分析，則是經(jīng)常進(jìn)行的一項(xiàng)非常重要的工作。一項(xiàng)非常重要的工作。 目前測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法有很多種，目前測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法有很多種，下面列出根據(jù)蛋白質(zhì)不同性質(zhì)建立的一些蛋下面列出根據(jù)蛋白

2、質(zhì)不同性質(zhì)建立的一些蛋白質(zhì)測(cè)定方法：白質(zhì)測(cè)定方法： 物理性質(zhì)：物理性質(zhì)：紫外分光光度法紫外分光光度法。 化學(xué)性質(zhì)：凱氏定氮法、化學(xué)性質(zhì)：凱氏定氮法、雙縮脲法雙縮脲法、Lowry法法等。等。 染色性質(zhì)：考馬斯亮藍(lán)染色法、銀染法。染色性質(zhì)：考馬斯亮藍(lán)染色法、銀染法。 其他性質(zhì)：熒光法。其他性質(zhì)：熒光法。 掌握蛋白質(zhì)含量測(cè)定的原理和方法掌握蛋白質(zhì)含量測(cè)定的原理和方法 學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 熟練使用分光光度計(jì)、紫外分光光熟練使用分光光度計(jì)、紫外分光光度計(jì)。度計(jì)。（一）雙縮脲法雙縮脲法（二）（二） LowryLowry法法（三）（三）紫外分光光度法紫外分光光度法 蛋白質(zhì)和雙縮脲一樣，在堿

3、性溶液蛋白質(zhì)和雙縮脲一樣，在堿性溶液中能與銅離子形成紫色絡(luò)合物（雙中能與銅離子形成紫色絡(luò)合物（雙縮脲反應(yīng)），且其呈色深淺與蛋白縮脲反應(yīng)），且其呈色深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。質(zhì)的定量測(cè)定。 但必須注意，此反應(yīng)并非蛋但必須注意，此反應(yīng)并非蛋白質(zhì)所特有，凡分子內(nèi)有兩個(gè)或白質(zhì)所特有，凡分子內(nèi)有兩個(gè)或兩個(gè)以上的肽鍵的化合物以及分兩個(gè)以上的肽鍵的化合物以及分子內(nèi)有子內(nèi)有H H2 2NCHNCHNH -CHNH -CH2 2- -NH2NH2等結(jié)構(gòu)化合物，雙縮脲反應(yīng)等結(jié)構(gòu)化合物，雙縮脲反應(yīng)也呈陽(yáng)性。也呈陽(yáng)性。 1分光光度計(jì)分光光度計(jì) 2試劑試劑（1）

4、標(biāo)準(zhǔn)牛血清清蛋白溶液）標(biāo)準(zhǔn)牛血清清蛋白溶液 10 mg/ml（2）雙縮脲試劑：）雙縮脲試劑： 1.取12支試管分成兩組，編號(hào)，分別加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml標(biāo)準(zhǔn)牛血清清蛋白溶液 ,用水補(bǔ)足到1ml。 2.加入雙縮脲試劑4 ml，混勻。室溫放置30 min。 3.以管1（空白管）調(diào)零，在540 nm的波長(zhǎng)下進(jìn)行比色，分別記錄各管的吸光度讀數(shù)。 4.取兩組平均值，以蛋白含量為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 5.用同樣方法測(cè)定未知樣品。 蛋白含量蛋白含量 （1）預(yù)熱儀器 將選擇開關(guān)置于“T”，打開電源開關(guān)，使儀器預(yù)熱20分鐘。為了防止光電管疲勞，不要連續(xù)光照，預(yù)熱

5、儀器時(shí)和不測(cè)定時(shí)應(yīng)將試樣室蓋打開，使光路切斷。（2）選定波長(zhǎng) 根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，轉(zhuǎn)動(dòng)波長(zhǎng)手輪，調(diào)至所需要的單色波長(zhǎng)。 （3）固定靈敏度檔 在能使空白溶液很好地調(diào)到“100%”的情況下，盡可能采用靈敏度較低的擋，使用時(shí)，首先調(diào)到“1”擋，靈敏度不夠時(shí)再逐漸升高。但換擋改變靈敏度后，須重新校正“0%”和“100%”。選好的靈敏度，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不要再變動(dòng)。（4）調(diào)節(jié)T=0% 輕輕旋動(dòng)“0%”旋鈕，使數(shù)字顯示為“00.0”，（此時(shí)試樣室是打開的）。 （5）調(diào)節(jié)T=100% 將盛蒸餾水（或空白溶液，或純?nèi)軇┑谋壬蠓湃氡壬笞苤械牡谝桓駜?nèi)，并對(duì)準(zhǔn)光路，把試樣室蓋子輕輕蓋上，調(diào)節(jié)透過(guò)率“100%”旋鈕，使數(shù)

6、字顯示正好為“100.0”。 （6）吸光度的測(cè)定 將選擇開關(guān)置于“A”，蓋上試樣室蓋子，將空白液置于光路中，調(diào)節(jié)吸光度調(diào)節(jié)旋鈕，使數(shù)字顯示為“.000”。將盛有待測(cè)溶液的比色皿放入比色皿座架中的其它格內(nèi)，蓋上試樣室蓋，輕輕拉動(dòng)試樣架拉手，使待測(cè)溶液進(jìn)入光路，此時(shí)數(shù)字顯示值即為該待測(cè)溶液的吸光度值。讀數(shù)后，打開試樣室蓋，切斷光路。重復(fù)上述測(cè)定操作1-2次，讀取相應(yīng)的吸光度值，取平均值。 （7）濃度的測(cè)定 選擇開關(guān)由“A”旋置“C”，將已標(biāo)定濃度的樣品放入光路，調(diào)節(jié)濃度旋鈕，使得數(shù)字顯示為標(biāo)定值，將被測(cè)樣品放入光路，此時(shí)數(shù)字顯示值即為該待測(cè)溶液的濃度值。（8）關(guān)機(jī) 實(shí)驗(yàn)完畢，切斷電源，將比色皿取出

7、洗凈，并將比色皿座架用軟紙擦凈。 （1）為了防止光電管疲勞，不測(cè)定時(shí)必須將試樣室蓋打開，使光路切斷，以延長(zhǎng)光電管的使用壽命。（2）取拿比色皿時(shí)，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，而不能碰比色皿的光學(xué)表面。（3）比色皿不能用堿溶液或氧化性強(qiáng)的洗滌液洗滌，也不能用毛刷清洗。比色皿外壁附著的水或溶液應(yīng)用擦鏡紙或細(xì)而軟的吸水紙吸干，不要擦拭，以免損傷它的光學(xué)表面。(4)不要混淆石英比色皿和玻璃比色皿，應(yīng)分開放置。 【思考題】【思考題】 1、干擾本實(shí)驗(yàn)的因素有哪些？、干擾本實(shí)驗(yàn)的因素有哪些？ 2、是否所有的肽和蛋白質(zhì)都能和硫酸銅的堿、是否所有的肽和蛋白質(zhì)都能和硫酸銅的堿性溶液發(fā)生雙縮脲反應(yīng)？性溶液發(fā)生雙縮脲

8、反應(yīng)？ 3、簡(jiǎn)述蛋白質(zhì)含量測(cè)定在科研及臨床疾病診、簡(jiǎn)述蛋白質(zhì)含量測(cè)定在科研及臨床疾病診斷上的應(yīng)用。斷上的應(yīng)用。蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)呈色試劑呈色試劑: 還原型還原型 蛋白質(zhì)與酚試劑呈色蛋白質(zhì)與酚試劑呈色深淺深淺與蛋白質(zhì)的與蛋白質(zhì)的含量含量成正比成正比，利用蛋白質(zhì)的濃度與呈，利用蛋白質(zhì)的濃度與呈色的關(guān)系，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，來(lái)測(cè)定樣色的關(guān)系，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，來(lái)測(cè)定樣品中的蛋白質(zhì)含量。品中的蛋白質(zhì)含量。 本法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、較紫外吸收法靈敏1020倍，較雙縮脲法靈敏100倍。其不足之處是此反應(yīng)受多種因素干擾。 1器材：分光光度計(jì)器材：分光光度計(jì) 2試劑試劑 試劑甲：試劑甲： 4碳酸鈉碳酸鈉+0.2mol

9、/L氫氧化鈉（氫氧化鈉（50） 1硫酸銅硫酸銅+2酒石酸鉀鈉酒石酸鉀鈉 （1） 試劑乙：試劑乙：Folin氏試劑氏試劑 用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液（濃度為（濃度為250250g/ml）配成一系列不同）配成一系列不同濃度的蛋白質(zhì)溶液。濃度的蛋白質(zhì)溶液。 取取1414支試管分成兩組，編號(hào)，按下表支試管分成兩組，編號(hào)，按下表操作操作 編號(hào)編號(hào) 1 2 3 4 5 6 7蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量（g）標(biāo)準(zhǔn)液標(biāo)準(zhǔn)液(ml)生理鹽水生理鹽水ml)試劑甲試劑甲(ml) 25 50 100 150 200 250 空白空白 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0

10、0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 / 1.0 5 5 5 5 5 5 5 混勻，置混勻，置2025水浴十分鐘，冷卻至室溫水浴十分鐘，冷卻至室溫試劑乙試劑乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 立即振搖，立即振搖，室溫放置三十分鐘室溫放置三十分鐘在波長(zhǎng)在波長(zhǎng)500nm500nm條件下比色條件下比色, ,測(cè)定其光密度值。以測(cè)定其光密度值。以空白管調(diào)零空白管調(diào)零. . 以蛋白質(zhì)的含量（以蛋白質(zhì)的含量（gg）為橫坐標(biāo)，光）為橫坐標(biāo)，光密度值（密度值（ODOD）為縱坐標(biāo)，繪制出蛋白）為縱坐標(biāo)，繪制出蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 根據(jù)樣品中的根據(jù)樣品中的OD500,

11、OD500, 從蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲從蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線中找到樣品中蛋白質(zhì)的線中找到樣品中蛋白質(zhì)的gg數(shù)。數(shù)。 測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度最好在測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度最好在25100g之間，故血清稀釋倍數(shù)一般為之間，故血清稀釋倍數(shù)一般為200500。各管加酚試劑應(yīng)快，必須立即混勻，各管加酚試劑應(yīng)快，必須立即混勻，否則就會(huì)出現(xiàn)渾濁。否則就會(huì)出現(xiàn)渾濁。 2、繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線：要求規(guī)范作圖、繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線：要求規(guī)范作圖 鉛筆作圖、鉛筆作圖、 橫、縱坐標(biāo)名稱及單位橫、縱坐標(biāo)名稱及單位 日期、作者日期、作者 、曲線名稱、曲線名稱 曲線上體現(xiàn)出待測(cè)樣品的曲線上體現(xiàn)出待測(cè)樣品的OD值及值及 ug數(shù)。數(shù)。 3、計(jì)算：、計(jì)算：100ml樣品

12、中的蛋白質(zhì)含量。樣品中的蛋白質(zhì)含量。 要求：要求： 寫出公式、代入數(shù)據(jù)、寫出結(jié)果。寫出公式、代入數(shù)據(jù)、寫出結(jié)果。1、 原始數(shù)據(jù)原始數(shù)據(jù):各管的各管的OD值值 分析實(shí)驗(yàn)誤差產(chǎn)生的原因分析實(shí)驗(yàn)誤差產(chǎn)生的原因 總結(jié)該方法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的優(yōu)缺點(diǎn)。總結(jié)該方法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的優(yōu)缺點(diǎn)。 由于蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此蛋白質(zhì)具有吸收紫外線的性質(zhì)，吸收高峰在280 nm波長(zhǎng)處。在此波長(zhǎng)范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值(OD280)與其含量呈正比關(guān)系，可用作定量測(cè)定。 利用紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的優(yōu)點(diǎn)是迅速、簡(jiǎn)便、不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測(cè)定。 1器材：器材：U-1800紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì) 2試劑試劑 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液1.1.標(biāo)準(zhǔn)曲線制定：取標(biāo)準(zhǔn)曲線制定：取8 8支試管，編號(hào)，分別加