第四章離心技術(shù)

1、第四章 離心技術(shù) 作作 者者: 王王 英英 聯(lián)系電話聯(lián)系電話:心技術(shù)離心技術(shù)（centrifugal techniquecentrifugal technique） 根據(jù)根據(jù)物質(zhì)物質(zhì)在作在作圓周勻速運(yùn)動(dòng)圓周勻速運(yùn)動(dòng)時(shí)受時(shí)受到一個(gè)到一個(gè)外向離心力外向離心力的作用發(fā)展起來(lái)的的作用發(fā)展起來(lái)的一種一種分離、分析技術(shù)分離、分析技術(shù)。離心離心技術(shù)技術(shù)的應(yīng)用的應(yīng)用1.1.工業(yè)生產(chǎn)工業(yè)生產(chǎn)食品、化工、制藥等食品、化工、制藥等，轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)速107 200 4105 60000 2/dtdrs 2sddt )(ln1minmax221sttt顆粒沉降到某處所用時(shí)間顆粒沉降到某處所用時(shí)間2mi

2、n11)()ln(1053.2RPMRRKman K值是轉(zhuǎn)頭的一個(gè)特性指標(biāo)，它的值是轉(zhuǎn)頭的一個(gè)特性指標(biāo)，它的大小可以衡量轉(zhuǎn)頭離心效率的高低大小可以衡量轉(zhuǎn)頭離心效率的高低. 七、七、K值值 K K值越小，轉(zhuǎn)頭的效率越高。值越小，轉(zhuǎn)頭的效率越高。 在離心管允許不加滿的情況下，在離心管允許不加滿的情況下，可以通過(guò)減少離心管內(nèi)樣品量，降可以通過(guò)減少離心管內(nèi)樣品量，降低低k k值，縮短離心時(shí)間。值，縮短離心時(shí)間。轉(zhuǎn)頭的轉(zhuǎn)頭的K K值可以查表得到值可以查表得到 1、在離心時(shí)估算沉降時(shí)間。在離心時(shí)估算沉降時(shí)間。t ：離心時(shí)間（小時(shí)）。：離心時(shí)間（小時(shí)）。K ：實(shí)際轉(zhuǎn)速下的轉(zhuǎn)頭：實(shí)際轉(zhuǎn)速下的轉(zhuǎn)頭K值。值。S

3、：粒子的沉降系數(shù)。粒子的沉降系數(shù)。 K值的應(yīng)用值的應(yīng)用SKt 2、從一個(gè)轉(zhuǎn)頭換成另一個(gè)轉(zhuǎn)頭時(shí)估、從一個(gè)轉(zhuǎn)頭換成另一個(gè)轉(zhuǎn)頭時(shí)估算沉降時(shí)間算沉降時(shí)間( (根據(jù)文獻(xiàn)資料根據(jù)文獻(xiàn)資料, ,使用現(xiàn)有的轉(zhuǎn)使用現(xiàn)有的轉(zhuǎn)頭頭, ,建立實(shí)驗(yàn)條件建立實(shí)驗(yàn)條件) )。1212KKtt2121KKtt 利用已知轉(zhuǎn)頭的實(shí)驗(yàn)條件利用已知轉(zhuǎn)頭的實(shí)驗(yàn)條件, ,使用另一個(gè)轉(zhuǎn)頭使用另一個(gè)轉(zhuǎn)頭, ,分離相同樣品時(shí)分離相同樣品時(shí), ,如何確定實(shí)驗(yàn)條件。如何確定實(shí)驗(yàn)條件。 3、同一轉(zhuǎn)頭，改變離心轉(zhuǎn)速時(shí)，、同一轉(zhuǎn)頭，改變離心轉(zhuǎn)速時(shí)，計(jì)算離心時(shí)間。計(jì)算離心時(shí)間。2*21*12121222121RCFtRCFtttRPMRPMttKK（一）

4、低速離心機(jī)（一）低速離心機(jī) 第二節(jié)第二節(jié) 離離 心心 機(jī)機(jī) 實(shí)驗(yàn)室中常用于分實(shí)驗(yàn)室中常用于分離制備。離制備。 最高轉(zhuǎn)速在最高轉(zhuǎn)速在6,000rpm6,000rpm以下。以下。 轉(zhuǎn)速和溫度控制不轉(zhuǎn)速和溫度控制不夠準(zhǔn)確夠準(zhǔn)確 。一、制備離心機(jī)一、制備離心機(jī) 制冷設(shè)備溫度控制在制冷設(shè)備溫度控制在0-40-4范圍內(nèi)。范圍內(nèi)。 實(shí)際速度和溫度可通過(guò)儀表顯示。實(shí)際速度和溫度可通過(guò)儀表顯示。 配有一定類型及規(guī)格的轉(zhuǎn)子。配有一定類型及規(guī)格的轉(zhuǎn)子。 常用于生物大分子的分離制備常用于生物大分子的分離制備 。（二）高速冷凍離心機(jī)（二）高速冷凍離心機(jī) 最高轉(zhuǎn)速最高轉(zhuǎn)速在在25,000rpm25,000rpm以下。以下

5、。 轉(zhuǎn)速在轉(zhuǎn)速在50,000以上以上 驅(qū)動(dòng)和速度控制驅(qū)動(dòng)和速度控制 溫度控制溫度控制 真空系統(tǒng)真空系統(tǒng) 轉(zhuǎn)子系統(tǒng)轉(zhuǎn)子系統(tǒng) 常用于分離亞細(xì)胞器、病毒粒子、常用于分離亞細(xì)胞器、病毒粒子、DNADNA、RNARNA和蛋白質(zhì)分子。和蛋白質(zhì)分子。 （三）超速離心機(jī)（三）超速離心機(jī) 類型類型普通離心機(jī)普通離心機(jī)高速離心機(jī)高速離心機(jī)超速離心機(jī)超速離心機(jī)最大轉(zhuǎn)速最大轉(zhuǎn)速(rpm)6,00025,00030,000以上以上最大最大RCF(g)6,00089,000可達(dá)可達(dá)510,000以上以上分離形式分離形式差速離心差速離心差速離心差速離心密度梯度區(qū)帶分離密度梯度區(qū)帶分離或差速沉降分離或差速沉降分離離心管平衡離

6、心管平衡允許誤差允許誤差0.25克克0.1克克0.1克克轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)子角式和外擺式角式和外擺式轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)子角式，外擺式轉(zhuǎn)子等角式，外擺式轉(zhuǎn)子等角式，外擺式，區(qū)帶轉(zhuǎn)角式，外擺式，區(qū)帶轉(zhuǎn)子等子等儀器結(jié)構(gòu)、儀器結(jié)構(gòu)、性能和特點(diǎn)性能和特點(diǎn)速度控制不嚴(yán)速度控制不嚴(yán)格，多數(shù)室格，多數(shù)室溫下操作溫下操作有致冷裝置，有較準(zhǔn)有致冷裝置，有較準(zhǔn)確速度和溫度控確速度和溫度控制系統(tǒng)制系統(tǒng)有真空和冷卻系統(tǒng)，精有真空和冷卻系統(tǒng)，精確的溫度和速度控制、確的溫度和速度控制、監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，保證轉(zhuǎn)子監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，保證轉(zhuǎn)子正常運(yùn)轉(zhuǎn)的傳動(dòng)和制正常運(yùn)轉(zhuǎn)的傳動(dòng)和制動(dòng)裝置。動(dòng)裝置。應(yīng)用應(yīng)用收集易沉降的大收集易沉降的大顆粒顆粒(如如RBC，酵母細(xì)胞等酵母細(xì)胞

7、等)收集微生物、細(xì)胞碎片、收集微生物、細(xì)胞碎片、大細(xì)胞、硫酸銨沉大細(xì)胞、硫酸銨沉淀物和免疫沉淀物淀物和免疫沉淀物等。但不能有效沉等。但不能有效沉淀病毒、小細(xì)胞器淀病毒、小細(xì)胞器(如核糖體如核糖體)、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)等大分子等大分子主要分離細(xì)胞器，病毒，核主要分離細(xì)胞器，病毒，核酸蛋白質(zhì)，多糖等甚至酸蛋白質(zhì)，多糖等甚至能分開分子量相近的同能分開分子量相近的同位素標(biāo)記物位素標(biāo)記物15NDNA和和未標(biāo)記的未標(biāo)記的DNA 轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)頭(Rotor)(Rotor) 1 1、固定角式轉(zhuǎn)頭、固定角式轉(zhuǎn)頭(fixed-angle rotor)(fixed-angle rotor) 2 2、水平式轉(zhuǎn)頭、水平式轉(zhuǎn)頭(s

8、wing-out rotor)(swing-out rotor) 3 3、區(qū)帶轉(zhuǎn)頭、區(qū)帶轉(zhuǎn)頭(zonal rotor)(zonal rotor) 4 4、垂直式轉(zhuǎn)頭、垂直式轉(zhuǎn)頭(vertical rotor) (vertical rotor) 5 5、連續(xù)轉(zhuǎn)頭、連續(xù)轉(zhuǎn)頭(continuous rotor) (continuous rotor) 轉(zhuǎn)頭的材質(zhì)：轉(zhuǎn)頭的材質(zhì)：鋁鋁 質(zhì)質(zhì) 較輕較輕, ,耐受強(qiáng)度較弱耐受強(qiáng)度較弱, ,適合在較低適合在較低 的轉(zhuǎn)速下使用的轉(zhuǎn)速下使用; ;不銹鋼不銹鋼 耐受強(qiáng)度最好耐受強(qiáng)度最好, ,但材質(zhì)本身太重；但材質(zhì)本身太重； 鈦合金鈦合金 耐受強(qiáng)度較好耐受強(qiáng)度較好, ,

9、重量輕。重量輕。 1.1.固定角式轉(zhuǎn)頭固定角式轉(zhuǎn)頭 離心管在離心機(jī)中放置的位置與旋轉(zhuǎn)離心管在離心機(jī)中放置的位置與旋轉(zhuǎn)軸心形成一個(gè)固定的角度軸心形成一個(gè)固定的角度, ,角度變化在角度變化在14-14-4040之間。之間。 常見(jiàn)的角度常見(jiàn)的角度 2020 28 28 34 34 40 40 角式轉(zhuǎn)頭的特點(diǎn)：角式轉(zhuǎn)頭的特點(diǎn)： （1 1）重心低）重心低, ,轉(zhuǎn)速可較高轉(zhuǎn)速可較高 （2 2）樣品粒子穿過(guò)溶劑層的距離略）樣品粒子穿過(guò)溶劑層的距離略大于離心管的直徑大于離心管的直徑; ; （3 3）“管壁效應(yīng)管壁效應(yīng)” ” ：有一定的角度：有一定的角度, , 在離心過(guò)程中撞到離心管外壁的粒子沿在離心過(guò)程中撞到

10、離心管外壁的粒子沿著管壁滑到管底形成沉淀著管壁滑到管底形成沉淀, , 此效應(yīng)使最此效應(yīng)使最后在管底聚成的沉淀較緊密。后在管底聚成的沉淀較緊密。 設(shè)設(shè)40000rpm40000rpm時(shí)時(shí) R1R1最小、最小、 3.8cm3.8cm R2R2平均、平均、 5.9cm5.9cm R3R3最大、最大、 8.1cm8.1cm RCFRCF值分別值分別 67,910g 67,910g 105,400g105,400g 144,700g144,700g 2. 2.水平轉(zhuǎn)頭水平轉(zhuǎn)頭 （1 1）轉(zhuǎn)子靜止時(shí)）轉(zhuǎn)子靜止時(shí), ,離心管與旋轉(zhuǎn)軸平行。離心管與旋轉(zhuǎn)軸平行。 （2 2）轉(zhuǎn)子旋轉(zhuǎn)加速時(shí)）轉(zhuǎn)子旋轉(zhuǎn)加速時(shí), ,離

11、心管由平行位置離心管由平行位置逐漸過(guò)渡到垂直位置逐漸過(guò)渡到垂直位置, ,即與旋轉(zhuǎn)軸成即與旋轉(zhuǎn)軸成9090角角, , （3 3）粒子的沉淀方向同旋轉(zhuǎn)半徑方向基）粒子的沉淀方向同旋轉(zhuǎn)半徑方向基本一致，幾乎沒(méi)有本一致，幾乎沒(méi)有“管壁效應(yīng)管壁效應(yīng)” ” 水平轉(zhuǎn)頭的特點(diǎn)：水平轉(zhuǎn)頭的特點(diǎn)：（1 1）轉(zhuǎn)子的重心位置較高）轉(zhuǎn)子的重心位置較高 （2 2）樣品粒子沉降穿過(guò)溶劑層的距離大）樣品粒子沉降穿過(guò)溶劑層的距離大于直徑于直徑（3 3）對(duì)于多種成分樣品分離特別有效）對(duì)于多種成分樣品分離特別有效 （4 4）常用于速率區(qū)帶離心和等密度離心）常用于速率區(qū)帶離心和等密度離心3.3.垂直轉(zhuǎn)頭垂直轉(zhuǎn)頭 離心管垂直插入轉(zhuǎn)子孔

12、內(nèi)離心管垂直插入轉(zhuǎn)子孔內(nèi), ,在離心過(guò)程在離心過(guò)程中始終與旋轉(zhuǎn)軸平行中始終與旋轉(zhuǎn)軸平行, ,而離心時(shí)液層發(fā)生而離心時(shí)液層發(fā)生9090角的變化角的變化, ,從開始的水平方向改成垂直從開始的水平方向改成垂直方向方向, ,當(dāng)轉(zhuǎn)子降速時(shí)當(dāng)轉(zhuǎn)子降速時(shí), ,垂直分布的液層又逐漸垂直分布的液層又逐漸趨向水平趨向水平, ,待旋轉(zhuǎn)停止后待旋轉(zhuǎn)停止后, ,液面又完全恢復(fù)成液面又完全恢復(fù)成水平方向。水平方向。 離心管主要用聚丙烯塑料和不銹鋼制成，塑料離離心管主要用聚丙烯塑料和不銹鋼制成，塑料離心管的優(yōu)點(diǎn)是透明，硬度小，可用穿刺法取出梯度。心管的優(yōu)點(diǎn)是透明，硬度小，可用穿刺法取出梯度。缺點(diǎn)是抗有機(jī)溶劑腐蝕性差，使用壽

13、命短。缺點(diǎn)是抗有機(jī)溶劑腐蝕性差，使用壽命短。 不銹鋼管強(qiáng)度大，不變形，抗熱，抗凍，抗化學(xué)不銹鋼管強(qiáng)度大，不變形，抗熱，抗凍，抗化學(xué)腐蝕。但用時(shí)也應(yīng)避免接觸強(qiáng)腐蝕性的化學(xué)藥品，如腐蝕。但用時(shí)也應(yīng)避免接觸強(qiáng)腐蝕性的化學(xué)藥品，如強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等。強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等。 塑料離心管都有管蓋，離心前管蓋必須蓋嚴(yán)，倒塑料離心管都有管蓋，離心前管蓋必須蓋嚴(yán)，倒置不漏液。管蓋有三種作用：置不漏液。管蓋有三種作用： 防止樣品外泄。防止樣品外泄。 防止樣品揮發(fā)。防止樣品揮發(fā)。 支持離心管，防止離心管變形。支持離心管，防止離心管變形。離離 心心 管管: : 根據(jù)離心原理根據(jù)離心原理, ,按照實(shí)際工作的按照實(shí)際工作的需要，目前常

14、用的離心方法大致可需要，目前常用的離心方法大致可分成兩類分成兩類: :二、分析離心機(jī)（自學(xué)）二、分析離心機(jī)（自學(xué)）1 1、第三節(jié)離心分離方法第三節(jié)離心分離方法原原 理理 ： 利用不同的粒子在離心力場(chǎng)中沉降速度利用不同的粒子在離心力場(chǎng)中沉降速度的不同的不同, ,通過(guò)不斷增加轉(zhuǎn)速（相對(duì)離心力）通過(guò)不斷增加轉(zhuǎn)速（相對(duì)離心力）, ,使使各組分粒子分次沉淀。此法也稱分級(jí)離心法。各組分粒子分次沉淀。此法也稱分級(jí)離心法。 操作過(guò)程是在離心后把上清液傾倒出與操作過(guò)程是在離心后把上清液傾倒出與沉淀物分開沉淀物分開, ,然后將上清液加大轉(zhuǎn)速離心然后將上清液加大轉(zhuǎn)速離心, ,分離分離出第二部分沉淀物出第二部分沉淀物

15、, ,如此往復(fù)加大轉(zhuǎn)速如此往復(fù)加大轉(zhuǎn)速, ,逐級(jí)分逐級(jí)分離出所需要的物質(zhì)。離出所需要的物質(zhì)。( (一一) ) 差速離心法差速離心法 Differential velocity centrifugationDifferential velocity centrifugation 差速離心的分辨率不高差速離心的分辨率不高, ,沉淀系數(shù)在沉淀系數(shù)在同一個(gè)數(shù)量級(jí)內(nèi)的各種粒子不容易分開。同一個(gè)數(shù)量級(jí)內(nèi)的各種粒子不容易分開。 差速離心常用于其他分離手段之前粗差速離心常用于其他分離手段之前粗制品的提取。制品的提取。 例：用差速離心法分離已破碎的細(xì)胞各組份例：用差速離心法分離已破碎的細(xì)胞各組份 已破碎的細(xì)胞已

16、破碎的細(xì)胞 500g,10500g,10分鐘分鐘 沉淀沉淀 上清液上清液 ( (細(xì)胞核）細(xì)胞核） 10,000g,1010,000g,10分鐘分鐘 沉淀沉淀 上清液上清液 ( (細(xì)胞膜碎片細(xì)胞膜碎片, ,線粒體線粒體, ,溶酶體溶酶體) 100,000g,3) 100,000g,3小時(shí)小時(shí) 沉淀沉淀 上清液上清液 ( (核蛋白體）核蛋白體） ( (可溶性成份可溶性成份) )( (二二) ) 密度離心密度離心(isopyniccentrifugation) (isopyniccentrifugation) 1 1、速率區(qū)帶離心法、速率區(qū)帶離心法 原原 理：理： 先在離心管內(nèi)分層加好密度梯度介質(zhì)先

17、在離心管內(nèi)分層加好密度梯度介質(zhì)（不同濃度蔗糖、甘油等）（不同濃度蔗糖、甘油等）, ,將待分離的樣將待分離的樣品加在介質(zhì)液面上然后進(jìn)行離心。在離心力品加在介質(zhì)液面上然后進(jìn)行離心。在離心力作用下，各組分粒子沉降到各密度梯度液相作用下，各組分粒子沉降到各密度梯度液相應(yīng)的位置而彼此被分開應(yīng)的位置而彼此被分開, ,在密度梯度不同的在密度梯度不同的液層內(nèi)形成系列區(qū)帶。液層內(nèi)形成系列區(qū)帶。 原原 理理： 將樣品和預(yù)先配制好的密度梯度液將樣品和預(yù)先配制好的密度梯度液（含被分離樣品中所有粒子的密度）混（含被分離樣品中所有粒子的密度）混合后合后, ,加入離心管進(jìn)行離心，密度梯度液加入離心管進(jìn)行離心，密度梯度液受離

18、心力的作用逐漸形成從管底濃到管受離心力的作用逐漸形成從管底濃到管口稀的密度梯度口稀的密度梯度, ,與此同時(shí)樣品粒子也隨與此同時(shí)樣品粒子也隨之發(fā)生位移，最后粒子移動(dòng)到相等密度之發(fā)生位移，最后粒子移動(dòng)到相等密度的位置不再移動(dòng)，而彼此被分開。的位置不再移動(dòng)，而彼此被分開。2 2、等密梯度離心法、等密梯度離心法密度離心法注意要點(diǎn)：密度離心法注意要點(diǎn)：1 1、用水平式轉(zhuǎn)頭、用水平式轉(zhuǎn)頭2 2、粒子密度相近時(shí)不宜用、粒子密度相近時(shí)不宜用3 3、離心好后不能用剎車、離心好后不能用剎車4 4、此法離心時(shí)間較長(zhǎng)，十幾到幾十、此法離心時(shí)間較長(zhǎng)，十幾到幾十小時(shí)，要注意觀察溫度。小時(shí)，要注意觀察溫度。 3 3、常用的

19、梯度材料：、常用的梯度材料：（1 1）糖類糖類: : 蔗糖、聚蔗糖、右旋糖酐等蔗糖、聚蔗糖、右旋糖酐等（2 2）鹽類鹽類:CsCl(:CsCl(氯化銫氯化銫) )、CsCs2 2soso4 4、 NaClNaCl等等（3 3）有機(jī)碘化物有機(jī)碘化物: :三碘苯甲酰匍萄糖胺等三碘苯甲酰匍萄糖胺等 （4 4）硅溶膠硅溶膠: Percoll: Percoll。（5 5）蛋白質(zhì)蛋白質(zhì): :牛血清白蛋白牛血清白蛋白 4 4、各梯度材料的應(yīng)用范圍、各梯度材料的應(yīng)用范圍 （1 1）蔗糖）蔗糖: : 水溶性大，性質(zhì)穩(wěn)定，滲透壓較高，水溶性大，性質(zhì)穩(wěn)定，滲透壓較高， 最高密度可達(dá)最高密度可達(dá)1.33g/ml,1.

20、33g/ml,價(jià)格低，容易制備價(jià)格低，容易制備, , 常用于細(xì)胞器、病毒、常用于細(xì)胞器、病毒、RNARNA分離的梯度材料分離的梯度材料 ， 滲透壓較大不宜用于細(xì)胞的分離。滲透壓較大不宜用于細(xì)胞的分離。 2. 2.聚蔗糖（聚蔗糖（ 商品名商品名FicollFicoll）：）： 滲透壓低，粘度卻特別高滲透壓低，粘度卻特別高, ,為此常與泛影葡為此常與泛影葡胺混合使用以降低粘度，用于分離各種細(xì)胞胺混合使用以降低粘度，用于分離各種細(xì)胞包括血細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、鼠肝包括血細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、鼠肝細(xì)胞細(xì)胞 。 （3 3）氯化銫）氯化銫: : 水溶性大，最高密度可達(dá)水溶性大，最高密度可達(dá)1.

21、91g/ml,1.91g/ml,形成形成的梯度有較好的分辨率，被廣泛用于質(zhì)粒、病的梯度有較好的分辨率，被廣泛用于質(zhì)粒、病毒、毒、DNADNA和脂蛋白的分離，價(jià)格較貴。和脂蛋白的分離，價(jià)格較貴。 （4 4）鹵化鹽類）鹵化鹽類: : KBr KBr和和NaClNaCl可用于脂蛋白分離，可用于脂蛋白分離，KIKI和和NaINaI可用于可用于RNARNA分離分離, ,其分辨率高于銫鹽，其分辨率高于銫鹽， NaClNaCl可用于分離脂蛋白，可用于分離脂蛋白，NaINaI可分離天然或變性的可分離天然或變性的DNADNA。 （ 5 5 ）Percoll:Percoll: SiO SiO2 2膠體外面包了一層聚乙烯吡咯酮，膠體外面包了一層聚乙烯吡咯酮，滲透壓低，對(duì)生物材料的影響小，顆粒穩(wěn)定，滲透壓低，對(duì)生物材料的影響小，顆粒穩(wěn)定，在冷卻和凍融情況下還是穩(wěn)定的，粘度高，在冷卻和凍融情況下還是穩(wěn)定的，粘度高，在酸性