第1講基因工程導(dǎo)論應(yīng)用和安全性管理2012

1、生 物 工 程微生物工程微生物工程基基 因因 工工 程程細(xì)細(xì) 胞胞 工工 程程酶酶 工工 程程 學(xué)科誕生的學(xué)科誕生的理論和技術(shù)基礎(chǔ)理論和技術(shù)基礎(chǔ) 基因工程的基因工程的概念和研究內(nèi)容概念和研究內(nèi)容 基因工程的基因工程的應(yīng)用和發(fā)展應(yīng)用和發(fā)展 基因工程的基因工程的研究動態(tài)研究動態(tài) 2020世紀(jì)世紀(jì)4040年代，年代，O.T.AveryO.T.Avery發(fā)現(xiàn)生物遺傳信息的化發(fā)現(xiàn)生物遺傳信息的化學(xué)本質(zhì)是學(xué)本質(zhì)是DNADNA而非而非protein(protein(肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗) ) 20 20世紀(jì)世紀(jì)5050年代，年代，Watson-CrickWatson-Crick提出提出DNADN

2、A的的雙螺旋雙螺旋結(jié)構(gòu)模型結(jié)構(gòu)模型；半保留復(fù)制機(jī)理半保留復(fù)制機(jī)理；解決了基因的自我復(fù)；解決了基因的自我復(fù)制和傳遞問題制和傳遞問題 20 20世紀(jì)世紀(jì)6060年代，相繼提出年代，相繼提出“中心法則中心法則”和和操縱子操縱子學(xué)說學(xué)說, , 成功破譯遺傳密碼成功破譯遺傳密碼4 43 3，闡明遺傳信息的流向，闡明遺傳信息的流向和表達(dá)問題和表達(dá)問題 如何從生物體龐大的雙鏈DNA分子中將所需要的 基因片段切割下來； 如何將所切割下來的DNA片段進(jìn)行繁殖擴(kuò)增； 如何將所獲得的基因片段重新進(jìn)行連接。 “基因剪刀基因剪刀”限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶 19701970年年 H.O.SmithH.O.Smith和和K

3、.W.KhoranaK.W.Khorana在流感嗜血桿在流感嗜血桿菌菌(Haemophilus inffuenzae)(Haemophilus inffuenzae)中分離純化了第中分離純化了第1 1個個核酸限制性內(nèi)切酶核酸限制性內(nèi)切酶HindHind 1972 1972年年 H.W.BoyerH.W.Boyer實(shí)驗室首先發(fā)現(xiàn)實(shí)驗室首先發(fā)現(xiàn)EcoRI EcoRI 核酸核酸內(nèi)切酶內(nèi)切酶 19701970年年 BaltimoveBaltimove和和TeminTemin等同時各自發(fā)現(xiàn)了等同時各自發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶，完善了遺傳學(xué)中心法則，使真核基因的，完善了遺傳學(xué)中心法則，使真核基因的制備成為可

4、能制備成為可能1 1、真核基因組龐大而復(fù)雜，基因圖譜不易制得，、真核基因組龐大而復(fù)雜，基因圖譜不易制得，2 2、基因多有內(nèi)含子，不能在原核表達(dá)系統(tǒng)剪接出、基因多有內(nèi)含子，不能在原核表達(dá)系統(tǒng)剪接出成熟的成熟的mRNAmRNA，難以獲得相應(yīng)的產(chǎn)物，難以獲得相應(yīng)的產(chǎn)物，逆轉(zhuǎn)錄酶的用途：逆轉(zhuǎn)錄酶的用途： mRNA cDNA (mRNA cDNA (complementory DNAcomplementory DNA）構(gòu)建文庫構(gòu)建文庫 、分離目的基因分離目的基因 19671967年年 世界上世界上5 5個實(shí)驗室?guī)缀跬瑫r發(fā)現(xiàn)個實(shí)驗室?guī)缀跬瑫r發(fā)現(xiàn)DNADNA連接酶連接酶：該酶該酶參與參與DNADNA單鏈裂口

5、單鏈裂口(gap)(gap)或缺口或缺口(nick)(nick)的修復(fù)的修復(fù)，連接連接DNADNA分子的自由末端分子的自由末端 19701970年年 WisconsinWisconsin大學(xué)大學(xué) H.G.KhoranaH.G.Khorana實(shí)驗室發(fā)現(xiàn)實(shí)驗室發(fā)現(xiàn)T4 DNAT4 DNA連接酶連接酶 活性更高，能催化完全分離的兩段活性更高，能催化完全分離的兩段DNADNA分子進(jìn)行平末端的連接分子進(jìn)行平末端的連接 早期載體工作的研究對象：早期載體工作的研究對象：噬菌體噬菌體； 側(cè)重于研究病毒和寄主細(xì)菌間的關(guān)系側(cè)重于研究病毒和寄主細(xì)菌間的關(guān)系19461946年年 L.BergL.Berg研究細(xì)菌性因子

6、研究細(xì)菌性因子(F(F因子因子),),50-6050-60年代年代 相繼發(fā)現(xiàn)抗藥性相繼發(fā)現(xiàn)抗藥性R R因子：分子量小，因子：分子量小， 具有抗藥性選擇標(biāo)記和易于操作等優(yōu)點(diǎn)具有抗藥性選擇標(biāo)記和易于操作等優(yōu)點(diǎn)19731973年年 S.CohenS.Cohen將質(zhì)粒作為基因工程載體使用將質(zhì)粒作為基因工程載體使用 2020世紀(jì)世紀(jì)4040年代年代 AveryAvery發(fā)現(xiàn)外源發(fā)現(xiàn)外源DNADNA分子導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)分子導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象胞的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象( (肺炎鏈球菌實(shí)驗，發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌實(shí)驗，發(fā)現(xiàn)DNADNA是遺傳信息的是遺傳信息的攜帶者而非蛋白質(zhì)攜帶者而非蛋白質(zhì)) ) 19701970年年 MandelM

7、andel和和HigaHiga發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌的細(xì)胞大腸桿菌的細(xì)胞經(jīng)過經(jīng)過氯化鈣的適當(dāng)處理后，便氯化鈣的適當(dāng)處理后，便能夠吸收能夠吸收噬菌體的噬菌體的DNADNA 19721972年以后，大腸桿菌成為分子克隆的良好受體年以后，大腸桿菌成為分子克隆的良好受體 2020世紀(jì)世紀(jì)7070年代的上述發(fā)現(xiàn)，從技術(shù)層面上年代的上述發(fā)現(xiàn)，從技術(shù)層面上解決了用基因工程改良生物的實(shí)際問題，解決了用基因工程改良生物的實(shí)際問題，最終促成了基因工程學(xué)科的誕生最終促成了基因工程學(xué)科的誕生 1972年，美國斯坦福大學(xué)年，美國斯坦福大學(xué)P.Berg等在等在PNAS上發(fā)上發(fā)表了題為表了題為 “Biochemical me

8、thode for inserting new genetic information into DNA of Simian Virus 40: circular SV40 DNA molecules cotaining lamda phage genes and the galactose operon of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2904-2909, 1972”，標(biāo)志著基因工程，標(biāo)志著基因工程技術(shù)的誕生技術(shù)的誕生 1972 1972年，美國斯坦福大學(xué)年，美國斯坦福大學(xué) P.BergP.Berg博士等博士等 用用E.c

9、oRE.coR酶切猿猴病毒酶切猿猴病毒SV40 DNASV40 DNA和和phageDNAphageDNA后，后， 用用T4 DNAT4 DNA連接酶將兩種消化片段連接成重組體分子連接酶將兩種消化片段連接成重組體分子 意義：意義：世界上第一次成功的世界上第一次成功的DNADNA體外重組實(shí)驗體外重組實(shí)驗 雖然雖然Berg的工作具有劃時代的意義，但是他們并的工作具有劃時代的意義，但是他們并沒有證明體外重組的沒有證明體外重組的DNA分子具有生物學(xué)功能分子具有生物學(xué)功能1973年，年，S.N.Cohen等在等在PNAS上發(fā)表文章上發(fā)表文章“Construction of Biologically Fu

10、nctional Bacterial Plasmid In Vitro” （S. N. Cohen, A. C. Y. Chang, H. W. Borer, and R. B. Helling, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70:3240-3244, 1973）宣布體外構(gòu)建的細(xì)菌質(zhì)粒能夠在細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，宣布體外構(gòu)建的細(xì)菌質(zhì)粒能夠在細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，完善了完善了Berg開創(chuàng)的基因重組技術(shù)開創(chuàng)的基因重組技術(shù) Cohen Cohen的貢獻(xiàn)：的貢獻(xiàn)： 19731973年年, , 斯坦福大學(xué)斯坦福大學(xué) S.N.Cohen S.N.Cohen 等將等將E.coliE.coli的

11、的 R6-5R6-5質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA：編碼：編碼卡那霉素卡那霉素（kanamycin）抗性基因抗性基因 pSC101pSC101質(zhì)粒：編碼質(zhì)粒：編碼四環(huán)素四環(huán)素（tetracycline）抗性基因抗性基因 體外切割體外切割并并連接連接成重組體分子，成重組體分子，轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化E.coliE.coli，篩選篩選出了具雙抗抗性的菌落出了具雙抗抗性的菌落, ,實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌遺傳性狀的轉(zhuǎn)移實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌遺傳性狀的轉(zhuǎn)移中國的胰島素生產(chǎn)之路：中國的胰島素生產(chǎn)之路：19981998年，中國成功研發(fā)出具有自主知識產(chǎn)權(quán)的年，中國成功研發(fā)出具有自主知識產(chǎn)權(quán)的基因基因重組人胰島素重組人胰島素。世界上三個能生產(chǎn)世界上三個能生產(chǎn)

12、基因重組人胰島素基因重組人胰島素的國家：美國、的國家：美國、丹麥和中國丹麥和中國19821982年，第一個基因工程藥物在美國批準(zhǔn)上市：年，第一個基因工程藥物在美國批準(zhǔn)上市：基因重組人胰島素基因重組人胰島素 （通化東寶通化東寶- -甘舒霖甘舒霖：9595年開始研發(fā)，年開始研發(fā)，9898年成功，年成功，20082008年規(guī)年規(guī)模生產(chǎn)，亞洲最大）模生產(chǎn)，亞洲最大）徐州萬邦？徐州萬邦？ 基因（基因（genegene）是遺傳學(xué)家約翰（）是遺傳學(xué)家約翰（W.JohannsenW.Johannsen） 在在19091909年提出來的，年提出來的，他用基因這一名詞來表示遺傳的獨(dú)立單位，相當(dāng)于孟德爾在豌豆試驗他

13、用基因這一名詞來表示遺傳的獨(dú)立單位，相當(dāng)于孟德爾在豌豆試驗中提出的遺傳因子中提出的遺傳因子孟德爾的遺傳因子階段；孟德爾的遺傳因子階段；摩爾根的基因階段；摩爾根的基因階段；順反子階段；順反子階段；現(xiàn)代基因階段現(xiàn)代基因階段（操縱子、移動、假、斷裂、重疊基因操縱子、移動、假、斷裂、重疊基因）基因基因 (gene)(gene) 核酸分子中儲存遺傳信息的遺傳單位，包括核酸分子中儲存遺傳信息的遺傳單位，包括編碼功能蛋白質(zhì)或編碼功能蛋白質(zhì)或RNARNA序列信息及表達(dá)這些信息序列信息及表達(dá)這些信息所必需的全部核苷酸序列所必需的全部核苷酸序列 基因工程基因工程(genetic engineering)：“重組D

14、NA技術(shù)” 將外源基因通過體外重組后，導(dǎo)入受體細(xì)胞，將外源基因通過體外重組后，導(dǎo)入受體細(xì)胞，使該基因在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)的現(xiàn)使該基因在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)的現(xiàn)代生物技術(shù)代生物技術(shù)目的：目的：獲得由外源基因所編碼的蛋白質(zhì)獲得由外源基因所編碼的蛋白質(zhì) 改變受體生物的遺傳性狀改變受體生物的遺傳性狀, ,創(chuàng)造新的生命創(chuàng)造新的生命特點(diǎn)特點(diǎn): : 分子水平操作，細(xì)胞水平表達(dá)分子水平操作，細(xì)胞水平表達(dá)基因工程實(shí)施的基因工程實(shí)施的 4 4 個要素：個要素： 工具酶工具酶 載體載體 基因基因 受體細(xì)胞受體細(xì)胞基基因因工工程程的的操操作作流流程程 基礎(chǔ)研究基礎(chǔ)研究：針對基因工程技術(shù)的操作流程

15、：針對基因工程技術(shù)的操作流程 應(yīng)用研究應(yīng)用研究：基因工程藥物、轉(zhuǎn)基因植物、：基因工程藥物、轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因動物、酶制劑工業(yè)、食品工業(yè)、化轉(zhuǎn)基因動物、酶制劑工業(yè)、食品工業(yè)、化學(xué)與能源工業(yè)及環(huán)境保護(hù)等。學(xué)與能源工業(yè)及環(huán)境保護(hù)等。 基因工程的基因工程的安全性研究安全性研究1 1、基因工程載體、基因工程載體：核心環(huán)節(jié)；核心環(huán)節(jié)； 適于高等動植物基因的適于高等動植物基因的表達(dá)載體和定位整合載體表達(dá)載體和定位整合載體有待大力開發(fā)；有待大力開發(fā)；2 2、基因工程工具酶、基因工程工具酶： DNADNA的體外合成、切割、修飾和連接等一系列過程中需要的酶；的體外合成、切割、修飾和連接等一系列過程中需要的酶；3 3、基因工程新技術(shù)、基因工程新技術(shù)：特殊用途的特殊用途的PCRPCR技術(shù)、電泳技術(shù)、轉(zhuǎn)化技技術(shù)、電泳技術(shù)、轉(zhuǎn)化技術(shù)（如基因槍和電激儀）；術(shù)（如基因槍和電激儀）；4 4、基因工程受體系統(tǒng)、基因工程受體系統(tǒng)：原核生物大腸桿菌、藍(lán)細(xì)菌、酵母菌、原核生物大腸桿菌、藍(lán)細(xì)菌、酵母菌、高等植物的部分組織和器官、動物的生殖細(xì)胞或胚細(xì)胞高等植物的部分組織和器官、動物的生殖細(xì)胞或胚細(xì)胞- -體細(xì)胞、體細(xì)胞、人的