發(fā)酵工程原理與_江南大學(xué)-陳堅-7

1、種子擴(kuò)大培養(yǎng)：是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜 面活化后，在經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級放大培養(yǎng)而獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。這些 純種培養(yǎng)物稱為種子。發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)過程中的種子的必須滿足以下條件：(1) 菌種細(xì)胞的生長活力強(qiáng)，移種至發(fā)酵罐后能迅速生長，遲緩期短;(2) 生理形狀穩(wěn)定；(3) 菌體總量及濃度能滿足大容量發(fā)酵罐的要求；(4) 無雜菌污染；(5) 保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力。第一節(jié)種子的制備過程在發(fā)酵生產(chǎn)過程中，種子制備的過程大致可分為兩個階段：(1) 實(shí)驗室種子制備階段(2) 生產(chǎn)車間種子制備階段醫(yī)tn fr干擴(kuò)黃之井濁耳円1-KltTW*-*! »

2、; -4皿電資電一那亀敘|血斑窗武黒: 、一&子氏外曲堆転：£一2琳堆7刼并，7>t-/HH®¥ S一、實(shí)驗室種子的制備實(shí)驗室種子的制備一般米用兩種方式：對于產(chǎn)孢子能力強(qiáng)的及孢子發(fā)芽、生長繁殖快的菌種可以采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)孢子，孢子可直接作為種子罐的種子，這樣操作簡便，不易污染雜菌。對于產(chǎn)孢子能力不強(qiáng)或孢子發(fā)芽慢 的菌種，可以用液體培養(yǎng)法。(一)孢子的制備1, 細(xì)菌孢子的制備細(xì)菌的斜面培養(yǎng)基多采用碳源限量而氮源豐富的配方。培養(yǎng)溫度一般為37 C。細(xì)菌菌體培養(yǎng)時間一般為12天，產(chǎn)芽孢的細(xì)菌培養(yǎng)則需要510天。2, 霉菌孢子的制備霉菌孢子的培養(yǎng)一般以大米

3、、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為培養(yǎng)基。培養(yǎng)的溫 度一般為2528 C。培養(yǎng)時間一般為 414天。3, 放線菌孢子的制備放線菌的孢子培養(yǎng)一般采用瓊脂斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有一些適合產(chǎn)孢子的營養(yǎng)成分，如麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些無機(jī)鹽等。培養(yǎng)溫度一般為28C。培養(yǎng)時間為514天。（二）液體種子制備1 ，好氧培養(yǎng)對于產(chǎn)孢子能力不強(qiáng)或孢子發(fā)芽慢的菌種，如產(chǎn)鏈霉素的灰色鏈霉菌（S. griseus）、產(chǎn)卡那霉素的卡那鏈霉菌（S. Kan amuceticus ）可以用搖瓶液體培養(yǎng)法。將孢子接入含液體培養(yǎng)基的搖 瓶中，于搖瓶機(jī)上恒溫振蕩培養(yǎng)，獲得菌絲體，作為種子。其過程如下：試管t三角瓶t搖床t

4、種子罐2，厭氧培養(yǎng)對于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等） ，其種子的制備過程如下：試管T三角瓶T卡式罐T種子罐例如生產(chǎn)啤酒的酵母菌一般保存在麥芽汁瓊脂或 MYPG 培養(yǎng)基（培養(yǎng)基配制： 3 克麥芽浸 出物，3克酵母浸出物，5克蛋白胨，10克葡萄糖和20克瓊脂與升水中）的斜面上，于4C冰箱內(nèi)保藏。每年移種3-4次。將保存的酵母菌種接入含 10ml麥芽汁的500-1000ml三角瓶中，再 于25C培養(yǎng)2-3天后，再擴(kuò)大至含有 250-500ml麥芽汁的500-1000ml三角瓶中，再于25C培養(yǎng) 2天后，移種至含有5-10L麥芽汁的卡氏培養(yǎng)罐中，于15-20 C培養(yǎng)3-5天即可作100L麥芽汁的發(fā)酵罐

5、種子。 從三角瓶到卡氏培養(yǎng)罐培養(yǎng)期間， 均需定時搖動或通氣，使酵母菌液與空氣接觸， 以有利與酵母菌的增殖。二、生產(chǎn)車間種子制備實(shí)驗室制備的孢子或液體種子移種至種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)， 種子罐的培養(yǎng)基雖因不同菌種而異， 但其原則為采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米漿、磷酸鹽等，如果是需氧菌，同時還需供 給足夠的無菌空氣，并不斷攪拌，使菌（絲）體在培養(yǎng)液中均勻分布，獲得相同的培養(yǎng)條件。1，種子罐的作用： 主要是使孢子發(fā)芽，生長繁殖成菌（絲）體，接入發(fā)酵罐能迅速生長，達(dá)到一定的菌體量， 以利于產(chǎn)物的合成。2，種子罐級數(shù)的確定種子罐級數(shù)：是指制備種子需逐級擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)，取決于：（ 1 ）菌種生長特性、孢子發(fā)

6、芽及菌體繁殖速度；（ 2）所采用發(fā)酵罐的容積。比如： 細(xì)菌：生長快，種子用量比例少，級數(shù)也較少，二級發(fā)酵。茄子瓶 t 種子罐 t 發(fā)酵罐霉菌：生長較慢，如青霉菌，三級發(fā)酵孢子懸浮液t 一級種子罐（27 C ,40小時孢子發(fā)芽，產(chǎn)生菌絲）t二級種子罐（27C, 1024 小時，菌體迅速繁殖，粗壯菌絲體）t發(fā)酵罐放線菌：生長更慢，采用四級發(fā)酵酵母：比細(xì)菌慢，比霉菌，放線菌快，通常用一級種子3，確定種子罐級數(shù)需注意的問題（1）種子級數(shù)越少越好，可簡化工藝和控制，減少染菌機(jī)會（2）種子級數(shù)太少，接種量小，發(fā)酵時間延長，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率，增加染菌機(jī)會（3）雖然種子罐級數(shù)隨產(chǎn)物的品種及生產(chǎn)規(guī)模而定。但也

7、與所選用工藝條件有關(guān)。如改變 種子罐的培養(yǎng)條件，加速了孢子發(fā)芽及菌體的繁殖，也可相應(yīng)地減少種子罐的級數(shù)。第二節(jié) 種子質(zhì)量的控制 一、影響孢子質(zhì)量的因素及控制影響孢子質(zhì)量的因素通常有：培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時間和冷藏時間等。A 拉關(guān)苴1，培養(yǎng)基 生產(chǎn)過程中經(jīng)常出現(xiàn)種子質(zhì)量不穩(wěn)定的現(xiàn)象，其主要原因是原材料質(zhì)量波動。例如在四環(huán) 素、土霉素生產(chǎn)中，配制產(chǎn)孢子斜面培養(yǎng)基用的麩皮，因小麥產(chǎn)地、品種、加工方法及用量的 不同對孢子質(zhì)量的影響也不同。蛋白胨加工原料不同如魚胨或骨胨對孢子影響也不同。原材料 質(zhì)量的波動，起它要作用的是其中無機(jī)離子含量不同，如微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含

8、量太多或太少也會影響孢子的質(zhì)量。水質(zhì)的影響：地區(qū)不同、季節(jié)變化和水源污染，均可造成水質(zhì)波動，影響種子質(zhì)量。 菌種在固體培養(yǎng)基上可呈現(xiàn)多種不同代謝類型的菌落，氮源品種越多，出現(xiàn)的菌落類型也 越多，不利于生產(chǎn)的穩(wěn)定。解決措施：（1）培養(yǎng)基所用原料要經(jīng)過發(fā)酵試驗合格才可使用；（2）嚴(yán)格控制滅菌后培養(yǎng)基的質(zhì)量；（3）斜面培養(yǎng)基使用前，需在適當(dāng)溫度下放置一定時間；（4） 供生產(chǎn)用的孢子培養(yǎng)基要用比較單一的氮源，作為選種或分離用的培養(yǎng)基則采用較復(fù) 雜的有機(jī)氮源。2，培養(yǎng)條件（1）溫度溫度對多數(shù)品種斜面孢子質(zhì)量有顯著的影響。如土霉素生產(chǎn)菌種在高于37C培養(yǎng)時，孢子接入發(fā)酵罐后出現(xiàn)糖代謝變慢，氨基氮回升提前，

9、菌絲過早自溶，效價降低等現(xiàn)象。一般各生 產(chǎn)單位都嚴(yán)格控制孢子子斜面的培養(yǎng)溫度。（2）濕度 制備斜面孢子培養(yǎng)基的濕度對孢子的數(shù)量和質(zhì)量有較大的影響。例如土霉素生產(chǎn)菌種龜裂 鏈霉菌，孢子制備時發(fā)現(xiàn)：在北方氣候干燥地區(qū)孢子斜面長得較快，在含有少量水分的試管斜 面培養(yǎng)基下部孢子長得較好，而斜面上部由于水分迅速蒸發(fā)呈干疤狀，孢子稀少。在氣溫高含 濕度大的地區(qū)，斜面孢子長得慢，主要由于試管下部冷凝水多而不利于孢子的形成。從表中看 出相對濕度在 40%45% 時孢子數(shù)量最多，且孢子顏色均勻，質(zhì)量較好。表 7-1 不同相對濕度對龜裂鏈霉菌斜面生長的影響相對濕度(%)斜面外觀活孢子計數(shù)(億/支)16.519上部

10、稀薄、下部稠略黃1.22536上部薄、中部均勻發(fā)白2.34045一片白，孢子豐富，稍皺5.73, 培養(yǎng)時間和冷藏時間(1) 培養(yǎng)時間一般來說，衰老的孢子不如年輕的孢子，因為衰老的孢子已在逐步進(jìn)入發(fā)芽階段，核物質(zhì) 趨于分化狀態(tài)。過于衰老的孢子會導(dǎo)致生產(chǎn)能力的下降。解決措施：孢子培養(yǎng)的時間應(yīng)該控制在孢子量多、孢子成熟、發(fā)酵產(chǎn)量正常的階段終止培養(yǎng)。(2) 冷藏時間斜面冷藏對孢子質(zhì)量的影響與孢子成熟程度有關(guān)。如土霉素生產(chǎn)菌種孢子斜面培養(yǎng)4天左右即于4 C冰箱保存，發(fā)現(xiàn)冷藏 78天菌體細(xì)胞開始自溶。而培養(yǎng) 5天以后冷藏，20天未發(fā)現(xiàn) 自溶。冷藏時間對孢子的生產(chǎn)能力也有影響。例如在鏈霉素生產(chǎn)中，斜面孢子在

11、6C冷藏兩個月后的發(fā)酵單位比冷藏一個月降低18%，冷藏3個月后降低35%。4, 接種量接種量大小影響到培養(yǎng)基中孢子的數(shù)量，進(jìn)而影響菌體的生理狀況。二、影響種子質(zhì)量的因素及控制生產(chǎn)過程中影響種子質(zhì)量的因素通常有：孢子的質(zhì)量、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、種齡、接種量。A 拉圭苴I，培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基要滿足以下要求：(1) 營養(yǎng)成分適合種子培養(yǎng)的需要(2) 選擇有利于孢子發(fā)芽和菌體生長的培養(yǎng)基；(3) 營養(yǎng)上要易于被菌體直接吸收和利用；(4) 營養(yǎng)成分要適當(dāng)豐富和完全，氮源和維生素含量要高(5) 營養(yǎng)成分要盡可能與發(fā)酵培養(yǎng)基相近。2, 培養(yǎng)條件(1) 溫度(2) 通氣量在種子罐中培養(yǎng)的種子除保證供給易被利用的培

12、養(yǎng)基外，有足夠的通氣量可以提高種子質(zhì) 量。例如，青霉素的生產(chǎn)菌種在制備過程中將通氣充足和不足兩種情況下得到的種子分別接入 發(fā)酵罐內(nèi)，它們的發(fā)酵單位可相差1倍。但也有例外，例如土霉素生產(chǎn)菌，一級種子罐的通氣量小對發(fā)酵有利。3, 種齡種齡：是指種子罐中培養(yǎng)的菌絲體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間。通常種齡是以處于生命力極旺盛的對數(shù)生長期，菌體量還未達(dá)到最大值時的培養(yǎng)時間較為 合適。時間太長，菌種趨于老化，生產(chǎn)能力下降，菌體自溶；種齡太短，造成發(fā)酵前期生長緩 慢。不同菌種或同一菌種工藝條件不同，種齡是不一樣的，一般需經(jīng)過多種實(shí)驗來確定。如嗜 堿性芽孢桿菌生產(chǎn)堿性蛋白酶， 12小時最好（見下圖

13、）。接種齡rw4,接種量接種量：是指移入的種子液體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例。接種量的大小決定于生產(chǎn)菌種在發(fā)酵罐中生長繁殖的速度，采用較大的接種量可以縮短發(fā) 酵罐中菌絲繁殖達(dá)到高峰的時間，使產(chǎn)物的形成提前到來，并可減少雜菌的生長機(jī)會。但接種 量過大或者過小，均會影響發(fā)酵。過大會引起溶氧不足，影響產(chǎn)物合成；而且會過多移入代謝 廢物，也不經(jīng)濟(jì)；過小會延長培養(yǎng)時間，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率。接種雖對礁性蛋只酶產(chǎn)主的辭響通常接種量，細(xì)菌 15%，酵母菌510%，霉菌715%，有時2025%三、種子質(zhì)量的控制措施種子質(zhì)量的最終指標(biāo)是考察其在發(fā)酵罐中所表現(xiàn)出來的生產(chǎn)能力。因此首先必須保證生產(chǎn) 菌種的穩(wěn)定性，其次

14、是提供種子培養(yǎng)的適宜環(huán)境保證無雜菌侵入，以獲得優(yōu)良種子。因此在生 產(chǎn)過程中通常進(jìn)行以下兩項檢查。(1) 菌種穩(wěn)定性的檢查(2) 無(雜菌)檢查 四、種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1, 細(xì)胞或菌體菌絲形態(tài)、菌絲濃度和培養(yǎng)液外觀(色素、顆粒等)單細(xì)胞：菌體健壯、菌形一致、均勻整齊，有的還要求有一定的排列或形態(tài)；霉菌、放線菌：菌絲粗壯、對某些染料著色力強(qiáng)、生長旺盛、菌絲分枝情況和內(nèi)含物情況 好。2, 生化指標(biāo)種子液的糖、氮、磷的含量和pH變化。3, 產(chǎn)物生成量在抗生素發(fā)酵中，產(chǎn)物生成量是考察種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，因為種子液中產(chǎn)物生成量的多 少間接反映種子的生產(chǎn)能力和成熟程度。4，酶活力種子液中某種酶的活力，與目的產(chǎn)物的

15、產(chǎn)量有一定的關(guān)聯(lián)。五、種子異常分析菌種生長速度，過快或過慢菌絲結(jié)團(tuán)菌絲粘壁第三節(jié) 實(shí)例 一、谷氨酸發(fā)酵的菌種擴(kuò)大培養(yǎng)斜面菌種T 一級種子培養(yǎng)T二級種子培養(yǎng) T發(fā)酵罐1，斜面菌種的培養(yǎng)菌種的斜面培養(yǎng)必須有利于菌種生長而不產(chǎn)酸，并要求斜面菌種絕對純，不得混有任何雜 菌和噬菌體，培養(yǎng)條件應(yīng)有利于菌種繁殖，培養(yǎng)基以多含有機(jī)氮而不含或少含糖為原則。(1) 斜面培養(yǎng)基組成葡萄糖 0.1%，蛋白陳 1.0%，牛肉膏 1.0%，氯化鈉 0.5%，瓊脂 2.02.5%，pH 7.07.2(傳 代和保藏斜面不加葡萄糖) 。(2) 培養(yǎng)條件3334C，培養(yǎng) 1824h。2，一級種子培養(yǎng)一級種子培養(yǎng)的目的在于大量繁殖

16、活力強(qiáng)的菌體，培養(yǎng)基組成應(yīng)以少含糖分，多含有機(jī)氮 為主，培養(yǎng)條件從有利于長菌考慮。(1) 培養(yǎng)基組成葡萄糖 2.5%，尿素 0.5%，硫酸鎂 0.04%，磷酸氫二鉀 0.1%，玉米漿 2.53.5%( 按質(zhì)增減 )， 硫酸亞鐵、硫酸錳各 2ppm， pH7.0 。(2) 培養(yǎng)條件用1000mL三角瓶裝入培養(yǎng)基 200ml，滅菌后置于沖程 7.6cm、頻率96次/min的往復(fù)式搖 床上振蕩培養(yǎng)12h，培養(yǎng)溫度3334 C。(3) 一級種子質(zhì)量要求種齡： 12h， pH 值：6.4±0.1光密度：凈增 OD 值 0.5 以上殘?zhí)牵?0.5以下 無菌檢查： (-)噬菌體檢查： (-)鏡檢：

17、菌體生長均勻、粗壯，排列整齊革蘭氏陽性反應(yīng)。3，二級種子培養(yǎng)為了獲得發(fā)酵所需要的足夠數(shù)量的菌體，在一級種子培養(yǎng)的基礎(chǔ)上進(jìn)而擴(kuò)大到種子罐的二 級種子培養(yǎng)。種子罐容積大小取決于發(fā)酵罐大小和種量比例。(1) 培養(yǎng)基組成丄& 韻仝 卡十乙口 r-P* /n/ T6-13B9T738AS1.299培養(yǎng)基組成(% )水解糖2.52.52.52.5玉米漿2.5磷酸氫二鉀0.150.150.20.1硫酸鎂0.040.040.050.04尿素0.40.40.50.52222Fe+ (ppm)2222Mn+ (ppm)7.0pH(2) 培養(yǎng)條件接種量：0.81.0 %培養(yǎng)溫度：3234 C培養(yǎng)時間：78h

18、通風(fēng)量：50L種子罐1:0.5攪拌轉(zhuǎn)速340r/ min;250L種子罐1:0.3攪拌轉(zhuǎn)速300r/ min500L 種子罐 1:0.25攪拌轉(zhuǎn)速230r/ min(3) 二級種子的質(zhì)量要求種齡：78hpH : 7.2左右OD值凈增0.5左右無菌檢查(-)噬菌體檢查(-)二、啤酒酵母的擴(kuò)大培養(yǎng)一般可采用三級擴(kuò)大培養(yǎng)，擴(kuò)大倍數(shù)：第1級到第2級為8-10倍，第2級到第3級為4-6倍。1, 實(shí)驗室擴(kuò)大培養(yǎng)斜面曲科面敵一逼生 Wml耕試管_ 湎匱葉三觥培養(yǎng)_笳仏卜4天2544-3611 25匚咖310破沖三鯨培器一 3呱釧三角鳩養(yǎng)一血麥杵卡瑚培粼容量叫22-25t, 24h20 昭匕 24h1 卜 2

19、 冗,24- 36h2, 車間擴(kuò)大培養(yǎng)I4烈主峯1D0S氏茵羔汁TOL14 * JBtII< 2虻氏沁PkI介去丄清餓旳L沉捉酵g 和1據(jù)菌盤汁2Ok?a（14-l6rC培養(yǎng)曲b卜*001*滅虛.41； II 余2OL10- 12 f 培養(yǎng)A 3天 丨 巔H.培養(yǎng)磯 種朋存 1-2V0Okra兼殖竄HO>1X有敢 匱曲麥汁300L1 Hi"七，培養(yǎng)34h 退加淀雷豔刊斷LI 連忙*陪養(yǎng)圳h 繁虢戦4500L（有進(jìn) ioSil- 4000L4 9- lLTt24h 2On?發(fā)疔聊加麥汁HOW1I壷汁聿2ftd a-WVR¥7- 6Jt ； d代酵吐第三節(jié)生產(chǎn)發(fā)酵罐

20、的無菌接種生產(chǎn)規(guī)模發(fā)酵罐的接種，包括兩個方面：從實(shí)驗室搖瓶或孢子懸浮液容器中移種入一個種 子罐；從一個種子罐移入另一個生產(chǎn)發(fā)酵罐中。（1 ）從實(shí)驗室搖瓶或孢子懸浮液容器接種通常有兩種方式2,從種子罐接種范子毘浮液就種子蒸汽第四節(jié)菌種的保藏與復(fù)壯一、菌種的保藏1、菌種保藏的意義菌種是從事微生物學(xué)以及生命科學(xué)研究的基本材料，特別是利用微生物進(jìn)行有關(guān)生產(chǎn)如抗 生素、氨基酸、釀造等工業(yè)，更離不開菌種。所以菌種保藏是進(jìn)行微生物學(xué)研究和微生物育種 工作的重要組成部分。其任務(wù)首先是使菌種不致死亡，同時還要盡可能設(shè)法把菌種的優(yōu)良特性 保持下來而不致向壞的方面轉(zhuǎn)化。 2、菌種保藏的原理菌種保藏主要是根據(jù)菌種的生

21、理生化特點(diǎn)人工創(chuàng)造條件使孢子或菌體的生長代謝活動盡量 降低，以減少其變異。一般可通過保持培養(yǎng)基營養(yǎng)成分在最低水平缺氧狀態(tài)，干燥和低溫，使 菌種處于 體眠”狀態(tài)，抑制其繁殖能力。一種好的保藏方法首先應(yīng)能長期保持菌種原有的優(yōu)良性狀不變，同時還需考慮到方法本身 的簡便和經(jīng)濟(jì)，以便生產(chǎn)上能推廣使用。3、菌種保藏的方法（1）斜面低溫保藏法將菌株接種于合適斜面培養(yǎng)基上，待生長好后置于4冰箱保藏，每隔一定時間進(jìn)行移接培養(yǎng)后再將新斜面繼續(xù)保藏。這種保藏方法簡單，存活率高，易于推廣，經(jīng)常使用的菌種可采用這種方法。其缺點(diǎn)是菌 種仍有一定強(qiáng)度的代謝活動條件，保存時間不長，而且傳代多，因此菌種客易產(chǎn)生變異。（2）石蠟

22、油封保藏法將生長好的新鮮斜面在無菌條件下倒入已滅菌的液體石蠟，油層要高出斜面上端1cm，使之與空氣隔絕，然后垂直放于室溫或冰箱內(nèi)保藏即可。這種方法也比較簡便，且保藏時間一般可長達(dá)l 年以上。適于保存部分霉菌、酵母菌、放線菌，但對細(xì)菌效果較差，對某些能同化烴類的微生物則不適用。（3）砂土管保藏法 將孢子懸浮液轉(zhuǎn)移至滅過菌的砂土管中，于真空干燥器內(nèi)用真空泵抽干，再轉(zhuǎn)至有干燥劑 的容器中，密封低溫保藏。本方法是用人工方法模擬自然環(huán)境使菌種得以棲息。適用于細(xì)菌的 芽孢、霉菌和放線菌孢子的保藏，不適于對干燥敏感的無芽孢的細(xì)菌和酵母菌。主要包括砂土 制備和真空抽干兩步。（ 4）冷凍干燥法 此法的原理是在低

23、溫下迅速將細(xì)胞凍結(jié)以保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整，然后在真空下使水分升華。這樣菌種的生長和代謝活動處于極低水平， 不易發(fā)生變異和死亡， 因而能長期保存， 一般為 510 年。微生物在此條件下易死亡，所以需加入一些物質(zhì)作保護(hù)劑，一般常用的是脫脂牛奶、血清 等。該法存活率高，變異率低，并能廣泛適用于細(xì)菌（有芽孢和無芽孢的）、酵母、霉菌孢子、放線菌孢子和病毒等，因此是目前廣泛采用的好方法。其缺點(diǎn)是手續(xù)麻煩，操作復(fù)雜，要求嚴(yán) 格，并需有一定設(shè)備條件。（ 5）超低溫保藏法 由于現(xiàn)在超低溫冰箱的使用已較普及，所以菌種的超低溫保藏法在生產(chǎn)企業(yè)和研究機(jī)構(gòu)已 得到廣泛應(yīng)用。該方法的要點(diǎn)是：將要保藏的菌種置于1 0%甘油或

24、二甲基亞砜保護(hù)劑中，密封于試管或安瓿管中，然后將其放入超低溫冰箱中于-70 C下保藏。該法簡便易行，而且保藏效果較好。二、發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的衰退與復(fù)壯微生物具有生命活動能力， 其世代時間一般是很短的， 在傳代過程中易發(fā)生變異甚至死亡， 因此常常造成工業(yè)生產(chǎn)菌種的退化，并有可能使優(yōu)良菌種丟失，所以，如何保持菌種優(yōu)良性狀 的穩(wěn)定是研究菌種保藏的重要課題。（一）微生物菌種的衰退 菌種退化通常是指在較長時期傳代保藏后，菌株的一個或多個生理性狀和形態(tài)特征逐漸減 退或消失的現(xiàn)象。常見的菌種衰退在形態(tài)上表現(xiàn)為分生孢子的減少或菌落顏色的改變。在生理 上常指菌種發(fā)酵能力的降低，有些菌的抗噬菌體能力下降。對誘變

25、育種而獲得的高產(chǎn)變異株則 常表現(xiàn)出恢復(fù)野生型性狀等。但菌種的真正退化必須與由于環(huán)境原因變化而引起菌種形態(tài)、和 生理上的變異區(qū)別開來。如培養(yǎng)基中微量元素缺乏會導(dǎo)致孢子數(shù)量減少，也會引起孢子顏色的 改變。此外，溫度、pH、不同碳氮源都會導(dǎo)致菌種變化。但只要一旦恢復(fù)正常條件，這些現(xiàn)象 就會消失。此外，雜菌污染也會造成菌種退化的假象。因此，必須正確判斷是否退化，才能找 出正確的解決辦法。一般菌種退化是從量變到質(zhì)變逐漸發(fā)生的，同時也是整個群體中產(chǎn)量降低 及其相聯(lián)系的種種特性的變化，而不是指單個細(xì)胞的改變。引起菌種退化的原因主要有：1 、基因突變菌種退化的主要原因是有關(guān)基因的負(fù)突變。如果控制產(chǎn)量的基因發(fā)生

26、負(fù)突變則會引起產(chǎn)量 下降，如果控制孢子生成的基因發(fā)生負(fù)突變則孢子性能就會下降。當(dāng)然，這些負(fù)突變都是自發(fā) 形成的。經(jīng)常處于旺盛生長狀態(tài)的細(xì)胞比休眼狀態(tài)細(xì)胞發(fā)生突變的機(jī)率大得多。在發(fā)酵生產(chǎn)中 常用營養(yǎng)缺陷型突變株，如缺陷型發(fā)生回復(fù)突變就會使產(chǎn)量水平下降。如粘質(zhì)賽氏桿菌（Serratiamarcescens）H-2892菌株生產(chǎn)力為18g/L組氨酸，經(jīng)5次傳代后因回復(fù)突變型增多，產(chǎn)量下降至 4g/L。很多抗生素生物合成、產(chǎn)生氣生菌絲和色素等性狀都部分或全部受質(zhì)?；蚩刂?。當(dāng)菌 株連續(xù)傳代、菌體發(fā)生質(zhì)粒脫落而出現(xiàn)大量光禿型菌落，則生產(chǎn)能力也顯著下降。2、變異菌株性狀分離變異菌株性狀分離也會引起高產(chǎn)型狀

27、的喪失。在菌種篩選工作中經(jīng)常遇到初篩搖瓶產(chǎn)量很 高，復(fù)篩產(chǎn)量逐漸下降而被淘汰的現(xiàn)象，在霉菌中更為常見。這是一種廣義的退化現(xiàn)象。當(dāng)誘 變的單菌落是由一個以上孢子或細(xì)胞形成，而其中只有一個孢子或細(xì)胞是高產(chǎn)時，在移接傳代 過程中，這個高產(chǎn)菌株數(shù)量減少，當(dāng)然產(chǎn)量也就下降。 即使菌落是由一個孢子或單個細(xì)胞形成，只要它是多核細(xì)胞，在誘發(fā)突變中核的變化不會都一樣，隨著菌種傳代和核的分離也會使性狀 表現(xiàn)多樣化，產(chǎn)量也會隨之變化，即使是單核孢子發(fā)生突變時，如果雙鏈DNA上僅一條鏈上某個位點(diǎn)發(fā)生變化，經(jīng)移殖后也會出現(xiàn)性狀分離。因此一個較穩(wěn)定的變異株的獲得必須經(jīng)過多次 分離純化。為了得到較多純種，有人考慮提高誘變劑

28、量，使單核細(xì)胞DNA雙鏈中一條鏈的某一 點(diǎn)發(fā)生突變，另一條鏈完全失活不再復(fù)制來提高純菌產(chǎn)生率。通過實(shí)驗得到下表所示數(shù)據(jù)。不同劑量紫外線處理裂殖酵母時不純菌落百分?jǐn)?shù)劑量（以存活率計，%）菌落總數(shù)突變菌落數(shù)突變頻率（突變菌落/103）不純菌洛（%）純不純100 （對照）121651一0.08一80100120601312243608085534620273020604922651716.72112098841952822.613誘變突變株的穩(wěn)定性和誘變劑作用機(jī)制有關(guān)，一般認(rèn)為誘發(fā)DNA堿基轉(zhuǎn)換或顛換時不穩(wěn)定菌株出現(xiàn)較多，而誘發(fā)缺失交界時不穩(wěn)定菌株出現(xiàn)較少，因為缺失是不能回復(fù)的。3、連續(xù)傳代連續(xù)傳代

29、也是菌種退化的直接原因。個別細(xì)胞性狀改變不足以引起菌種退化，經(jīng)多次傳代,退化細(xì)胞在數(shù)量上占優(yōu)勢，于是退化性狀表現(xiàn)逐步明朗化，最終成為一株退化菌株。以芽孢桿 菌的黃嘌呤缺陷型在斜面上移殖代數(shù)對回復(fù)突變率和產(chǎn)量的關(guān)系為例，如下表所示。產(chǎn)腺苷的黃嘌呤缺陷型菌株在接種傳代過程中產(chǎn)量和回復(fù)子數(shù)量間的關(guān)系實(shí)驗移接代數(shù)每代斜面保存時間（天）回復(fù)子比數(shù)腺苷產(chǎn)量（g/L）101471/4.5W613.522133, 141/2.4K)614.93647, 3, 9, 3, 71, 141/2.2K)510.74747, 3, 9, 3, 13, 58, 141/3.5K)513.15947, 3, 9, 3, 13, 8, 3, 47, 41/5.3W38.161247, 3, 9, 3, 13, 8, 3, 4, 14, 6, 6, 311/1.0K)37.4由上表可見，雖菌種總的保存時間都是 147天，但隨著移植代數(shù)的增加， 回復(fù)突變率也增加, 腺苷產(chǎn)量下降。這也說明，退化并不突然明顯，