_納豆菌脂肽對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌機(jī)理的研究

1、研究與探討Vol. 33, No. 11, 2012 納豆菌脂肽對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌機(jī)理的研究劉喚明1，孫力軍1，*，王雅玲1，徐德峰1，劉陽(yáng)2，陳宏2，唐曉山3（1. 廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524088；2. 國(guó)家海產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（湛江），廣東湛江524025；3. 湛江師范學(xué)院電鏡室，廣東湛江524048）摘要：【目的】研究納豆菌脂肽對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌機(jī)理?！痉椒ā客ㄟ^(guò)對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞膜通透性、細(xì)胞蛋白的合成、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、細(xì)胞代謝的影響等方面的研究，探討納豆菌脂肽對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌機(jī)理?！窘Y(jié)果】脂肽可以使金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜通透性增加，使得具有紫

2、外吸收的大分子物質(zhì)發(fā)生泄漏；可以導(dǎo)致金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁形成孔洞甚至使細(xì)胞斷裂；脂肽對(duì)金黃色葡萄球菌蛋白表達(dá)未見(jiàn)有明顯影響，但可抑制部分蛋白質(zhì)的合成；對(duì)金黃色葡萄球菌代謝活力有較強(qiáng)的抑制作用?！窘Y(jié)論】納豆菌脂肽可使金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜通透性增加，或細(xì)胞膜形成孔洞導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，使細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，進(jìn)而導(dǎo)致死亡。關(guān)鍵詞：納豆菌，脂肽，金黃色葡萄球菌，抑菌機(jī)理Study on antibacterial mechanism of lipopeptide from Bacillus nattoagainst Staphyloccocus aureusLIU Huan-ming 1，SUN Li-

3、jun 1，*，WANG Ya-ling 1，XU De-feng 1，LIU Yang 2，CHEN Hong 2，TANG Xiao-shan 3（1.School of Food Science and Technology of Guang Dong Ocean University ，Zhanjiang 524088，China ；2.National Seafood Quality Supervision Inspection Center ，Zhanjiang 524025，China ；3.Department of Scanning Electron Microscopy ，

4、Zhanjiang Normal College ，Zhanjiang 524048，China ）Abstract ：ObjectiveThe antibacterial mechanism of lipopeptide from Bacillus natto against Staphyloccocusaureus was studied. MethodThe antibacterial mechanism of lipopeptide from Bacillus natto against Staphyloccocus aureus was studied according to th

5、e effect of lipopeptide on the growth curves ，membrane permeability ，protein synthesis ，the structure under scanning electron microscope ，and respiratory metabolism. ResultThe lipopeptide could increase membrane permeability of Staphyloccocus aureus ，which led the macromolecules with ultraviolet abs

6、orption in cell to leak out of the cell. Observation under scanning electron microscope revealed the holes were formed in the cell wall of Staphyloccocus aureus ，and even the cell was ruptured by lipopeptide. SDS -PAGE analysis suggested that the lipopeptide had not apparent effects on proteins expr

7、ession ，but had some effects on synthesized quantities of some proteins. The respiratory metabolism of Staphyloccocus aureus was inhibited by lipopeptide. ConclusionThe lipopeptide acted on the cell membrane of Staphyloccocus aureus ，which induced membrane permeability of Staphyloccocus aureus incre

8、ased ，or holes were formed in the cell membrane ，thus the materials in the cell to leak out of it ，resulted in inhibiting the growth of cell ，and killing the cell.Key words ：Bacillus natto ；lipopeptide ；Staphyloccocus aureus ；antibacterial mechanism 中圖分類號(hào)：TS201.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1002-0306（2012）11-0109-0

9、4納豆菌是日本傳統(tǒng)發(fā)酵食品納豆的生產(chǎn)菌，在日本已被使用了2000多年。該菌可以產(chǎn)生一系列1-2抗菌肽類物質(zhì)（通常有surfactin 、iturin 、fengycin 等），國(guó)內(nèi)學(xué)者將其應(yīng)用于食品防腐顯示了很好的效果3-4。收稿日期：20110901質(zhì)量控制?；痦?xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（30972287）。*通訊聯(lián)系人作者簡(jiǎn)介：劉喚明（1978-），男，碩士，講師，研究方向：水產(chǎn)品安全與本研究組前期的研究已從納豆中分離篩選出了一株納豆芽孢菌桿菌NT-6菌株，該菌可以產(chǎn)生surfactin 、iturin 、fengycin 三類脂肽類物質(zhì)3，并證實(shí)其在食品中應(yīng)用是安全的5。納豆菌脂肽具有廣譜

10、的抗菌活性，對(duì)革蘭氏陰性（G ）菌、革蘭氏陽(yáng)性（G +）菌、酵母菌和霉菌皆有抗菌作用3-4。它克服了目前廣泛應(yīng)用的乳酸鏈球菌素（Nisin ）只能用于酸性條件下G +菌控制，而對(duì)食品中副溶血弧菌、大腸桿菌O157和沙門(mén)氏菌等G 致病菌無(wú)抑制作用的局限性，在食品工業(yè)中有2012年第11期Science and Technology of Food Industry著良好的應(yīng)用前景?？咕念惪咕镔|(zhì)的抑菌機(jī)理報(bào)道較多，一般認(rèn)為膜攻擊是抗菌肽的最主要作用抑制蛋白質(zhì)合成7-8等方途徑，也有抑制細(xì)胞呼吸6、面的報(bào)道。楊麗莉等發(fā)現(xiàn)了枯草芽孢桿菌脂肽可改變嗜水氣單孢菌細(xì)胞膜通透性、還可造成細(xì)胞壁缺失9。而關(guān)

11、于脂肽是否存在直接作用代謝過(guò)程、蛋白質(zhì)合成等方面則鮮見(jiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)擬從金黃色葡萄膜通透性、蛋白質(zhì)合成等方球菌菌體細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、面探討納豆菌脂肽抑制金黃色葡萄球菌的機(jī)理，以期為納豆菌脂肽的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。研究與探討 6h 后加入終濃度為0.8MIC 的脂肽；d 組和e 為培養(yǎng)0、組分別為培養(yǎng)12h 后加入終濃度為1、3MIC 的脂肽。1.2.4對(duì)細(xì)胞顯微特征的影響將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的金黃色葡萄球菌于5000r/min離心10min ，然后用滅菌生理鹽水洗滌，重復(fù)操作三次然后用生理鹽水調(diào)節(jié)菌體濃度為108CFU/mL，即為金黃色葡萄球菌細(xì)胞菌懸液。取制備的金黃色葡萄球菌細(xì)胞菌懸液，加然后將入

12、脂肽并且使其終濃度分別為1MIC 和3MIC ，其于37孵育1h 。將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌液離心收集菌體，用2.5%戊二醛固定2h 后涂片，將樣品自然風(fēng)干，干燥后的標(biāo)本放入高真空蒸發(fā)器中，噴金鍍膜，掃描電鏡下觀察，拍照。1.2.5對(duì)細(xì)胞膜通透性的的影響用LB 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)金黃色葡萄球菌至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，5000r/min離心10min 收集菌體，然后用滅菌生理鹽水洗滌，重復(fù)操作三次后用生理鹽水稀釋調(diào)節(jié)菌體濃度為106CFU/mL。稀釋后的菌懸液中加入脂肽，使其終濃度為1MIC ，并15、放于37恒溫振蕩器中100r/min振蕩。分別在0、30、45、60、75、90、105、120

13、mim 取出10mL 菌懸液，經(jīng)0.22m 纖維素酯微孔膜過(guò)濾，濾液于紫外分光光度計(jì)在260nm 處測(cè)定其吸光值。1.2.6對(duì)蛋白質(zhì)合成的影響金黃色葡萄球菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，按5%接種量分別接種于100mL LB 液體培養(yǎng)基中，分為對(duì)照組和處理組，對(duì)照組加入1mL 無(wú)菌水、實(shí)驗(yàn)組加入脂肽使其終濃度為0.8MIC ，繼續(xù)于37、150r/min培養(yǎng)，分別于6、12h 取樣，稀釋成相同的吸光度值后取樣10mL 于5000r/min離心10min ，然后用生理鹽水洗滌兩次，取沉淀加100L 無(wú)菌水和10L 上樣緩沖液于100保溫5min ，再次離心沉淀后取20L 上清液進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳

14、。選用濃縮分離膠濃度為12%的SDS-PAGE 凝膠膠濃度為5.0%，系統(tǒng)，染色液為0.1%的考馬斯亮蘭。1.2.7對(duì)代謝活力的影響將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的金黃色葡萄球菌于5000r/min離心10min ，收集菌體。然后用滅菌生理鹽水洗滌，重復(fù)操作三次然后用生理鹽水調(diào)節(jié)菌體濃度至108CFU/mL。在菌懸液中加入脂肽使其終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2MIC ，于37保溫作用1h 。于10000r/min離心5min ，收集菌體，然后用滅菌生理鹽水洗滌，重復(fù)操作2次后用生理鹽水調(diào)節(jié)至108CFU/mL，加入氯化碘硝基四唑紫，使其終濃度為1mmol/L，并于37下作用30

15、min ，然后判斷脂肽對(duì)金黃色葡萄測(cè)定630nm 處吸光值的變化，球菌細(xì)胞代謝活力的影響。11.1材料與方法材料與儀器金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus ）購(gòu)于廣東省微生物研究所；納豆芽孢菌桿菌（Bacillus natto NT-6）由廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院水產(chǎn)品食源性病原微生物及毒素綠色控制研究室提供；2.5%戊LB 液二醛固定液；氯化碘硝基四唑紫國(guó)產(chǎn)分析純；體培養(yǎng)基（%）牛肉膏0.5，蛋白胨1，NaCl 0.5，pH7.2；（/L）葡萄糖10.0g ，谷氨改良Landy 培養(yǎng)基的組成為酸鈉5.0g ，MgSO 40.5g ，KCl 0.78g ，KH 2PO 4

16、1.0g ，F(xiàn)eSO 40.05mg ，CuSO 40.16mg ，MnSO 45.0mg 。HZQ-F160振蕩培養(yǎng)箱哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；LS-BSO 立式壓力蒸汽滅菌器上FDU-1100真空冷海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；凍干燥機(jī)東京理化；UV-2550紫外分光光度計(jì)日DYY-6C 型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀北京六本島津制作所；一儀器廠；UVPGDS-8000凝膠成像系統(tǒng)美國(guó)UVP 公司；SEM XL-30型掃描電子顯微鏡美國(guó)PHILIPS 公司。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1納豆菌脂肽的制備取斜面保存的Bacillus natto NT-6菌株，接種于LB 液體培養(yǎng)基中，于37、150r/

17、min條件下，恒溫?fù)u床振搖培養(yǎng)24h 作為種子液。按照5接種量接種于改良的Landy 培養(yǎng)基，于33、180r/min培養(yǎng)38h 。5000r/min離心15min 除去菌體，上低溫過(guò)夜，5000r/min離心15min 取沉清液調(diào)pH 至2.0，淀用甲醇溶解，調(diào)節(jié)pH 至7.0，于磁力攪拌器上低溫?cái)嚢?h ，10000r/min離心20min 后得到的上清液即為含脂肽的甲醇溶液，然后利用低溫冷凍干燥除去甲醇。1.2.2最小抑菌濃度（MIC ）測(cè)定液體倍比稀釋法：用LB 液體培養(yǎng)基將脂肽倍比稀釋共稀釋7次；同時(shí)設(shè)空白對(duì)照和陰性對(duì)照。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液稀釋使其菌體濃度為105CF

18、U/mL，分別加入上述稀釋后含不同濃度脂肽的LB 液體培養(yǎng)基中，于37、150r/min培養(yǎng)1820h 后觀察金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)情況，以金黃色葡萄球菌不生長(zhǎng)的最小稀釋度的脂肽濃度即為最小抑菌濃度。1.2.3對(duì)生長(zhǎng)曲線的影響取活化后的金黃色葡萄球菌菌種按1%接種量分別接種于5個(gè)100mL LB 培養(yǎng)基中，于37、150r/min培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)的不同時(shí)間點(diǎn)取樣測(cè)OD 540nm 值，繪制生長(zhǎng)曲線。分組如下：a 組為對(duì)照組，于培養(yǎng)的同時(shí)加入1mL 無(wú)菌水；b 組和c 組分別2結(jié)果與分析由表1結(jié)果可知，納豆菌脂肽對(duì)金黃色葡萄球菌2.1MIC 測(cè)定結(jié)果的抑制效果明顯，最小抑制濃度為0.625mg/m

19、L。表1納豆菌脂肽對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度Table 1MIC of lipopeptide from Bacillus natto toStaphyloccocus aureus 脂肽濃度（mg/mL）250.3120.1560.0780.039金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)-+注：“+”指有菌生長(zhǎng)；“-”指無(wú)菌生長(zhǎng)。2012年第11期研究與探討2.2對(duì)生長(zhǎng)曲線的影響O D 260n mVol. 33, No. 11, 2012 80.060.040.020納豆菌脂肽對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的影響由圖1結(jié)果可知，在0、6h 加0.8M

20、IC 脂肽對(duì)金黃見(jiàn)圖1。色葡萄球菌的生長(zhǎng)均有較好的抑制作用，但是在6h 后加脂肽，由于菌體細(xì)胞正處于生長(zhǎng)代謝的旺盛狀態(tài)，且細(xì)胞濃度增加，脂肽抑菌作用有所減弱。在對(duì)數(shù)期末12h 加入脂肽，可使OD 540nm 不斷減小，說(shuō)明脂肽此外，結(jié)可以溶解金黃色葡萄球菌而起到殺菌作用。果還顯示，隨著加入的脂肽濃度由1MIC 增加到3MIC ，OD 540nm 減小幅度增加，說(shuō)明在一定范圍內(nèi)脂肽的溶菌作用隨其濃度的增加而增強(qiáng)。2.52O D 540n m1.510.5024812時(shí)間（h ）162024ab c d e01530456075時(shí)間（min ）90105120圖3納豆菌脂肽作用時(shí)間對(duì)細(xì)胞膜通透性的

21、影響Fig.3Effect of action time of lipopeptide from Bacillus natto on membrane permeability 度與對(duì)照相比要淺很多。這表明脂肽對(duì)金黃色葡萄球菌蛋白表達(dá)未見(jiàn)有明顯影響，但是脂肽可以抑制菌體細(xì)胞內(nèi)某些蛋白質(zhì)的合成。關(guān)于其是否可以通過(guò)影響這些蛋白質(zhì)的合成而導(dǎo)致菌體細(xì)胞生長(zhǎng)受阻或細(xì)胞死亡還需要進(jìn)一步深入研究。M CK A B116ku 66.2ku 45.0ku 35.0ku 25.0ku 18.4ku圖1納豆菌脂肽對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的影響Fig.1Effect of lipopeptide from Bacil

22、lus natto onStaphyloccocus aureus growth curve注：a 為對(duì)照組；b 、c 分別為0、6h 加入0.8MIC 抗菌肽；d 、e 分別為12h 加入1MIC 和3MIC 抗菌肽。2.3對(duì)細(xì)胞顯微特征的影響由掃描電鏡圖（圖2）結(jié)果可知，對(duì)照組的金黃色葡萄球菌形狀為球形；1MIC 脂肽處理組有的細(xì)胞表面有一定的凹陷（c 圖），有的細(xì)胞已經(jīng)有一個(gè)小孔洞（b 圖）；而3MIC 脂肽處理組金黃色葡萄球菌細(xì)胞是斷殘缺的。說(shuō)明脂肽可以使金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁裂、上形成孔洞，在高濃度脂肽作用下，甚至可以使得細(xì)胞斷裂。圖4Staphyloccocus aureus SDS

23、-PAGE 電泳圖譜Fig.4SDS-PAGE electrophoresis profile ofStaphyloccocus aureus注：CK 為不加抗菌肽培養(yǎng)12h ；A 、B 分別為0.8MIC 抗菌肽培養(yǎng)6h 和12h ；M 為標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白。2.6對(duì)代謝的影響脂肽對(duì)金黃色葡萄球菌代謝活力的影響結(jié)果見(jiàn)圖5?；罴?xì)胞在脫氫酶作用下生成一種活化氫離子，該離子可以將氯化碘硝基四唑紫還原成穩(wěn)定的甲臜，可以利用甲臜生成的速率來(lái)推測(cè)細(xì)胞的代謝活力10。細(xì)胞代謝活力越弱產(chǎn)生的氫離子越少，還原生成的甲臜越少，則OD 630nm 越小。圖5結(jié)果表明隨著抗菌肽濃度的增加，其對(duì)金黃色葡萄球菌代謝活力的抑

24、制作用逐漸增強(qiáng)。這可能是由于脂肽作用于金黃色葡萄球菌，使其細(xì)胞膜通透性增加，細(xì)胞里面物質(zhì)發(fā)生泄漏，使其代謝活力受到了抑制。0.20.10a b c d e掃描電鏡觀察脂肽對(duì)金黃色葡萄球菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響（25000）Fig.2Effect of lipopeptide from Bacillus natto on morphologyof Staphyloccocus aureus by SEM （25000）注：a 為對(duì)照；b ，c 為1MIC 處理組；d ，e 均為3MIC 抗菌肽處理組。圖22.4對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響由圖3結(jié)果可知，隨著納豆菌脂肽作用時(shí)間

25、的延長(zhǎng)，菌懸液260nm 處的吸光度值逐漸升高。表明脂肽的加入可以導(dǎo)致菌體的膜通透性增加，使得在正常狀態(tài)下不能夠透過(guò)細(xì)胞膜的具有紫外吸收的大分子物質(zhì)通過(guò)細(xì)胞膜泄漏到菌懸液中。O D 630n m00.8抗菌肽濃度（MIC ）11.22.5對(duì)蛋白質(zhì)合成的影響從金黃色葡萄球菌的電泳圖譜（圖4）可以看出，加0.8MIC 脂肽培養(yǎng)12h 時(shí)的樣品與未加脂肽培養(yǎng)12h 的對(duì)照相比，沒(méi)有明顯的特征帶消失，且絕大多數(shù)蛋白帶的亮度和對(duì)照差不多，不過(guò)有幾條蛋白帶的亮圖5納豆菌脂肽濃度對(duì)菌體代謝活力的影響Fig.5Effect of the concentration of lipopeptid

26、e from Bacillusnatto on metabolism3結(jié)論與討論本實(shí)驗(yàn)初步探討了納豆菌脂肽抑制金黃色葡萄2012年第11期Science and Technology of Food Industry球菌的機(jī)理。通過(guò)脂肽對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞膜通透性、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、細(xì)胞代謝方面的影響結(jié)果表明，納豆菌脂肽作用金黃色葡萄球菌可使其細(xì)胞膜通透性增加，或細(xì)胞膜形成孔洞導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)一些物質(zhì)泄漏，使細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，進(jìn)而導(dǎo)致死亡。根據(jù)目前的研究成果，已提出桶-板11、毯式12、環(huán)形孔模式13來(lái)解釋抗菌肽的膜穿透活性。毯式模型中，當(dāng)抗菌肽濃度較高時(shí)，表面定向排列的抗菌肽可能以類似于去污

27、劑的方式破壞脂質(zhì)雙分子層，使細(xì)菌胞膜形成碎片14。王云起等研究發(fā)現(xiàn)抗菌肽maganim 以“毯式”作用模型瓦解了E.coli 的外壁到達(dá)內(nèi)膜，抗菌肽分子環(huán)繞著菌體切斷胞膜，使E.coli 細(xì)胞從中部斷裂成兩節(jié)15。本研究中，3MIC 抗菌肽作用金黃色葡萄球菌的掃描電鏡結(jié)果表明，金黃色葡萄球菌細(xì)胞是斷裂的，殘缺的。因此，納豆菌脂肽作“毯式”模型的方式發(fā)用于金黃色葡萄球菌可能是以揮功能的。有研究表明某些抗菌肽可與細(xì)菌染色體DNA 發(fā)生相互作用，進(jìn)而導(dǎo)致DNA 的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、表達(dá)功能7-8受抑制。本研究中納豆菌脂肽抑制部分蛋白質(zhì)的合成，但是不能夠?qū)е码娪緱l帶的消失即不能夠抑制其合成完全受阻。納豆菌脂

28、肽抑制部分蛋白質(zhì)的合成，有可能是納豆菌脂肽使得金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，使得這部分蛋白質(zhì)泄漏到細(xì)胞外面，或者這部分蛋白質(zhì)合成有關(guān)的物質(zhì)滲透到細(xì)胞外面，從而抑制這部分蛋白質(zhì)的合成。納豆菌脂肽能否進(jìn)入到金黃色葡萄球菌細(xì)胞核內(nèi)與細(xì)菌染色體DNA 發(fā)生相互作用，進(jìn)而抑制金黃色葡萄球菌部分蛋白質(zhì)的合成還有待進(jìn)一步研究。屆東西方食品業(yè)高層論壇，2009：9-10.研究與探討 3鐘青萍，謝俊杰，余世望納豆茵的分離鑒定及其抗菌活性J食品科學(xué)，2002，23（10）：109-112.4鐘青萍. 納豆菌抗菌蛋白在食品防腐中的應(yīng)用J中國(guó)食品添加劑，2003（3）：66-69.5孫力軍，王雅玲. 一種新型抗

29、菌肽水產(chǎn)保鮮劑APNT-6的急性毒性評(píng)價(jià)C.中國(guó)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì)第六屆年會(huì)暨第五屆東西方食品業(yè)高層論壇，2009：9-10.6Fehlbaum P ，Bulet P ，Chernysh S ，et al. Structure activity analysis of thanatin a 21-residue inducible insect defense peptide with sequence homology to frog skin antimicrobial peptides J.Proc Natl Acad Sci USA ，1996，93：1221-1225.7Kanyshk

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