植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、植 物 組 織 培 養(yǎng)實(shí)驗(yàn)報(bào)告學(xué)院:生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院班級(jí):10生技植物班學(xué)號(hào):2010193023姓名:李勝程植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)報(bào)告一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握無(wú)菌操作的植物組織培養(yǎng)方法；2通過配置MS培養(yǎng)基母液，掌握母液的配置和保存方法；3通過誘導(dǎo)豌豆根、莖、葉形成愈傷組織 學(xué)習(xí)愈傷組織的建立方法；4通過誘導(dǎo)豌豆莖、葉形成愈傷組織 學(xué)習(xí)愈傷組織的建立方法；5了解植物細(xì)胞通過分裂、增殖、分化、發(fā)育, 最終長(zhǎng)成完整再生植株的過程, 加深對(duì)植物細(xì)胞的全能性的理解。二、實(shí)驗(yàn)原理 （一）植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)是把植物的器官，組織以至單個(gè)細(xì)胞，應(yīng)用無(wú)菌操作使其在人工條件下，能夠繼續(xù)生長(zhǎng)，甚至分化發(fā)育成一完整植株的

2、過程。植物的組織在培養(yǎng)條件下，原來(lái)已經(jīng)分化停止生長(zhǎng)的細(xì)胞，又能重新分裂，形成沒有組織結(jié)構(gòu)的細(xì)胞團(tuán)，即愈傷組織。這一過程稱為“脫分化作用”，已經(jīng)“脫分化”的愈傷組織，在一定條件下，又能重新分化形成輸導(dǎo)系統(tǒng)以及根和芽等組織和器官，這一過程稱“再分化作用”。 （二）植物細(xì)胞的全能性 植物細(xì)胞的全能性即是每個(gè)植物的本細(xì)胞或性細(xì)胞都具有該植物的全套遺傳基因，在一定培養(yǎng)條件下每個(gè)細(xì)胞都可發(fā)育成一個(gè)與母體一樣的植株。 （三）組織的分化與器官建成 外植體誘導(dǎo)出愈傷組織后，經(jīng)過繼代培養(yǎng)，可以在愈傷組織內(nèi)部形成一類分生組織即具有分生能力的小細(xì)胞團(tuán)，然后，再分化成不同的器官原基。有些情況下，外植體不經(jīng)愈傷組織而直接

3、誘導(dǎo)出芽、根。 （四）培養(yǎng)基的組成培養(yǎng)基中各成分的比例及濃度與細(xì)胞或組織的生長(zhǎng)或分化所需要的最佳條件相近，似成功地使用該培養(yǎng)基進(jìn)行組織培養(yǎng)的主要條件。營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基一般由無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)、碳源和能源、維生素、植物激素（生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑）和包括有機(jī)氮、酸和復(fù)雜物質(zhì)的添加劑組成。三、實(shí)驗(yàn)器材高壓滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、烘箱、培養(yǎng)室 鑷子、記號(hào)筆、橡皮筋、玻璃器皿、三角燒瓶、燒杯、量筒、剪刀、棉塞、繩子、牛皮紙、酒精燈、噴霧器等。四、實(shí)驗(yàn)材料豌豆種子五、實(shí)驗(yàn)藥品藥品 、70% 酒精、 0.1% 升汞、MS培養(yǎng)基、蒸餾水、NaOH、 84消毒液、蔗糖、瓊脂等。六、實(shí)驗(yàn)步驟 （一）培養(yǎng)基母液的配制表1.MS培養(yǎng)基個(gè)成分的含量

4、（單位：mg/L）成分 含量 成分 含量成分 含量NH4NO31650ZnSO47H2O8.6鹽酸硫胺素0.4KNO31900H3BO36.2鹽酸吡哆醇0.5KH2PO4170KI0.83煙酸0.5CaCl22H2O440Na2MnO42H2O0.25蔗糖30000MgSO47H2O370CuSO45H2O0.025瓊脂8000FeSO44H2O27.8CoCl26H2O0.025PH6.0Na-EDTA37.3肌醇100MnSO47H2O22.3甘氨酸2表2.MS培養(yǎng)基所需母液以及擴(kuò)大倍數(shù)名稱擴(kuò)大倍數(shù)定容體積(ml)吸取毫升數(shù)/L大量元素5050020微量元素5050020Ca鹽505002

5、0Mg鹽5050020Fe鹽5050020有機(jī)10020010肌醇10020010激素100505（注：吸取毫升數(shù)為每升培養(yǎng)基所吸取的母液的體積）表3.配制母液所需的藥品及稱取量（注：根據(jù)表1與表2計(jì)算各物質(zhì)的稱取量）藥品名稱稱取量（mg）藥品名稱稱取量（mg）NH4NO341250KI20.75KNO347500Na2MnO42H2O6.25KH2PO44250CuSO45H2O0.625藥品名稱稱取量（mg）藥品名稱稱取量（mg）CaCl22H2O11000CoCl26H2O0.625MgSO47H2O9250肌醇2000FeSO44H2O695甘氨酸40Na-EDTA932.5鹽酸硫胺素

6、8MnSO47H2O557.5鹽酸吡哆醇10ZnSO47H2O215煙酸10H3BO3155（1） MS大量元素母液的配制參考表3稱取一定量的下列藥品用蒸餾水溶解，定容至500ML存放于冰箱中備用。名稱重量（mg）名稱重量(mg)NH4NO341250KH2PO44250KNO347500CaCl2·2H2O11000（2） MS微量元素母液參考表3稱取一定量的下列藥品用蒸餾水溶解，定容至500ML存放于冰箱中備用。名稱重量(mg)名稱重量(mg)KI20.75Na2MoO4·2H2O6.25H3BO3155CuSO4·5H2O0.625MnSO4·7H

7、2O557.5CoCl2·6H2O0.625ZnSO4·7H2O215（3） MS有機(jī)母液參考表3稱取一定量的下列藥品用蒸餾水溶解，定容至200ML存放于冰箱中備用。名稱重量(mg)名稱重量(mg)肌醇2000鹽酸硫胺素8煙酸10甘氨酸40鹽酸吡哆醇10（4） MS鐵鹽母液的配制參考表3稱取一定量的下列藥品用蒸餾水溶解，定容至500ML存放于冰箱中備用。名稱重量(mg)名稱重量(mg)EDTA二鈉932.5FeSO4·4H2O695（5） MS鈣鹽母液的配制參考表3稱取11000mg的CaCl22H2O用蒸餾水溶解定容至500ML，保存于冰箱備用。（6） MS鎂鹽

8、母液的配制參考表3稱取9250mg的MgSO47H2O用蒸餾水溶解定容至500ML，保存于冰箱備用。（7） MS肌醇母液的配制參考表3稱取2000mg的肌醇用蒸餾水溶解定容至200ML，保存于冰箱備用。（8） MS激素母液的配制各種生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素要單獨(dú)配制，不能混合在一起，生長(zhǎng)素類一般要先用少量95%的酒精或1當(dāng)量的NaOH溶解，細(xì)胞分裂素一般要先用1當(dāng)量的鹽酸溶解，然后再加蒸餾水定容。一般取100mg配成100ml母液。（二）培養(yǎng)基的配制以配制1L的MS培養(yǎng)基為例進(jìn)行如下操作：（1） 取1L的大燒杯，加入適量的蒸餾水在電磁爐上加熱至沸騰；（2） 分別?。ㄒ唬┲信渲频?種母液放入小燒杯中，

9、然后加入，邊加邊攪拌；（3） 稱取30g蔗糖加入，邊加邊攪拌；（4） 稱取8g瓊脂加入，邊加邊攪拌，知之瓊脂粉溶解；（5） 定容至1L，加入激素母液，用NaOH調(diào)PH6.0左右；（6） 將培養(yǎng)基分別分裝于洗好的三角瓶中，塞上棉塞包上牛皮紙用繩子扎緊；（7） 放入消毒滅菌鍋滅菌，滅菌20分鐘左右；（8） 滅菌后從滅菌鍋中取出培養(yǎng)基，平放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上令其冷卻凝固。（三）高壓蒸汽滅菌鍋的使用方法具體操作步驟：（1） 高壓鍋放水至平把架；（2） 把包扎好的培養(yǎng)基裝入高壓鍋；（3） 蓋上熱壓鍋蓋,上緊螺帽(注意對(duì)角擰緊螺帽)關(guān)上氣閥和安全閥；（4） 然后接通電源；（5） 壓力計(jì)升至0.05MPa時(shí)，打開放

10、氣閥,排除冷空氣(此步很重要)；（6） 排除冷空氣后,關(guān)閉放氣閥，待壓力升到0.11MPa位置時(shí)，開始計(jì)算滅菌時(shí)間，具體方法：當(dāng)壓力鍋指針升至0.12MPa時(shí)，關(guān)閉電源，待指針下降至0.11MPa時(shí)接通電源，不斷重復(fù)此操作過程，維持20分鐘；（7） 滅菌時(shí)間達(dá)到20分鐘后，除去電源，打開放氣閥(注意要逐漸放氣)待高壓鍋內(nèi)的空氣完全排除后，打開熱壓滅菌鍋蓋(注意對(duì)角扭松螺帽)稍待冷后再把培養(yǎng)基取出；（8） 經(jīng)過滅菌的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基不宜放置太長(zhǎng)，應(yīng)盡早使用，但為了在使用前能檢查培養(yǎng)基有無(wú)微生物污染，可將培養(yǎng)基置于25下保存4天，如果培養(yǎng)基需要貯存較長(zhǎng)時(shí)間，可在4低溫下保存。 總結(jié)：高壓滅菌鍋的使用方法

11、可歸納為：進(jìn)水放進(jìn)培養(yǎng)基蓋緊鍋蓋關(guān)上放汽閥檢查安全閥接上加熱源待壓力升至0.05MPa時(shí)排鍋內(nèi)冷空氣，關(guān)上放氣閥0.11MPa(121)下滅菌2025分鐘，保持穩(wěn)定壓力除熱源逐漸打開放氣閥鍋內(nèi)空氣排除完后開放鍋蓋稍冷后取出培養(yǎng)基。（四）、無(wú)菌操作技術(shù) 1、植物材料表面消毒劑滅菌從外界或室內(nèi)選取的植物材料，都不同程度地帶有各種微生物。這些污染源一旦帶入培養(yǎng)基，便會(huì)造成培養(yǎng)基污染。因此，植物材料必須經(jīng)嚴(yán)格的表面滅菌處理，再經(jīng)無(wú)菌操作手續(xù)接到培養(yǎng)基上，這一過程叫做接種。 2、接種步驟： 第一步：清理材料流水沖洗加入吐溫（或洗衣粉）清洗 自來(lái)水沖洗；第二步：對(duì)材料的表面浸潤(rùn)滅菌 ： 70%酒精浸10-

12、30秒無(wú)菌水；第三步：滅菌劑處理 0.1-1%升汞5-8 min（或其他滅菌劑） ； 第四步：無(wú)菌水進(jìn)行沖洗。注意事項(xiàng)：（）滅菌劑一般要臨時(shí)配制，現(xiàn)配現(xiàn)用升汞可以短期儲(chǔ)存；（）對(duì)去除較容易的滅菌劑滅菌后無(wú)菌水沖洗-次，升汞一般-次，每次不少于min；（）滅菌時(shí)要輕輕的攪拌，消除氣泡，使消毒更徹底；（）滅菌時(shí)間是從倒入消毒液開始，至倒入無(wú)菌水時(shí)為止；（）滅菌液要充分浸沒材料。 3、無(wú)菌操作可按以下步驟進(jìn)行：（1）在接種3天前用甲醛熏蒸接種室，并于接種前3小時(shí)打開其內(nèi)紫外線燈進(jìn)行殺菌；（2）在接種前20分鐘，打開超凈工作臺(tái)的風(fēng)機(jī)以及臺(tái)上的紫外線燈；（3）接種員先洗凈雙手，在緩沖間換好專用實(shí)驗(yàn)服，并

13、換穿拖鞋等；（4）上工作臺(tái)后，用酒精棉球搽拭雙手，特別是指甲處。然后搽拭工作臺(tái)面；（5）先用酒精棉球搽拭接種工具，再將鑷子和剪刀從頭至尾過火一遍，然后反復(fù)過火尖端處，對(duì)培養(yǎng)皿要過火烤干；（6）接種時(shí)，接種員雙手不能離開工作臺(tái)，不能說(shuō)話、走動(dòng)和咳嗽等；材料吸干后，一手拿鑷子、一手拿剪刀或解剖刀，對(duì)材料進(jìn)行適當(dāng)?shù)那懈?。（如葉片切成0.5cm2的小塊；莖切成含有一個(gè)節(jié)的小段。微莖尖要?jiǎng)兂芍缓?-2片葉原基）在接種過程中要經(jīng)常灼燒接種器械，防止交叉污染；（7）接種完畢后要清理干凈工作臺(tái)，可用紫外線燈滅菌30分鐘，若連續(xù)接種，每5天要大強(qiáng)度滅菌一次。（五）豌豆的萌發(fā)與豌豆外植體的接種 1、 準(zhǔn)備 打開超

14、凈工作臺(tái)，將鑷子酒精燈放如超凈工作臺(tái)中，用紫外燈照 20min后關(guān)閉紫外燈，同時(shí)將豌豆種子用自來(lái)水沖20min關(guān)閉紫外燈后在臺(tái)上點(diǎn)燃 2 個(gè)酒精燈，用棉球?qū)㈣囎訜?次，超凈作臺(tái)少2次。將滅菌溶液，無(wú)菌水， 豌豆，大燒杯等放入超凈工作臺(tái)。2、 滅菌 在超凈工作臺(tái)上取經(jīng)浸泡處理的豌豆，先用酒精倒入種子瓶中約23消毒一次（1-2s）接著用無(wú)菌水沖洗一次。再用84 消毒液搖晃清洗清洗 3 次，每次 5 分鐘，清洗完后用無(wú)菌水沖洗一次。而后用 0.5%HgCl 泡8min，處理 2 次，每次 5 分鐘。后用無(wú)菌 水搖晃清洗 4-5次。3、 接種 將所要用的三角瓶用75的酒精噴濕，接著把手噴濕并把三角瓶帶

15、入超凈工作臺(tái)。接著將滅菌處理好的豌豆種子在超凈工作臺(tái)上用鑷子靠近酒精燈的外焰放入向下傾斜的錐形瓶杯中，每個(gè)瓶?jī)?nèi)裝 4 粒豌豆，接種過程中錐形瓶應(yīng)一直保持向下傾斜，直到接種完畢蓋上棉塞，貼上標(biāo)簽，放入光照培養(yǎng)箱中。一周后挑選長(zhǎng)勢(shì)較好的幼苗用同樣的接種方法將外植體接入三角瓶中，貼上標(biāo)簽，放入暗處。（注：接兩瓶莖兩瓶葉，莖剪成0.5厘米左右的小段，將莖上的葉片剪干凈，平鋪在培養(yǎng)基上；葉片成0.5*0.5用鑷子破碎，平鋪在培養(yǎng)基上。）4、 標(biāo)記 接種完畢后，用棉線綁好用鉛筆在牛皮紙標(biāo)上制作人和日期，放入有光的培養(yǎng)架上。5、 定期觀察種子的萌發(fā)情況和外植體的分化情況，記錄種子的萌發(fā)率、污染率以及愈傷組織

16、的誘導(dǎo)率。種子的萌發(fā)率為：83.3% 種子的污染率：0%外植體的污染率：100% 愈傷組織（莖）的誘導(dǎo)率：100% 愈傷組織（葉）的誘導(dǎo)率：100%6、 定期觀察，并紀(jì)錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1）注：實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)入接種室接種之前，應(yīng)先接種前一定要用新潔爾滅等消毒水擦拭，70%75%酒精進(jìn)行噴灑殺菌降塵， 其次一盞酒精燈也是必不可少的，不管是開母苗之前還是接種過程或是開關(guān)子瓶培養(yǎng)基，都應(yīng)該在酒精燈上操作。 操作過程中所有的動(dòng)作都應(yīng)盡量的小幅度，特別是不能橫掃所有滅過菌的東西，如：消過毒的鑷子、手術(shù)刀、培養(yǎng)皿等；接苗是手指不能接觸到瓶口，如果鑷子不小心碰到瓶口或臺(tái)面那就不要猶豫，直接換掉；分切的整

17、個(gè)過程動(dòng)作要快，時(shí)間越長(zhǎng)越容易污染。 剛接種的豌豆萌發(fā)的種子莖的愈傷葉的愈傷外植體（莖） 外植體（葉） 圖1實(shí)驗(yàn)結(jié)果（六）實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析在含有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及植物生長(zhǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)離體植物組織（器官或細(xì)胞）并誘導(dǎo)使其長(zhǎng)成完整植株的技術(shù)。植物的組織培養(yǎng)是根據(jù)植物細(xì)胞具有全能性這個(gè)理論，近幾十年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)無(wú)性繁殖的新技術(shù)。植物的組織培養(yǎng)廣義又叫離體培養(yǎng)，指從植物體分離出符合需要的組織.器官或細(xì)胞，原生質(zhì)體等，通過無(wú)菌操作，在人工控制條件下進(jìn)行培養(yǎng)以獲得再生的完整植株或生產(chǎn)具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的其他產(chǎn)品的技術(shù)。狹義是指組培指用植物各部分組織，如形成層.薄壁組織.葉肉組織.胚乳等進(jìn)行培養(yǎng)獲得再生植株，也指在培養(yǎng)過程中從各器官上產(chǎn)生愈傷組織的培養(yǎng)，愈傷組織再經(jīng)過再分化形成再生植物。植物組織培養(yǎng)不僅僅局限于培養(yǎng)基的培養(yǎng)，還包含有試管苗的移栽技術(shù)。通過