小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子VIGS基因沉默載體構(gòu)建及驗(yàn)證

1、小麥WRK轉(zhuǎn)錄因子VIGS基因沉默載體構(gòu)建及驗(yàn)證：WRKYtranscriptionfactorfamilycanhelpimproveplantstresstolerance，whichwidelyexistinvariousplants.AfterTaWRKYgenewassilencedbyVIGSmethod，itwasfoundthattheproportionofsucceedBgtinoculationincreased，andthepercentageofabnormalappressoriadeclined，suchaspapilla.Theresultsindicatedt

2、hatTaWRKYgeneplayedanimportantroleinwheat-Bgtinteraction.小麥白粉病是由布氏白粉菌(Blumeriagraminisf.sp.Tritici)侵染所引起的真菌感染性病害，如遇高溫多濕天氣病害流行，會(huì)使小麥嚴(yán)重受害，導(dǎo)致減產(chǎn)13%-34%1。因此，科學(xué)家一方面通過(guò)抗病育種，不斷培育新的抗病小麥品種來(lái)抵御病害，另一方面通過(guò)深入的抗病分子機(jī)理研究，克隆抗病相關(guān)基因、弄清抗病信號(hào)通路以及基因工程等技術(shù)手段，以達(dá)到抗病分子育種的目的。轉(zhuǎn)錄因子可以與真核基因啟動(dòng)子區(qū)中的順式作用元件互作，激活或抑制多個(gè)下游功能基因轉(zhuǎn)錄，從而使植株獲得綜合改良效果。研究

3、表明，WRK駿錄因子家族幾乎存在于所有植物中，它們共同含有一段高度保守氨基酸序列WRKYGQK2WRK廣泛參與植物種子萌發(fā)與休眠、開花、代謝、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，還參與抵御生物和非生物脅迫等反應(yīng)過(guò)程。擬南芥AtWRKY3塞因直接調(diào)控了植物抗毒素Camalexin的合成3，并且調(diào)控大量抗病相關(guān)基因的表達(dá)4o大豆中GmWRKY58GmWRKY76過(guò)表達(dá)會(huì)造成作物提早開花，表達(dá)量的區(qū)別對(duì)花形態(tài)造成不同影響5。水稻中OsWRKY6因的過(guò)表達(dá)有助于提高作物對(duì)病原菌的抗性，同時(shí)可直接調(diào)控異分支酸合成酶的表達(dá)從而增加水楊酸的濃度實(shí)現(xiàn)自我調(diào)節(jié)6。小麥(Triticumaestivum)TaWRKY93r調(diào)節(jié)作物對(duì)滲

4、透壓、高鹽、干旱和低溫等脅迫的耐性7。迄今為止，研究人員已經(jīng)在大麥8、擬南芥9、大豆10和水稻11等多種植物中都鑒定到不同數(shù)量的WRK艘錄因子。病毒誘導(dǎo)基因沉默(VIGS-inducedgenesilencing，VIGS)是引起內(nèi)源mRN借異性降解、引起基因轉(zhuǎn)錄沉默的技術(shù)。VIGS試驗(yàn)周期短，操作簡(jiǎn)便，并且無(wú)需轉(zhuǎn)化。近年來(lái)，在植物基因功能研究中，VIGS技術(shù)作為一種簡(jiǎn)單、快速、高效的反向遺傳學(xué)技術(shù)在禾本科植物基因功能研究中發(fā)揮了重要作用12-13。本研究以前期工作獲得的TaWRK基因?yàn)榛A(chǔ)14,利用VIGS技術(shù)獲得沉默植株，通過(guò)對(duì)基因沉默前后白粉菌侵染情況進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)，最終確定TaWRK基因

5、在小麥抗白粉病過(guò)程中的功能。1 材料和方法1.1 試驗(yàn)材料與試劑抗白粉病品種Brock，由RayJohnson博士惠贈(zèng)。小麥白粉菌15號(hào)生理小種，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。1.2 沉默TaWRKYVIGS載體構(gòu)建在目的基因核苷酸序列的非保守區(qū)，設(shè)計(jì)上、下游特異性沉默引物TaWRKY-VIGS-犀口TaWRKY-VIGS-R以抗病小麥Brock總RN蛤成的cDNA?模版，擴(kuò)增富集沉默片段，將該片段與BSMV:連接構(gòu)建重組載體BSMV:TaWRKY構(gòu)建過(guò)程參見Li等15。1.3 基因沉默效率檢測(cè)通過(guò)限制性內(nèi)切酶酶切線性化、體外轉(zhuǎn)錄后，獲得病毒RNA組分通過(guò)摩擦接種方法接種到小麥第2葉上，

6、待接？NH2O（對(duì)照1）、BSMVGFP（對(duì)照2）和BSMVTaWRKYt小麥第3葉伸展完全，采用抖拂法對(duì)各株植株第3葉均勻高密度接種新鮮白粉菌抱子，在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取葉片，利用半定量PCR方法檢測(cè)這3組植株中TaWRK鎏因的mRN脈平的水平變化，從而確定TaWRK鎏因沉默的效率。1.4 基因沉默后對(duì)小麥抗白粉病表型的影響取接種48，72h和7d后的小麥葉片，用考馬斯亮藍(lán)染色方法染色并觀察統(tǒng)計(jì)白粉菌孢子的生長(zhǎng)發(fā)育情況，通過(guò)與對(duì)照白粉菌孢子萌發(fā)、畸形胞比例等的對(duì)比分析，確定目標(biāo)基因在抗白粉病過(guò)程中的貢獻(xiàn)。2 結(jié)果與分析2.1 VIGS沉默載體構(gòu)建根據(jù)已獲得TaWRK鎏因序列，在基因的非保守區(qū)設(shè)計(jì)添加

7、了NheI識(shí)別序列的引物WRKY-V-F（AGCCGCAGCAGCAG）、AACGWRKY-V-RCTTGAAGCTGGGGTCCCTC含TaWRK基因序歹U的重組質(zhì)粒作為模板，擴(kuò)增用于構(gòu)建BSMV1組載體的目的基因片段，擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。目的片段大小約為250bp左右，隨后將回收后的目的片段進(jìn)行酶切形成粘性末端，BSM藏體同樣經(jīng)過(guò)酶切回收，與目的片段進(jìn)行連接，通過(guò)進(jìn)一步篩選、驗(yàn)證，挑選陽(yáng)性克隆送測(cè)驗(yàn)證。2.2VIGS技術(shù)沉默靶基因后TaWRKY表達(dá)水平檢測(cè)在TaWRK基因的特異性核甘酸序列區(qū)段設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增一個(gè)長(zhǎng)227bp的片段構(gòu)建TaWRK基因沉默載體BSMW:TaWRKY本次沉默試驗(yàn)共

8、設(shè)置4個(gè)組別，分別為H2O對(duì)照組（空白對(duì)照）、BSMVGFP對(duì)照組（陽(yáng)i對(duì)照）、BSMVPDS對(duì)照組（沉默PDS基因）、BSMVTaWRKY式驗(yàn)組（沉默目的基因TaWRKY。為了驗(yàn)證本試驗(yàn)所建立的沉默體系成功有效，分別對(duì)各組摩擦接種后約15d的小麥第3葉進(jìn)行表型觀察，結(jié)果如圖2所示。除BSMV：PDS對(duì)照組葉片發(fā)生明顯白化現(xiàn)象之外，其他組葉片均呈綠色，說(shuō)明該基因沉默體系構(gòu)建成功。2.3 TaWRKY基因沉默效率驗(yàn)證為了進(jìn)一步證實(shí)TaWRK鎏因是否被有效沉默，采用半定量PCR勺方法，對(duì)沉默后各組植株中TaWRK鎏因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。從圖中可以看出，摩擦接種后，TaWRKY試驗(yàn)

9、組的mRN冰平明顯低于H2O和GFP對(duì)照組，說(shuō)明小麥內(nèi)源TaWRK鎏因被有效沉默了。另外，在接種重組病毒BSMVGFP后，TaWRK基因的表達(dá)也有輕微下調(diào)，該現(xiàn)象可能是由于病毒的侵染對(duì)植株造成了影響。2.4 TaWRKYS因沉默植株抗病分析為了進(jìn)一步研究TaWRK鎏因在小麥葉片與白粉菌的互作過(guò)程中所起到的調(diào)控作用，本研究使用考馬斯亮藍(lán)染色法分別對(duì)接種48,72h和7d后的GF理、TaWRKY!小麥植株的第3葉進(jìn)行固定、染色、制片，在顯微鏡下進(jìn)行鏡檢，觀察各時(shí)間點(diǎn)中，白粉菌萌發(fā)形態(tài)及生長(zhǎng)狀態(tài)，如圖4所示。從圖4中可以看出：染菌48h后，TaWRKY1白粉菌抱子萌發(fā)狀態(tài)優(yōu)于對(duì)照組，抱子萌發(fā)，芬管伸

10、長(zhǎng)，形成附著胞；染菌72h后，TaWRKY：驗(yàn)組白粉菌孢子大量萌發(fā)形成次生菌絲，而各對(duì)照組中，孢子萌發(fā)出現(xiàn)分瓣型畸形附著胞、纖細(xì)型畸形附著胞等；染菌7d后，TaWRKY試驗(yàn)組白粉菌孢子大量生成串珠狀分生孢子，而各對(duì)照組中，僅有少量孢子萌發(fā)形成次生菌絲。在鏡檢觀察孢子發(fā)育結(jié)構(gòu)的同時(shí)，統(tǒng)計(jì)各個(gè)視野內(nèi)白粉菌孢子萌發(fā)率、畸形率、寄主抗性等參數(shù)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖5、圖6所示。由圖可以得出，接種白粉菌48h后，白粉菌對(duì)TaWRK鎏因沉默后的植株侵染成功率增加，畸形附著胞比例下降，與GFP對(duì)照組相比，TaWRK鎏因沉默組植株白粉菌抱子萌發(fā)率上升，畸形附著胞（分瓣型附著胞、纖細(xì)型附著胞等）比例下降。3 結(jié)論與討論

11、自1994年，Ishiguro和Nakamura16首次?母適恚?Ipomoeabatatas）中克隆出第一個(gè)WRKg白SPF1,研究人員對(duì)于植物WRK艘錄因子家族開展了大量研究。越來(lái)越多的研究結(jié)果表明，WRKYg白在植物生長(zhǎng)發(fā)育，抵御生物以及非生物脅迫等多種生理生化過(guò)程中發(fā)揮重要作用17。前期工作中，筆者在小麥Brock中分離到一個(gè)WRK淡轉(zhuǎn)錄因子基因TaWRKY并初步證實(shí)該基因參與了小麥的白粉菌脅迫應(yīng)答反應(yīng)，但還不能夠較確切了解TaWRK鎏因與小麥抗白粉病之間的關(guān)系12。關(guān)于病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于基因功能研究18-21，但該方法由于涉及到病毒感染，從而影響對(duì)正確結(jié)果的判斷而備受爭(zhēng)議。本研究為了降低這種系統(tǒng)誤差，采取了3個(gè)對(duì)照組，即用GKPg沖液作為摩擦接種介質(zhì)為陰性對(duì)照，用綠色熒光蛋白基因構(gòu)建丫載體BSMV:GFP編碼葉綠素關(guān)鍵酶基因PDS1因構(gòu)建丫載體BSMW:PDS為兩個(gè)陽(yáng)性對(duì)照組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：GKP8沖7和GFP對(duì)照組生長(zhǎng)正常，沒(méi)有病毒侵染后