微波調(diào)節(jié)肢體慢性淋巴水腫纖維化機(jī)理的研究

1、    微波調(diào)節(jié)肢體慢性淋巴水腫纖維化機(jī)理的研究        【摘要】目的探討微波烘療對(duì)肢體慢性淋巴水腫纖維化的影響。方法應(yīng)用ABC免疫組化及原位雜交技術(shù)觀察患肢皮膚組織TGF-和、型前膠原mRNA及多肽含量變化。結(jié)果烘療前TGF-1多肽位于表皮棘層、顆粒層細(xì)胞，真皮及皮下組織中見大量、型膠原纖維并有TGF-和、型前膠原mRNA表達(dá)增加；烘療后表皮細(xì)胞TGF-1陽性染色變淺，、型前膠原纖維變細(xì)，TGF-和、型前膠原mRNA表達(dá)降低。結(jié)論肢體慢性淋巴水腫纖維化發(fā)生，與相關(guān)基因

2、TGF-的過量表達(dá)導(dǎo)致、型膠原等細(xì)胞外基質(zhì)合成增加和沉積有關(guān)，微波烘療可以抑制TGF-基因表達(dá)及多肽的合成，通過減少、型前膠原mRNA表達(dá)及膠原合成逐步逆轉(zhuǎn)皮膚組織纖維化?！娟P(guān)鍵詞】淋巴水腫纖維化微波免疫組化原位雜交 Microwave heating modulation of skin fibrosis in chronic extremity lymphedemaCAO Weigang, ZHANG Disheng, GAN Jiliang(Department of Plastic and Reconstructive Surgery, The Ninth People's H

3、ospital, Shanghai 200011,China)【Abstract】ObjectiveTo observe the effects of microwave heating on skin fibrosis in chronic extremity lymphedema.MethodsSkin specimens from 8 cases of chronic limb lymphedema were tested by in situ hybridization (ISH) combined with avidin-biotin peroxidase (ABC) immunoh

4、istochemistry for detection of TGF-， procollagen ， procollagen mRNAs and corresponding peptides expressions.ResultsIt was discovered that expressions of TGF-1 peptide were located at the spinous and granular layer of the epidermal cells with a great amount of dermal collagen ， formation in accordanc

5、e with high expressions of TGF-， procollagen ， procollagen mRNAs in the dermal and subcutaneous tissue fibroblasts. After microwave heating treatment, the epidermal expression of TGF-1 and relative TGF-，procollagen , procollagen mRNAs expressions in dermal fibroblasts were greatly reduced. The small

6、er calibre of collagen fibers after microwave heating was also observed. ConclusionsIt is indicated that fibrosis in lymphedema is resulted from over-expressions of relevant genes like TGF- and subsequent extracellular matrixes (ECM) syntheses and deposition. Microwave heating can reduce fibroblast

7、expressions of TGF-， procollagen , procollagen mRNAs as well as TGF- peptide synthesis, inhibiting ECM syntheses and deposition and finally reverse the skin fibrosis process.【Key words】Lymphedema;Fibrosis；Microwave；Immunohistochemistry;In situ hybridization肢體淋巴水腫的主要病理特征之一是病變肢體淺層組織的纖維化，其嚴(yán)重程度可代表病情的嚴(yán)重性

8、，同時(shí)亦可作為考核某一方法療效的直接依據(jù)。膠原基本結(jié)構(gòu)單位肽鏈通過相應(yīng)的mRNA模板合成，相應(yīng)基因表達(dá)的多少即mRNA含量的多少直接決定了細(xì)胞合成膠原的多少，因此，直接測(cè)定前膠原肽鏈mRNA含量，較羥脯氨酸測(cè)量法1更能進(jìn)一步從分子水平反映膠原代謝的實(shí)際情況。成纖維細(xì)胞中膠原基因表達(dá)及膠原分子合成受多種因素制約，而TGF-是膠原基因表達(dá)的強(qiáng)力促進(jìn)者2，3，在慢性肢體淋巴水腫纖維化進(jìn)程中，是否有TGF-mRNA和TGF-多肽合成的改變，目前尚不清楚。我們采用原位雜交及免疫組織化學(xué)法分別觀察了TGF-、和型前膠原mRNA和多肽含量變化，以確定其在慢性肢體淋巴水腫皮膚組織纖維化形成中的作用，同時(shí)觀察微

9、波烘療的影響，試從分子水平上闡明微波烘療減輕纖維化的作用機(jī)理。1材料和方法1.1病例選擇本組共8例，其中男性4例，女性4例，年齡868歲，平均33.6歲。烘療前后皮膚組織活檢取自內(nèi)踝內(nèi)上方相近部位，另外還以2例正常皮膚作為對(duì)照。1.2臨床纖維化觀察指標(biāo)應(yīng)用組織張力計(jì)測(cè)定皮膚組織彈性，將微波烘療前后的測(cè)定值相比較，行配對(duì)t檢驗(yàn)。1.3改良膠原VG染色擴(kuò)散度高的小分子染料苦味酸介入結(jié)構(gòu)致密的組織間隙，將組織染成黃色，而擴(kuò)散度低的大分子染料麗春紅，將結(jié)構(gòu)疏松的膠原組織染成紅色。1.4免疫組化采用卵白素-生物素復(fù)合物(ABC)免疫組化法觀察微波烘療前后病變皮膚組織TGF-1及、型膠原含量變化，陽性表達(dá)

10、呈棕色。相應(yīng)一抗均由武漢博士德(BOSTER)生物工程有限公司提供。1.5原位雜交法1.5.1組織切片制備按無RNA酶要求將所取組織制成5 m連續(xù)切片。1.5.2探針制備、型膠原質(zhì)粒(芬蘭TurRu大學(xué)贈(zèng)送)擴(kuò)增后，制成相應(yīng)探針；TGF-寡核苷酸探針經(jīng)DNA合成儀合成，其序列如下：5CTTGCTGTACTGTGTGTCCAA3。經(jīng)隨機(jī)引物法將d-UTP標(biāo)記到、型膠原及TGF-探針上制作成相應(yīng)的DNA探針(試劑盒為德國(guó)Boehringer Mannheim公司產(chǎn)品)。1.5.3原位雜交切片經(jīng)預(yù)雜交、雜交、洗脫、顯色及HE襯染，光鏡下觀察雜交結(jié)果，細(xì)胞內(nèi)有紫色顆粒者為陽性。2結(jié)果微波烘療后，患者均

11、有患肢腫脹感和沉重感的減輕或消失，患肢變松軟，肢體周徑減少，臨床療效明顯。8個(gè)患肢的平均組織張力從治療前的5.13±1.36升高到治療后的6.88±0.99，平均升高了1.75±0.71(P<0.01)，提示患肢治療后組織彈性明顯升高，表明皮膚及皮下組織軟化，纖維化程度減輕。2.1膠原VG染色烘療前真皮層及皮下組織中染成紅色的膠原纖維粗大，伴有較明顯的束間水腫(1)，治療后可見纖維條束變細(xì)、稀疏，束間水腫明顯減輕，提示有降解吸收(2)。1烘療前膠原纖維束粗大致密伴有束間水腫，改良VG染色×100Fig.1Thick collagen bundles

12、 with edema before microwave treatment (Modified VG Stain×100)2烘療后膠原束變細(xì)、稀疏，束間水種減輕，改良VG染色×100Fig.2Collagen bundles become finer with edema regression after the treatment (Modified VG Stain)2.2TGF-1及、型膠原含量變化患肢皮膚皮下組織、型膠原染色表現(xiàn)為彌散性索條狀改變，烘療前較為致密(3)，TGF-1染色陽性細(xì)胞主要位于表皮，以棘層、顆粒層細(xì)胞為明顯，而基底層細(xì)胞則為陰性(5)；真皮組

13、織中血管周圍偶見陽性細(xì)胞。烘療后陽性染色膠原纖維變稀疏(4)。TGF-1染色陽性之表皮細(xì)胞數(shù)量減少、染色變淺(6)。3烘療前型膠原纖維致密，排列紊亂，ABC法×100Fig.3Irregular collagen fibers before the treatment(ABC×100)4烘療后型膠原纖維變稀疏、排列整齊，ABC法×100Fig.4Thinner and regular arranged collagen fibers after the treatment(ABC×100)5烘療前患肢表皮TGF-1染色陽性，ABC法×200Fi

14、g.5TGF-1 positive staining in affected epidermal layersbefore the treatment(ABC×200)6烘療后表皮TGF-1染色陽性表達(dá)降低，ABC法×200Fig.6Lessened TGF-1 expression in epidermal layers after the treatment(ABC×200)2.3TGF- mRNA及、型前膠原mRNA含量變化8例中6例可見較明顯的TGF- mRNA及、型前膠原mRNA表達(dá)，主要位于真皮層成纖維細(xì)胞胞漿及其周圍(7)，血管周圍炎性細(xì)胞及周圍表達(dá)

15、不明顯。正常皮膚及皮下組織成纖維細(xì)胞則較少見到類似表達(dá)。治療后，成纖維細(xì)胞TGF- mRNA及、型前膠原mRNA表達(dá)明顯降低(8)。7烘療前真皮成纖維細(xì)胞TGF-mRNA表達(dá)明顯，ISH×400Fig.7Obvious TGF- mRNA expressions in dermal fibroblasts before the treatment(ISH×400)8烘療后真皮成纖維細(xì)胞TGF-mRNA表達(dá)明顯降低，ISH×400Fig.8Decreased TGF- mRNA expressions in dermal fibroblasts after the

16、treatment(ISH×400)3討論TGF-的生物學(xué)活性十分復(fù)雜，具有顯著的促炎癥反應(yīng)，促進(jìn)纖維連接蛋白(Fibronectin, FN)、Tenascin、膠原和蛋白聚糖等細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的合成和沉積作用4，5，同時(shí)通過降低蛋白酶的合成和增加蛋白酶抑制劑的生成抑制基質(zhì)降解6。以上特性，結(jié)合其自誘導(dǎo)生成作用7，在炎癥的早期及創(chuàng)傷愈合的早期將起到積極作用。但是，TGF-的自誘導(dǎo)正反饋調(diào)節(jié)作用，如不能被及時(shí)抑制，將誘導(dǎo)損傷部位過量的ECM沉積，是形成慢性、進(jìn)行性瘢痕、纖維化直至破壞正常組織結(jié)構(gòu)的主要原因。以往人們?cè)谀I小球、肺、肝臟等部

17、位的纖維化研究中也發(fā)現(xiàn)，TGF-異常增高是纖維增生的一個(gè)決定性因素8-11。我們的研究結(jié)果證實(shí)，發(fā)生慢性肢體淋巴水腫時(shí)，局部組織成纖維細(xì)胞有TGF- mRNA及、型前膠原mRNA的表達(dá)增加，經(jīng)微波烘療后，TGF- mRNA及多肽的表達(dá)均有所降低。產(chǎn)生這種變化的可能原因是慢性肢體淋巴水腫時(shí)皮膚及皮下組織慢性炎癥反應(yīng)，局部單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等釋放包括TGF-在內(nèi)的各種細(xì)胞因子，且TGF-通過其自誘導(dǎo)及旁分泌途徑，調(diào)控TGF- mRNA表達(dá)增加7，從而源源不斷的產(chǎn)生出更多的TGF-，過量的TGF-又誘發(fā)了、型前膠原等ECM mRNA表達(dá)的增加，這與我們烘療前觀察到的結(jié)果相吻合，、型前膠

18、原mRNA表達(dá)增加促進(jìn)ECM合成及沉積，最終導(dǎo)致纖維化形成。已知微波烘療能顯著減輕皮膚、皮下組織小血管周圍的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)12，這將打斷TGF-不斷形成的基礎(chǔ)，相應(yīng)的TGF- mRNA及、型前膠原mRNA表達(dá)降低，膠原等ECM合成減少，且TGF-尚有抑制膠原酶基因表達(dá)、阻止膠原降解的作用，TGF-的降低也將有助于膠原降解6，通過降低膠原等ECM可合成及增加其降解最終纖維化得到改善。臨床表現(xiàn)為組織彈性升高，、型膠原變纖細(xì)，VG染色示膠原束變稀疏等。微波烘療減輕纖維化的另一機(jī)理可能是通過直接調(diào)控TGF- mRNA及、型前膠原mRNA表達(dá)的降低，從而抑制TGF-及ECM合成來實(shí)現(xiàn)。此外，在我們的研究中

19、發(fā)現(xiàn)，TGF-1 mRNA表達(dá)主要位于真皮層成纖維細(xì)胞中，而TGF-1多肽表達(dá)則主要位于表皮層，一種可能的情況是表皮角質(zhì)細(xì)胞本身合成了TGF-，另一種情況則是真皮層其他細(xì)胞如成纖維細(xì)胞合成后轉(zhuǎn)運(yùn)到此，尚有待進(jìn)一步研究。作者單位：曹衛(wèi)剛(200011上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科)張滌生(200011上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科)干季良(200011上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科)參考文獻(xiàn)1，張如鴻，黃文義，干季良，等.烘綁治療后淋巴水腫皮膚纖維化程度的變化.中國(guó)修復(fù)重建外科雜志，1995，9：165-168.2，Wahl SM. Transforming gro

20、wth factor beta (TGF-) in inflammation: a cause and a cure. J Clin Immunol, 1992,12:61-74.3，Varga J, Rosenbloom J, Jimenez SA. Transforming growth factor (TGF-) causes a persistent increase in steady-state amount of type and type collagen and fibronectin mRNAs in normal human dermal fibroblasts. Bio

21、chem J, 1987,247:597-604.4，Roberts AB, Sporn MB, Assoian RK, et al. Transforming growth factor-: rapid induction of fibrosis and angiogenesis in vivo and stimulation of collagen formation in vitro. Proc Natl Acad Sci USA, 1986,83:4167-71.5，Iganotz RA, Massague J. Transforming growth factor- stimulat

22、es the expression of fibronectin and collagen and their incorporation into the extracellular matrix. J Biol Chem, 1986,261:4337-4345.6，Edwards DR, Murphy G, Reynolds JJ, et al. Transforming growth factor beta modulates the expression of collagenase and metalloproteinase inhibitor. EMBO J, 1987,6:189

23、9-1904.7，Kim SJ, Jeang KT, Glick AB, et al. Promoter sequences of the human transforming growth factor-1 gene responsive to transforming growth factor-1 autoinduction. J Biol Chem, 1989,264:7041-7045.8，Okuda S, Languino LR, Ruoslahti E, et al. Elevated expression of transforming growth factor- and proteoglycan production in experimental glomerulonephritis. Possible role in expansion of the mesangial extrace