基于Sol-gel膜和多壁碳納米管鉑納米顆粒增效的電流型L-

1、基于Sol-gel膜和多壁碳納米管/鉑納米顆粒增效的電流型L-乳酸生物傳感器    Manners make the man.             作者：賀曉蕊 于京華 葛慎光 張秀明 林青朱晗 封爍 袁靚 黃加棟【摘要】  構(gòu)建了基于多壁碳納米管（Multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs）和

2、鉑納米顆粒（Pt-nano）的電流型L-乳酸生物傳感器。將Sol-gel膜覆蓋在L-乳酸氧化酶（L-lactate oxidase，LOD）和MWCNTs/Pt-nano修飾的電極表面。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：傳感器的最佳工作條件為：檢測電壓0.5 V；緩沖液pH 6.4；檢測溫度25 。此傳感器的響應(yīng)時間為5 s， 靈敏度是6.36 A/（mmol/L）()。連續(xù)檢測星期其活性仍保持90%，線性范圍為0.22.0 mmol/L，且抗干擾能力強(qiáng)。在實(shí)際血樣的檢測中，此傳感器與傳統(tǒng)的分光光度法具有很好的一致性。 &#

3、160; 【關(guān)鍵詞】  生物傳感器； L-乳酸； 溶膠-凝膠； 鉑納米顆粒； 多壁碳納米管        Abstract  An electrochemical L-lactate biosensor was fabricated by combining Platinum nanoparticles(Pt-nano) with

4、0;multi-walled carbon nanotubes(MWCNTs).L-lactate oxidase(LOD) was immobilized on the surface of the glassy carbon electrode(GCE) modified with MWCNTs and Pt-nano.The surface of resulting LO

5、D/MWCNTs/Pt-nano electrode was covered by a thin layer of sol-gel to avoid the loss of LOD and to improve the anti-interference ability.The cyclic voltammetric results indicat

6、ed that MWCNTs/Pt-nano catalyst displayed a higher performance than MWCNTs.Under the optimized conditions，i.e.，applied potential of 0.5 V，pH 6.4，25 ，the proposed biosensors determination ran

7、ge was 0.22.0 mmol/L，response time was within 5 s，and the sensitivity was 6.36 A（mmol/L）.It still kept 90% activity after 4 weeks.The fabricated biosensor had practically good

8、 selectivity against interferences.The results for whole blood samples analyzed by the present biosensor showed a good agreement with those analyzed by spectrophotometric method.Keyword

9、s  Biosensor； L-lactate； ol-gel； latinum nanoparticles； ulti-walled carbon nanotubes1  引言臨床醫(yī)學(xué)、牛奶工業(yè)、葡萄酒工業(yè)、生物技術(shù)和運(yùn)動醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域都需要靈敏、快速的L-乳酸檢測方法。特別是血乳酸水平能夠反映人體的多種病理狀態(tài)。傳統(tǒng)的L-乳酸的檢測主要采用分光光度計(jì)法1。但這種方法過程復(fù)雜、成本高。生物傳感器因其選擇性高、響應(yīng)快和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)被認(rèn)為是最適合的生化分析儀器之一(醫(yī)藥學(xué)/臨床醫(yī)學(xué)論文 )

10、。目前，關(guān)于檢測乳酸含量的電化學(xué)傳感器已有報(bào)道2，3。但簡便、便宜和選擇性高的L-乳酸傳感器依然是目前研究的熱點(diǎn)。The small courtesies sweeten life; the greater ennoble it.  碳納米管（Carbon nanotubes，CNTs）擁有許多特殊性質(zhì)，如高電導(dǎo)性、高化學(xué)穩(wěn)定性，以及非常高的機(jī)械強(qiáng)度和系數(shù)4，5。CNTs包括單壁碳納米管（Single-walled carbon nanotubes，SWCNTs）和多壁碳納米管（Multi-walled carbon nanotube

11、s，MWCNTs）。當(dāng)被用作電化學(xué)反應(yīng)的電極材料時，SWCNTs和MWCNTs都有提高電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的能力。研究表明：MWCNTs可增強(qiáng)電極表面的電催化活性和增大其表面積6。文獻(xiàn)7表明：CNTs修飾的電極能夠顯著增強(qiáng)兒茶酚胺神經(jīng)傳遞素、細(xì)胞色素C、抗壞血酸、NADH和肼復(fù)合物的電化學(xué)性能。CNTs能夠提高NADH和H2O2的電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，這表明它在基于脫氫酶和氧化酶的電流型生物傳感器方面有廣闊的應(yīng)用前景。鉑納米顆粒（Patinum nanoparticles，Pt-nano）是一種有效的酶傳感器的構(gòu)建材料。它具有很好的生物相容性、大的表面積及對H2O2的催化能力強(qiáng)11。First tr

12、y, and then trust.  本研究構(gòu)建了基于MWCNTs和Pt-nano的電流型L-乳酸生物傳感器。為阻止電極表面上的酶分子的丟失和提高傳感器的抗干擾能力，采用Sol-gel膜12，13覆蓋LOD/MWCNTs/Pt-nano電極表面。對構(gòu)建的生物傳感器的檢測范圍、響應(yīng)時間、敏感性和穩(wěn)定性進(jìn)行了研究?？疾炝藀H值、電位、溫度和電活性干擾物對傳感器電流的影響， 并將此傳感器應(yīng)用于全血分析。Still waters have deep bottoms.  2  實(shí)驗(yàn)部分  2.1  試劑與儀器Early m

13、istakes are the seeds of future trouble.  L-乳酸氧化酶（LOD，E.C.1.1.3.2，34 units/mg，from Pediococcus species）、二甲基亞砜（DM）、正硅酸四乙酯（TEOS，99%）、Triton X 100均購自Sigma公司；L-乳酸、L-乳酸鋰購自Fluka公司；多壁碳納米管（MWCNTs，直徑約15 nm，純度95%，中科院成都有機(jī)化學(xué)研究所）；氧化鋁粉末（Merck公司）；H2PtCl6·6H2O（天津市第二化學(xué)試劑有限公司）；

14、磷酸鹽緩沖液（0.05 mol/L KH2PO4，0.05 mol/L K2HPO4，0.1 mol/L KCl）作為支持電解質(zhì)。其它試劑均為分析純，無需純化直接使用。實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。電化學(xué)測試在283電化學(xué)工作站（EG & G，USA）上進(jìn)行，使用270軟件。采用傳統(tǒng)的三電極體系：Sol-gel/LOD/MWCNTs/Pt-nano修飾的玻璃碳電極（Glass carbon electrode，GCE，=3 mm）作為工作電極，鉑片作為對電極，Ag/AgCl作為參比電極。

15、電流的測定是在攪拌的條件下進(jìn)行的。2.2  Sol-gel標(biāo)準(zhǔn)溶液、納米鉑溶液和MWCNTs標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制在燒杯中按照一定的比例加入TEOS，H2O和0.1 mol/L HCl，不停地?cái)嚢柙摶旌先芤褐钡饺芤鹤兦宄?，即得Sol-gel儲備溶液。此儲備溶液被應(yīng)用于整個實(shí)驗(yàn)中，并可根據(jù)需要對其進(jìn)行稀釋。根據(jù)文獻(xiàn)14制備Pt-nano溶液。將4 mL 5% H2PtCl6·6H2O溶液加入到340 mL蒸餾水中，在80 下邊攪拌邊加熱。加入60 mL 1%檸檬酸鈉溶液后，在（80&#

16、177;0.5） 保溫4 h。此過程通過吸附光譜記錄。當(dāng)PtCl6的吸附帶消失的時候， 表明反應(yīng)結(jié)束。   圖1  Pt-nano的TEM圖（放大倍數(shù)100000）（略）Everybody's business is nobody's business.  Fig.1  Transmission electron micrograph of platinum nanoparticles(Pt-nano)(×100000)

17、將2 mg MWCNTs加入到1 mL二甲基亞砜溶液中，超聲攪拌，制備成黑色懸濁液狀的MWCNTs溶液。In a great river great fish are found; but take heed lest you be drowned.  2.3  制備Sol-gel/LOD/MWCNTs/Pt-nano修飾的酶電極  用0.05 m Al2O3粉打磨玻碳電極，超聲清洗，再分別用1 mol/L HNO3和1 mol/L NaOH清洗，然后用雙蒸水徹底清

18、洗。20 L MWCNTs和20 L鉑納米顆?；旌现瞥少A備溶液，超聲40 min，得到均勻分散的MWCNTs和Pt-nano溶液。將10 L MWCNTs和Pt-nano溶液滴加到玻璃碳電極的表面，使之均勻分布在電極的整個表面上，然后將電極在室溫下干燥30 min。再用2 L LOD溶液覆蓋MWCNTs和Pt-nano復(fù)合膜修飾的電極表面。在室溫下干燥20 min后，加6 L Sol-gel儲備溶液到酶層的表面，然后在室溫下干燥。最后，將酶電極浸入到pH 6.8的緩

19、沖液中，保存在4 的冰箱中過夜，以便除去電極表面過量的L-乳酸氧化酶。用去離子水徹底清洗電極，即得Sol-gel/LOD/MWCNTs/Pt-nano修飾的電極。The wise hand doth not all that the fool.  3  結(jié)果與討論A man cannot whistle and drink at he same time.  3.1  Sol-gel/LOD/MWCNTs/Pt-nano修飾電極的電化學(xué)特性Politeness costs nothing and gains everythi

20、ng.  研究了MWCNTs/Pt-nano和MWCNTs修飾的電極對L-乳酸的電催化行為。由圖2可見，MWCNTs/Pt-nano和MWCNTs都能增加傳感器的電流響應(yīng)。  圖2  裸電極(a)、MWCNTs修飾的電極（b）、MWCNTs/Pt-nano修飾的電極(c)的CV圖（略）Fig.2  Cyclic voltammograms of L-lactate on bare GCE(a)，MWCNTs modified electrode(

21、b)，MWCNTs/Pt-nano modified electrode(c)1 mmol/L L-乳酸(L-lactate)，掃描速率(Scanning rate) 50 mV/s，0.1 mol/L PBS，電壓（Polential） 5 V，pH 6.4.但是MWCNTs/Pt-nano修飾的電極顯示出比MWCNTs修飾的電極有更好的電流增效作用。由圖2中曲線b和c可見，MWCNTs/Pt-nano修飾的電極對L-乳酸的電催化活性比MWCNTs修飾的電極強(qiáng)。因?yàn)镸WCN

22、Ts/Pt-nano修飾電極的電化學(xué)性能得到了提高，電子能夠更容易快速地在酶和MWCNTs/Pt-nano層之間傳遞。Answer a fool according to his folly.  3.2  pH值對傳感器響應(yīng)的影響  研究了pH值在5.68.0范圍內(nèi)變化對傳感器電流響應(yīng)的影響（圖3）。不同pH值的L-乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度均為1 mmol/L。實(shí)驗(yàn)表明： pH<6.4時，傳感器的響應(yīng)電流隨著pH值的增大而顯著增大； pH=6.4時，傳感器的響應(yīng)電流達(dá)到最大；pH>6.4時，傳感器的響應(yīng)電流下降。本實(shí)驗(yàn)

23、選擇pH 6.4的緩沖液作為檢測L-乳酸的緩沖液。 論文教育信息網(wǎng)  3.3  溫度對傳感器響應(yīng)的影響  在pH 6.4的緩沖液中，研究了550 范圍內(nèi)溫度對傳感器響應(yīng)電流的影響（圖4）。在525 范圍內(nèi)，隨著溫度的提高，傳感器的響應(yīng)電流逐漸增大; 在25 條件下，反應(yīng)達(dá)到最大值; 然后隨著溫度的提高，傳感器的響應(yīng)電流快速下降，這可能是因?yàn)楦邷厥姑缸冃栽斐傻摹Ｔ谳^高的溫度下，蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)被破壞，酶分子的構(gòu)象被打開，從而失去了活性15。Early mistakes are

24、the seeds of future trouble.  圖3  緩沖液pH值對傳感器響應(yīng)的影響（略）A man cannot whistle and drink at he same time.  Fig.3  Effect of pH of buffer solution on response of biosensor1 mmol/L L-乳酸(L-lactate)； 0.1 mol/L 

25、PBS； 0.5 V.  圖4  溫度對傳感器響應(yīng)的影響（略）Fig.4  Effect of temperature on response of biosensorAll are not saints that go to church.  1 mmol/L L-乳酸(L-lactate)； 0.1 mol/L PBS； pH 6.4； 0.5 V.3.

26、  電流反應(yīng)和工作曲線Make the night night, and the day day, and you will have a pleasant time of it.  在上述優(yōu)化條件下，探討生物傳感器對L-乳酸的響應(yīng)。實(shí)驗(yàn)在攪拌的0.1 mol/L pH 6.4的緩沖液中進(jìn)行。圖5a和圖5b分別為在未加入Pt-nano（A）和加入Pt-nano（B）的情況下酶電極的電流響應(yīng)的標(biāo)定曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：修飾有MWCNTs/Pt-nano的電極的電流響應(yīng)高于只修飾有MWCNTs的電極。修飾有MWCNTs的電極達(dá)到95%信號的

27、響應(yīng)時間小于15 s。傳感器反應(yīng)的線性范圍是0.252.0 mmol/L; 靈敏度是3.99 A/(mmol/L); 相關(guān)系數(shù)為0.989; 檢出限為0.01 mmol/L（S/N=3）。修飾有MWCNTs/Pt-nano的電極達(dá)到95%信號的響應(yīng)時間小于5 s。傳感器反應(yīng)的線性范圍是0.22.0 mmol/L; 靈敏度是6.36 A/(mmol/L); 相關(guān)系數(shù)是0.999; 檢出限是0.3 mol/L（S/N=3）。上述結(jié)果表明：Pt-nano能顯著提

28、高傳感器的性能。  圖5  MWCNTs/Ptnano/GCE(a)和MWCNTs/GCE(b)修飾的傳感器的電流隨葡萄糖濃度的工作曲線及其線性相關(guān)點(diǎn)（略）We are here to add what we can to life, not to get what we can from it.  Fig.5  Linear correlation points of Calibration plots and I-c curves for&#

29、160;the MWCNTs/Ptnano/GCE(a) and MWCNTs/GCE(b)God defend me from my friends; form my enemy I can defend myself.  0.1 mol/L PBS (pH 6.4) at 0.5 V vs.Ag/AgClIf you run after two heares, you will ca.  與其它基于Sol-gel的的方法構(gòu)建的L-乳酸傳感器1618相對比，結(jié)果表

30、明：本研究構(gòu)建的L-乳酸傳感器具有較大的響應(yīng)電流、較低的檢出限，表明Pt-nano結(jié)合MWCNTs提高了傳感器的電化學(xué)性能。3.5  抗干擾性Quality is better than quantity.  在干擾物各自生理濃度水平上考察了其對L-乳酸響應(yīng)的干擾。在0.5 mmol/L L-乳酸溶液中，對其含有的對乙酰氨基酚（0.13 mmol/L）、葡萄糖（5.45 mmol/L）、尿酸（0.35 mmol/L）、抗壞血酸（0.055 mmol/L）、半胱氨酸（0.015 mmol/L）進(jìn)行

31、檢測(見表1)。結(jié)果顯示：對乙酰氨基酚、葡萄糖、尿酸、抗壞血酸、半胱氨酸對L-乳酸的測定幾乎沒有影響。說明此傳感器具有很好的抗干擾能力。原因是MWCNTs/Sol-gel修飾的玻璃碳電極降低了H2O2氧化還原過電位。A clear conscience is a sure card.  表1  L-乳酸檢測中可能的其它底物的干擾(0.1 mol/L PBS pH 6.4) （略）  Table 1  Possible interferences from&

32、#160;other substrates for L-lactate determination (0.1 mol/L phosphate buffer at pH 6.4)Hide one's talents in a napkin.  電流比率(Current ratio)=IL+I/II。其中IL+I和IL分別為干擾物存在和無干擾物的情況下L-乳酸的響應(yīng)電流(IL+I is the response curre

33、nt of L-lactate in the presence of interference.IL is the response current of L-lactate)。0.5 mmol/L L-乳酸(L-lactate).  3.6  傳感器的重復(fù)性和穩(wěn)定性Money is the root of all evil.  用同一傳感器對0.5 mmol/L L-乳酸溶液連續(xù)檢測5

34、次，相對標(biāo)準(zhǔn)差是0.4%；用5個傳感器對0.5 mmol/L L-乳酸溶液進(jìn)行檢測，相對標(biāo)準(zhǔn)差是2.0%。以上結(jié)果表明，構(gòu)建的傳感器具有很好的重復(fù)性。Money is the root of all evil.  每隔5 d測定一次傳感器對5 mmol/L乳酸溶液的響應(yīng)值。當(dāng)傳感器不用時，儲存在0.1 mol/L PBS溶液（pH 6.8）中，室溫放置。連續(xù)檢測4星期以后，傳感器的響應(yīng)值仍保持在最大響應(yīng)值的90%，表明此傳感器具有很好的穩(wěn)定性。3.7  人血樣中L-乳酸的臨床檢測在最適條件下，應(yīng)

35、用此傳感器檢測人血樣中L-乳酸，對其實(shí)際應(yīng)用性能進(jìn)行評估，并將其與分光光度法進(jìn)行對比，結(jié)果見表2。表2  兩種方法對血樣中L-乳酸的檢測（略）Table 2  Determination results of L-lactate in real serum using two methods對結(jié)果進(jìn)行t校驗(yàn)： t0.09288； t0.05(11)= 1.7959； tt 0.05(11)， p0

36、.05。  由以上結(jié)果可以看出，兩種方法測定結(jié)果無顯著差異。本傳感器對樣品的測定結(jié)果與分光光度法具有很好的一致性?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 Kurita R，Hayashi K，F(xiàn)an X，Yamamoto K，Kato T，Niwa O.Sensors and Acturators B， 2002，87（2）：2963032 Shkotova L V，Goriushkina T B，Tran-Minh 

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38、54 Li J M.Nature，1991，354（）：56585 Q Xia(秦 霞)，W Yan-Yan(王艷艷)，Z Zi-Xia(趙紫霞)，W Xin-Sheng(王新勝)，L Sha(李 莎)，Y Min(于 敏)，H Nan(黃 楠)，M Zhi-Ying(苗智穎)，C Qiang(陳 強(qiáng)).Chinese J.Anal.Chem.(分析化學(xué))， 2008，36(6)：8278306&

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