姜黃素體內(nèi)外給藥及含藥血清對小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響

1、姜黃素體內(nèi)外給藥及含藥血清對小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響                    作者：馮文茹，趙秀梅，劉利萍，胡人杰【摘要】  目的探討姜黃素3種不同給藥途徑對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響。方法通過噻唑藍(lán)（MTT）比色法比較姜黃素3種給藥途徑對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果姜黃素體內(nèi)給藥和含藥血清能夠促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖，體外實驗證實姜黃素能夠抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖，并呈量效關(guān)系。結(jié)論姜黃素與其代謝產(chǎn)物對

2、淋巴細(xì)胞增殖作用的影響是相反的。 【關(guān)鍵詞】  姜黃素； 淋巴細(xì)胞； 含藥血清Abstract：ObjectiveTo probe into the hyperplasy effect of different curcumine administered approaches for the splenic lymphocyte of mice.MethodsThe effect of curcumine on the proliferation of spleen lymphocytes through three different administration routes

3、were determined with MTT test. ResultsCurcumine administrated in vivo and its drug serum upregulated the proliferation of spleen lymphocytes.Out-of-body experience certified curcumine could suppress the hyperplasy of the mice splenic lymphocyte. It presented dose-effect relationship. ConclusionIt is

4、 contrary that the effect of curcumine and its metabolite on the proliferation of spleen lymphocytes.Key words：Curcumin  ;  Lymphocyte;  Drug serum   姜黃素是中藥姜黃的主要成分，有很重要的經(jīng)濟(jì)價值和廣泛的藥理作用。如抗氧化、抗炎、降血脂、抗腫瘤等1。近些年來有關(guān)姜黃素生物活性的研究越來越多。體外實驗證實姜黃素具有免疫調(diào)節(jié)的作用2，但其對體內(nèi)給藥的免疫調(diào)節(jié)的作用未見報道。本文通過體內(nèi)外及血清藥理學(xué)的

5、對比實驗著重對此進(jìn)行了研究觀察，以期為進(jìn)一步研究其免疫藥理作用提供實驗依據(jù)。1  材料1   動物ICR小鼠 雌性，體重 1820 g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部提供，實驗動物合格證編號：0034800。2   試劑與儀器RPMI1640，批號1285082，GIBCO公司產(chǎn)品；刀豆蛋白（ConA），Sigma 公司提供；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT），北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，批號：T15051/15181；姜黃素，由本所植化室提供；小牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品，批號：061201。CO2孵箱，REVCO；電子天平，MET

6、TLER，AE240；96孔板，由greiner bio-one  提供；酶標(biāo)儀，well scan MK3 Labsystems Dragom。2  方法2.1   姜黃素體內(nèi)對小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響ICR小鼠60只，分為5組，即正常對照組和姜黃素4個劑量組，對照組每日灌胃生理鹽水，姜黃素給藥組分別每日灌胃給藥50，100，200和400 mg/kg的姜黃素。連續(xù)給藥7 d，于末次給藥后，取各種小鼠脾臟無菌制備單個脾細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×106/ml，置于96孔板中，并增設(shè)ConA對照組（濃度為5 g/ml），該組細(xì)胞懸液取自正常對照

7、組。取每只小鼠的脾細(xì)胞懸液75 l加入96孔板中，并設(shè)4個復(fù)孔。除正常對照組，其余各組均加入25 l ConA；隨后，正常對照組加入125 l RPMI1640培養(yǎng)液，其余各組各孔均加入RPMI1640培養(yǎng)液100 l，使反應(yīng)總體積為200 l/孔。置5%CO2孵箱37培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入10 l MTT(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，培養(yǎng)結(jié)束后，1 000 r/min離心10min，棄上清液，每孔加入150 l DMSO，充分振蕩后室溫靜置10 min。進(jìn)行酶標(biāo)儀檢測，讀取A570nm值。2.2  姜黃素體外對小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響在無菌條件下，常規(guī)制備脾

8、細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×106/ml，然后按實驗分組：細(xì)胞對照組、ConA對照組、ConA姜黃素組。將新分離的小鼠脾細(xì)胞懸液加入96孔板中，各組均加入細(xì)胞懸液75 l/孔，ConA對照組和ConA姜黃素組加ConA 25 l/孔。然后ConA姜黃素組加入含有不同濃度姜黃素（0.88，1.76，3.52，7.03，14.06，28.13，56.25，112.5，225 g/ml）的RPMI1640培養(yǎng)液100l/孔。設(shè)4個復(fù)孔。姜黃素藥物對照組加入含上述不同濃度姜黃素的RPMI1640培養(yǎng)液100 l，再加入RPMI1640培養(yǎng)液100 l。細(xì)胞對照組和ConA對照組分別加入RPM

9、I1640培養(yǎng)液，使反應(yīng)總體積為200 l/孔。加樣完畢置5%CO2孵箱37培養(yǎng)72h，培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入10 l MTT(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，培養(yǎng)結(jié)束后，1 000 r/min離心10 min，棄上清液，每孔加入150 lDMSO，充分振蕩后室溫靜置10 min。進(jìn)行酶標(biāo)儀檢測，讀取A570 nm值。2.3  姜黃素含藥血清對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響2.3.1  含藥血清的制備 ICR動物20只，分為5組，每組4只，即正常對照組和姜黃素50 ，100，200和400 mg/kg，對照組灌胃生理鹽水，給藥組灌胃不同濃度的姜黃素， 0.2 ml/10 g

10、體重，連續(xù)給藥5 d，末次給藥后1，2和4 h摘眼球無菌取血，3 000 r/min離心10 min，無菌分離血清后，每組合并血清，經(jīng)56 30 min 滅活，-20保存，1個月內(nèi)使用。2.3.2  淋巴細(xì)胞增殖活性的測定無菌制備脾細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×106/ml，按上“含藥血清的制備”分組進(jìn)行加樣。參照文獻(xiàn)3，于96孔培養(yǎng)板每孔加入100 l脾細(xì)胞懸液，再加入80 l ConA（2.5 g/ml）及20 l不同時相含藥血清，使每孔含藥血清的含量為10%，設(shè)4個復(fù)孔。對照組加入相應(yīng)體積的無藥血清培養(yǎng)。加樣完畢置5%CO2孵箱37培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加

11、入10 l MTT(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，培養(yǎng)結(jié)束后，1 000 r/min離心10 min，棄上清液，每孔加入150 l DMSO，充分振蕩后室溫靜置10 min。進(jìn)行酶標(biāo)儀檢測，讀取A570 nm值。2.4   統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)以±s表示，用t檢驗統(tǒng)計。3  結(jié)果3.1   姜黃素體內(nèi)對小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響實驗結(jié)果見表1。由表1可見，姜黃素在50，100，200和400 mg/kg之間，在ConA的誘導(dǎo)下，隨著藥物濃度的增加，增殖活性也在逐漸增加，基本呈量效關(guān)系。表1  姜黃素體內(nèi)對小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

12、（略）3.2   姜黃素體外對小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響由表2 可見，姜黃素體外實驗各給藥組與ConA組比較，在濃度為0.883.52g/ml時，除濃度0.88g/ml似有促進(jìn)增殖作用（無統(tǒng)計學(xué)意義）外，基本可以看出在該濃度范圍姜黃素對淋巴細(xì)胞增殖作用無明顯的影響。姜黃素在濃度7.03225g/ml之間時則表現(xiàn)出明顯的抑制ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖的作用，該抑制作用基本上呈劑量依賴性。         表2  姜黃素體外對小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響（略）與ConA對照組比較， P0.01

13、3.3  姜黃素含藥血清對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響由表3可見，姜黃素含藥血清濃度為10%時，400 mg/kg組與ConA對照組比較1，2 h時相未表現(xiàn)出增殖活性，4 h時增殖活性明顯。50200 mg/kg組與對照組比較，1，2和4 h 時均表現(xiàn)出明顯的增殖活性， P0.01。表3  姜黃素體外對小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響（略）與對照組比較，P0.014  討論   維持機(jī)體免疫功能主要依賴于各種功能正常的免疫細(xì)胞和細(xì)胞之間的相互作用。其中T淋巴細(xì)胞多數(shù)寄居在脾臟，參與細(xì)胞免疫，是特異性免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)4。本實驗通過3種作用途徑觀察姜黃素對淋巴細(xì)

14、胞轉(zhuǎn)化功能的影響。姜黃素口服給藥50，100，200和400 mg/kg這4個劑量組的脾淋巴細(xì)胞，在ConA的誘導(dǎo)下，隨著藥物濃度的增加增殖活性也在增加，說明姜黃素口服給藥可以提高機(jī)體的特異性免疫功能。姜黃素體外實驗表明，姜黃素在0.883.52 g/ml時，對ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞的增殖無影響，在濃度7.03225 g/ml之間明顯的抑制了ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞的增殖，與文獻(xiàn)報道的結(jié)果相近2。根據(jù)文獻(xiàn)報道5，我們采集了姜黃素口服末次給藥后1，2，4 h的血，分離出血清，在體外實驗中，姜黃素含藥血清表現(xiàn)出一定的增殖活性與體內(nèi)實驗結(jié)果相一致。   姜黃素體內(nèi)外實驗結(jié)果相佐

15、，即姜黃素體外表現(xiàn)出強(qiáng)烈的細(xì)胞毒活性，而體內(nèi)（包括含藥血清）表現(xiàn)出明顯地促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的活性，提示姜黃素口服后可以吸收，通過吸收入血后發(fā)揮其藥理作用；口服姜黃素所產(chǎn)生的體內(nèi)免疫增強(qiáng)作用其物質(zhì)基礎(chǔ)很可能不在于姜黃素本身而是其相應(yīng)的代謝產(chǎn)物。有關(guān)姜黃素的藥代動力學(xué)實驗研究表明，姜黃素的血藥濃度低或基本測不到，生物利用度不高，可能與其吸收、代謝有關(guān)?？诜S素在小腸吸收時有生物轉(zhuǎn)化（與葡萄糖醛酸，硫酸結(jié)合，還原為四氫姜黃素和六氫姜黃素），但結(jié)合和還原的比例還不明確。在肝中也有姜黃素結(jié)合或還原產(chǎn)物。姜黃素主要是在小腸還是在肝中進(jìn)行的生物轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的作用尚未確定5。   總之本

16、項研究表明，姜黃素與其“代謝產(chǎn)物”有著不同的生物活性，體外姜黃素表現(xiàn)出明確的細(xì)胞毒活性2，而其“代謝產(chǎn)物”的細(xì)胞毒活性“消失”。我們另一項實驗結(jié)果證實，與姜黃素本身比較它的含藥血清不具有抗腫瘤增殖的生物活性。同時，本實驗結(jié)果尚可證實，姜黃素口服給藥在體內(nèi)最終發(fā)揮生物作用的是其代謝產(chǎn)物而非原型藥物，當(dāng)然這一結(jié)論的確證最終尚需進(jìn)一步證實。   此外，通過本項實驗觀察進(jìn)一步驗證了中藥體內(nèi)給藥與其含藥血清體外實驗結(jié)果的一致性，即含藥血清體外實驗結(jié)果與體內(nèi)實驗結(jié)果相符合。4h采集的含藥血清誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞增殖的活性明顯高于1和2 h采集的血清，這一現(xiàn)象與一般認(rèn)為大多含藥血清采集在12 h（多數(shù)藥物口服給藥后達(dá)峰時間）活性較強(qiáng)不符6，結(jié)合文獻(xiàn)資料單次口服姜黃素達(dá)峰時間為0.751 h5，進(jìn)一步提示姜黃素體內(nèi)免疫增強(qiáng)（調(diào)節(jié)）作用來自其代謝產(chǎn)物而非其本身。【參考文獻(xiàn)】  1 國家藥典委員會. 中國藥典S.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2000:218.2 李新建,劉曉城. 姜黃素調(diào)節(jié)小鼠免疫功能的實驗研究J. 中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志,2005,14（2）:132.3 梁春敏,王賢喜. 玉屏風(fēng)散對小鼠免疫調(diào)節(jié)作用的血清藥理學(xué)研究J. 上海免疫學(xué)雜志,2003,23（6）：