凋亡素基因重組腺病毒的構建

1、凋亡素基因重組腺病毒的構建 【摘要】 目的 構建攜凋亡素基因的腺病毒載體，為進一步研究凋亡素基因功能及其作用機制建立基礎。方法 Pmel酶切線性化已經構建好的含凋亡素基因的穿梭質粒pAdTrackCMVVP3，然后電轉化到BJ5183AD1細胞中進行同源重組。Pac酶切出含凋亡素基因的腺病毒DNA，然后轉染293細胞進行包裝獲得重組腺病毒，運用RTPCR鑒定重組腺病毒。用氯化銫梯度離心純化病毒。用物理和生物方法確定病毒的滴度。結果 Pac酶切證實同源重組成功。綠色熒光觀察證實病毒包裝成功并且具有感染力，RTPCR證實了重組腺病毒具有凋亡素蛋白的編碼。重組腺病毒的濃度為84.52109 VP/m

2、l，滴度為6.561109 PFU/ml。結論 成功構建含凋亡素基因的重組腺病毒，它的滴度足以滿足體內外實驗。 【關鍵詞】 凋亡素基因 腺病毒載體 基因治療 【Abstract】 Objective To construct a recombinant adenovirus carrying Apoptin gene so as to provide basis for further studying Apoptin gene functions and ascertaining corresponding mechanism. Methods The shuttle vector pAdT

3、rackCMVVP3 containing Apoptin gene was linearized with Pmel and subsequently electrotransformed into BJ5183AD1 cells for homologous recombination. The DNA containing Apoptin gene of the recombinant adenovirus was obtained by digesting with PacI and then transfected into 293 cells, where the recombin

4、ant adenovirus containing Apoptin gene was identified by RTPCR and purified by cesium choride density centrifugation. Finally, the titre of the recombinant adenovirus was determined by biological and physical assays. Results Digestion with PacI proved successful homologous recombination. Green fluor

5、escence showed successful recombinant adenovirus with infectiveness. RTPCR confirmed that the recombinant adenovirus had coding of Apoptin gene proteins. The titre of the recombinant adenovirus was 84.52109 VP/ml and 6.561109 PFU/ml. Conclusion The recombinant adenovirus vector containing Apoptin ge

6、ne is successfully constructed, with its titre sufficient for in vivo and in vitro experiment. 【Key words】 Apoptin gene; Adenovirus vector; Gene therapy 凋亡素，又稱Apoptin(apoptosis induction)1，是來源于雞貧血病毒(chicken anemia virus,CAV)的小分子蛋白質。它能引發(fā)一些腫瘤細胞凋亡和細胞轉化，而對正常細胞無此作用。在腫瘤的治療上具有巨大潛力1。由于凋亡素是外來物質，在發(fā)揮作用前必須進入細胞，

7、所以我們選擇腺病毒作為載體來運載它，以期能探索它的作用機制，為腫瘤的治療提供新的途徑。 1 材料與方法 1.1 含凋亡素基因的穿梭質粒PAdtrackCMVVP3的獲得2我們已經成功構建了含凋亡素基因的穿梭質粒，并且通過了酶切和測序鑒定，為下一步實驗的進行奠定了基礎2。 1.2 含凋亡素基因的腺病毒基因組(PAdVP3)質粒的構建 1.2.1 同源重組 pAdTrackCMVVP3用Pmel酶切，線性化，再用堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)進行去磷酸化處理，最后電轉化(BioRad Gene Pulser Electropoerator 2 500 V 200 m

8、ax)到BJ5183AD1細胞中，與其內的pAd Easy1進行同源重組。設置陰性對照組為空載體pAdTrackCMV，經過以上處理后同樣進行同源重組。 1.2.2 酶切鑒定 只有重組成功才能用Pac酶切出兩個不同長度的條帶：長的為23 kb，短的根據(jù)重組位點不同而不同，可以為3.0或4.5 kb條帶。無論在何位點重組均不影響pAdVP3腺病毒基因組的功能。 1.3 含凋亡素基因腺病毒DNA的獲得 從含pAdVP3腺病毒基因組的質粒中使用Pac酶切，然后用膠回收23 kb的DNA片段，即重組腺病毒基因組。 1.4 重組腺病毒在293細胞內的包裝、擴增及鑒定 1.4.1 重組腺病毒的包裝 將獲得

9、的重組腺病毒DNA轉染293細胞。6孔細胞培養(yǎng)板種入2105細胞，待細胞密度達到60%，除去培養(yǎng)基，用不含小牛血清的DMEM洗滌細胞(5 min)，加入500 l不含小牛血清的DMEM與5 g 重組腺病毒DNA和5 l Lipofectamine reagent的混合物(混合10 min后加入)，空白對照用不含目的基因的腺病毒DNA轉染。37 孵育箱中孵育3 h，吸取培養(yǎng)基，加入4 ml培養(yǎng)基重新孵育67 h后，再次更換培養(yǎng)基37 孵育57 d，此期間細胞長滿后可以傳代至大的培養(yǎng)瓶內繼續(xù)生長。每天用熒光顯微鏡觀察有否熒光蛋白以判斷有無病毒的產生。當50%細胞出現(xiàn)熒光蛋白時不再傳代和換液，只是加

10、液，直到病毒的繼續(xù)產生。此時收集培養(yǎng)液和細胞，將上述細胞懸液移入5 ml的離心管中，并在-80 和37 水浴中反復凍融3次，每次凍融后，旋轉離心管1次，以使細胞懸液充分凍融，室溫下，12 000g離心10 min，沉淀細胞碎屑，將上清液(主要成分為病毒原液)移入新的離心管中于-80 保存。 1.4.2 重組腺病毒的擴增 將AD293細胞接種于6孔板上，使每孔內細胞數(shù)達到(78)105。吸去培養(yǎng)液，然后加入1 ml新鮮培養(yǎng)液，同時加入200 l病毒原液混勻，37 孵育2 h，再加入2 ml培養(yǎng)液繼續(xù)孵育。每日用熒光顯微鏡觀察情況。當有病毒產生后即按上述方法收集病毒液。 1.4.3 重組腺病毒的鑒

11、定 由于我們已經通過觀察熒光蛋白的情況證實了重組腺病毒是包裝出來的，并且具有感染能力。下一步需證實的是該腺病毒是否有目的蛋白的編碼。采用RTPCR方法鑒定。轉染后48 h，用Trizol抽提各孔細胞的總RNA，以Oligo(dT)為引物合成cDNA。然后以cDNA為模板，用人工合成的凋亡素基因上下游引物行PCR檢測。 1.5 重組腺病毒的純化及滴度測定 我們將擴增的病毒送成都基因治療腫瘤藥物工程技術研究中心純化和滴度測定。 1.5.1 純化 采用氯化銫梯度離心方法純化。 1.5.2 滴度測定 1.5.2.1 物理檢測：物理檢測指腺病毒蛋白和DNA(主要是DNA)能吸收紫外線的特性來測定，其對應

12、公式為：1OD=1.11012病毒數(shù)。根據(jù)這個線性關系能測出病毒的實際病毒數(shù)。 1.5.2.1 生物檢測：我們采用嗜斑形成單位(plaque forming units,PFU)來描述病毒的感染力。既通過觀察細胞病變(cytopathic effect,CPE)來確定病毒的感染能力。用5% FBSDMEM將待測樣本稀釋至其106倍，再在盛2 ml 5% FBSDMEM培養(yǎng)液離心管(5 ml)中進行3倍倍比稀釋(12)，共12管，各管有病毒液2 ml。用5% FBSDMEM培養(yǎng)液調細胞密度為1105/ml，在96孔培養(yǎng)板中每孔加入此細胞懸液100 l，置于37 5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24

13、h。棄去培養(yǎng)液，將倍比稀釋的第1管病毒液加入第1列，第2管病毒液加入第2列，100 l/孔，直至第12管。培養(yǎng)后第12天顯微鏡下觀察各孔，以培養(yǎng)孔中發(fā)生病變細胞數(shù)多于50為陽性，計數(shù)陽性細胞孔數(shù)。并以下式計算所測樣本病毒顆粒滴度3 腺病毒載體滴度 =稀釋倍數(shù)稀釋度(CPE陽性細胞孔數(shù)-4)/8 =1063(CPE陽性細胞孔數(shù)-4)/8(PFU/ml) 2 結果 2.1 含凋亡素基因的腺病毒基因組(PAdVP3)質粒的獲得(見圖1) 圖1 含凋亡素基因腺病毒基因組質粒的Pac酶切圖 M: Hind,DNA Marker； 1：含腺病毒DNA的質粒Pac酶切電泳 從圖1中可以看出：Pac酶切能切出

14、兩個條帶：大于23 kb和4.5 kb的條帶。表示同源重組成功。 2.2 重組腺病毒的包裝 當感染病毒后293細胞增大，細胞絲狀結構消失，細胞核增大，到第3天時，可觀察到細胞已崩解成熒光碎片。由于有新病毒的產生，可使受感染的293細胞數(shù)目增多，到第5天，細胞全部出現(xiàn)熒光蛋白，隨后熒光減弱，表示病毒已開始從多數(shù)的細胞內釋放。到第7天時大部分細胞脫落，可看到細胞有發(fā)泡現(xiàn)象，細胞結構不清，并且細胞脫壁，漂浮在培養(yǎng)液中出現(xiàn)細胞崩解釋放病毒。此時收集病毒液。見圖2。 2.3 重組腺病毒的鑒定(見圖3) 從圖3可看出：含凋亡素基因的腺病毒具有編碼凋亡素蛋白的活性。而不含凋亡素基因的腺病毒不具有。 2.4

15、重組腺病毒的滴度測定 2.4.1 物理檢測 重組腺病毒的濃度為84.52109 VP/ml，見圖4。不含凋亡素基因的腺病毒的濃度為67.14109 VP/ml，見圖5。 2.4.2 生物檢測 實驗發(fā)現(xiàn)，重組腺病毒及不含凋亡素基因的腺病毒均可見68個陽性孔(發(fā)生細胞病變率大于50%)，故滴度均為：1063(68-4)/8=6.561109 PFU/ml。 圖3 重組腺病毒的RTPCR M: DL2000 DNA Marker； 1： 不含凋亡素基因的腺病毒感染293細胞后的RTPCR結果； 2： 含凋亡素基因的腺病毒感染293細胞后的RTPCR結果。 3 討論 腺病毒載體是目前基因治療研究和臨床

16、應用中采用最多的載體，它具有不整合入細胞基因組，毒性低，致病性小，宿主范圍廣，對分裂及非分裂期細胞有較高的感染率和滴度，裝載容量大等特點。已廣泛用于基因治療研究4，且已被美國FDA批準作為基因治療載體應用于臨床試驗。 本實驗的AdEasy系統(tǒng)為Johns Hopkins大學癌癥研究中心He博士構建5。與以前的腺病毒構建相比，它有如下優(yōu)點：(1)腺病毒基因組是以超螺旋形式存在大腸桿菌中，而非哺乳細胞內，可使同源重組效率由傳統(tǒng)方法的20%提高到80%90%，并且方便酶切鑒定；(2)在產生含目的基因的腺病毒基因組過程中，沒有連接步驟，增加了目的基因導入腺病毒基因組的效率和準確性；(3)能接入高達10

17、 kb的目的基因，并且允許導入多個基因；(4)腺病毒基因組中含有綠色熒光蛋白基因，便于直接觀察轉染和感染的效率，使實驗可靠和準確；(5)該系統(tǒng)使用的是人的腺病毒屬和人的宿主細胞系，故其能表達多種蛋白質并能正確進行翻譯后的修飾和折疊。因此用此構建產生的病毒可以不用嗜斑純化就能獲得含目的基因的腺病毒，從而大大減少了復制活性病毒的產生。我們在構建含凋亡素基因的腺病毒過程中，在熒光蛋白的指示下，能充分觀察到含目的基因的腺病毒基因組轉染293細胞的情況，在第7天觀察到大量293細胞脫落、崩解，與文獻報道的一致5。與沒有熒光蛋白指示的轉染靠主觀判斷來決定病毒產生時間相比，充分保證了最高滴度病毒的獲取，為病

18、毒的純化創(chuàng)造了條件。 病毒顆粒(viral particles,VP)或光學顆粒(optical partical unit,OPU)是物理方法檢測的結果。它不能區(qū)別傳染型和缺陷型病毒，但它的結果從一個實驗室到另一個實驗室都很恒定。而基因轉移單位(gene transfer unit,GTU)和PFU是生物方法檢測的結果。他們能具體說明病毒感染細胞的能力，但不同實驗室給出的結果是各不相同的，使交流受限6。所以我們同時采用以上兩種方法來說明病毒的量和活力，為以后的實驗打下基礎。 293細胞是轉染腺病毒E1A基因的人胚腎上皮細胞系，有致瘤性，是轉化細胞。由于凋亡素基因具有引發(fā)細胞轉化和腫瘤細胞凋亡

19、的特性，那么它會引發(fā)293細胞的凋亡，從而阻止病毒顆粒的包裝嗎?答案是否定的。因為凋亡素基因編碼的凋亡素蛋白需定位到細胞核，并且有量的積累才能引發(fā)細胞的凋亡，那么在這一過程中病毒已經包裝成功并且釋放出來7。Pietersen等8用PCMVVP3質粒轉染293、911和PER.C6細胞(均是腺病毒的包裝細胞)，在不同時間點收集這些細胞檢測凋亡率，發(fā)現(xiàn)在48 h，包裝細胞的凋亡率為25%；5 d達到80%。而腺病毒的包裝到釋放一共才需48 h8。因此凋亡素蛋白的作用并不影響腺病毒的包裝和釋放。我們的實驗也證實了凋亡素基因的功能并不影響腺病毒的包裝和釋放。細胞感染病毒后會出現(xiàn)一些不同于凋亡的形態(tài)變化

20、，這些變化稱為CPE。首先是細胞形態(tài)的變化，由于病毒能增強細胞膜的滲透性，細胞外的離子如鈉離子流入胞內，細胞可從原來的形態(tài)變?yōu)閳A形，然后由于細胞支架的降解或破裂導致細胞從基質上脫落，最后破裂。也可出現(xiàn)臨近細胞的膜融合形成一個含有多個核的大細胞，稱為多核體。多核體細胞生存短暫，隨即裂解，釋放出病毒6。我們從293細胞的熒光照片觀察到如下現(xiàn)象：細胞由原來的梭形變?yōu)閳A形，細胞核增大，核質比例明顯增大，細胞逐漸從貼壁生長中松脫，漂浮于培養(yǎng)液中，約到第7天細胞崩解釋放出病毒。以上這些變化充分說明了含凋亡素基因的腺病毒能在293細胞內包裝成熟后釋放。 本研究成功的構建了凋亡素基因重組腺病毒。我們希望能夠以

21、腺病毒載體為介導，進一步研究凋亡素基因對消化道腫瘤的作用機制，為消化道腫瘤的基因治療提供候選基因，并為臨床前研究提供實驗依據(jù)。【參考文獻】 1 Rohn J L, Noteborn M H. The viral death effectou Apoptin reveals tumorspecific processesJ. Apoptosis, 2004,9(3):315-337.2 陳健，王曙光.凋亡素基因轉染對人膽管癌細胞凋亡作用的研究J.第三軍醫(yī)大學學報，2005，27(15)：1593-1595.3 Keriel A, Rene C, Galer C, et al. Canine adenovirus vectors for lungdirected gene transfer: efficacy, immuneresponse, and duration of transgene expression using helperdependent vectorsJ. J of Virology,2006,80(3):1487-1496.4 Bernt K M, Ni S, Tieu A T, et al. Assessment of a combined adenovirusmediated oncoly