關(guān)于健脾與補(bǔ)腎對(duì)脾虛模型大鼠學(xué)習(xí)記憶及腦內(nèi)P物質(zhì)、血管活性腸

1、關(guān)于健脾與補(bǔ)腎對(duì)脾虛模型大鼠學(xué)習(xí)記憶及腦內(nèi)P物質(zhì)、血管活性腸肽的影響    【摘要】  目的 探討脾虛模型大鼠學(xué)習(xí)記憶和腦內(nèi)P物質(zhì)(SP)、血管活性腸肽(VIP)的變化,以及健脾、補(bǔ)腎中藥對(duì)上述變化的改善作用。方法 采用苦降瀉下、飲食失節(jié)加勞倦過度法建立脾虛大鼠模型,檢測(cè)健脾與補(bǔ)腎對(duì)其學(xué)習(xí)記憶及腦內(nèi)SP、VIP變化的影響。結(jié)果 水迷宮實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)期和記憶期,模型組游全程時(shí)間長(zhǎng),錯(cuò)誤次數(shù)多；健脾組與補(bǔ)腎組游全程時(shí)間短,錯(cuò)誤次數(shù)少。跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)期和記憶期,模型組錯(cuò)誤次數(shù)較多,潛伏期短；健脾組錯(cuò)誤次數(shù)較少,潛伏期長(zhǎng)

2、；在學(xué)習(xí)期補(bǔ)腎組錯(cuò)誤次數(shù)較少,潛伏期較長(zhǎng),但記憶期錯(cuò)誤次數(shù)較多( 【關(guān)鍵詞】  脾虛模型大鼠；學(xué)習(xí)記憶；P物質(zhì)；血管活性腸肽     Abstract：Objective To inquire into the changes of learning and memory ability and the level of SP, VIP in the

3、0;brain of the model of Spleen insufficiency. To observe the influence invigorating spleen and restoring virility on above changes. Methods Establishing the spleen insufficiency mo

4、del of rat by adopting bitter decline diarrhea, wild eating and overworking, to examine influence of invigorating spleen and restoring virility on the ability of learning 

5、;and memory with the change of SP and VIP in the brain. Results In the period of study and remember of the water maze experiment, the swim whole distance t

6、ime was long and mistake number was many in the model group； the swim whole distance time was short and the mistake number was little in the group of invig

7、orating the Spleen and restoring virility. In the period of study and remember of the diving platform experiment, the mistake number of times is more and the incubat

8、ion period was short in the model group； the mistake number was less and the incubation period was long in Spleen invigrating group. At the period of remember m

9、istake number was more. In the model group, the immunoreaction masculine substance of SP level decrease obviously in the hypothalamus ventral kernel, the hippocampi CA1 area&#

10、160;and forehand cortex； on above mentioned parts, the group of invigorating spleen and restoring virility increases distinctly, in the group of restoring virility increases distin

11、ctly in the hippocampi CA 1 area and forehead cortex, but decreased in hypothalamus ventral kernel. In the model group, the immunoreaction masculine substance of VIP leve

12、l decreased obviously；in the hippocampi CA1 area and cortex；on above mentioned parts, the groups of invigorating spleen and restoring virility increases obviously. Conclusion In th

13、e model group, the ability of learing and memory with SP and VIP level in the brain changed. Invigorating spleen and restoring virility can improve above changes rem

14、arkably.    Key words：model of insufficiency Spleen；learning and memory；SP；VIP 中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,脾為后天之本,氣血生化之源,藏意主思。腎為先天之本,主藏精,藏志。靈樞本神提出：“脾藏營,營舍意”,“腎藏精,精舍志”(醫(yī)藥學(xué)/臨床醫(yī)學(xué)論文 1  材料和方法 1.1  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組    清潔級(jí)雄性Wistar大鼠,體重(160±10)

15、g,北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,48只大鼠隨機(jī)分成正常組、模型組、健脾組、補(bǔ)腎組,每組各12只。 1.2 實(shí)驗(yàn)藥物配制    造模藥物由大黃、厚樸、枳實(shí)組成,按211配備。健脾方為歸脾湯原方；補(bǔ)腎方為六味地黃丸原方。以上方藥分別常規(guī)煎煮、過濾,常規(guī)濃縮為1 g/mL藥液,冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?1.3 儀器    水迷宮實(shí)驗(yàn)裝置；跳臺(tái)儀；OLYMPUS光學(xué)顯微鏡(日本)；OLYMPUS自動(dòng)顯微鏡照相系統(tǒng)(日本)；DH3600AB電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津)；TS-10

16、0脫色搖床(北京)；BDS1電熱三用水浴箱(北京)；DHG9075A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海)；Leitz切片機(jī)(德國)。 1.4 主要試劑     SP免疫組化試劑盒(SP 1抗,多克隆兔抗)與VIP免疫組化試劑盒(VIP 1抗,多克隆兔抗)由博士德生物公司提供；正常羊血清、H2O2、2抗(生物素標(biāo)記的IgG)、3抗(ABC復(fù)合物)、PBS 枸櫞酸鈉、3-3二氨基聯(lián)苯胺(DAB)購自北京中山生物公司；多聚甲醛購自北京鼎國生物公司；蛋白酶K為Sigma公司產(chǎn)品。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。 1.5 

17、造模    采用苦降瀉下、飲食失節(jié)加勞倦過度法造模1。造模組每只每日灌胃造模藥2 mL,隔日禁食,自由飲水,每日于25 水中游泳至力竭。健脾組為造模處理加胃飼歸脾湯；補(bǔ)腎組為造模處理加胃飼六味地黃丸。每日上午對(duì)除正常組外的各組胃飼造模藥,正常組予等量生理鹽水；下午健脾組、補(bǔ)腎組分別胃飼相應(yīng)中藥,2 mL/d。連續(xù)6周。并觀察大鼠活動(dòng)狀態(tài)、排便、進(jìn)食量、體重等。 1.6 水迷宮實(shí)驗(yàn)     水迷宮水深21 cm,水溫(25±1),該裝置共設(shè)4個(gè)盲端

18、,終點(diǎn)設(shè)有臺(tái)階,動(dòng)物通過臺(tái)階可上岸躲避溺水的危險(xiǎn),檢測(cè)前先進(jìn)行訓(xùn)練2。訓(xùn)練時(shí)先將動(dòng)物放在終點(diǎn)梯子附近,讓其自行爬上2次。全部訓(xùn)練分三階段進(jìn)行。第一階段：用擋板擋在A處,使動(dòng)物學(xué)習(xí)從該處游至終點(diǎn)。第二階段：用擋板擋在B處,由此開始訓(xùn)練。第三階段：從起點(diǎn)開始訓(xùn)練。每階段訓(xùn)練2次,可用指示棒適當(dāng)予以誘導(dǎo),休息2 h后再進(jìn)行下一階段訓(xùn)練。全部訓(xùn)練完畢后使大鼠休息2 h,再將其放于爬梯附近,使其自行爬上2次,然后放于起點(diǎn)處,記錄大鼠游全程時(shí)間和錯(cuò)誤次數(shù)作為學(xué)習(xí)成績(jī)。3.5 min不能游出者按3.5 min計(jì)。24 h后重復(fù)測(cè)試,作為記憶成績(jī)。 1.7&#

19、160;跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)    實(shí)驗(yàn)裝置是一40 cm×20 cm×30 cm的大鼠跳臺(tái)反應(yīng)箱,分為兩間,箱底為可通36 v連續(xù)電刺激的銅柵。每間右后角置一直徑和高均為6 cm的橡皮墊,作為大鼠回避電擊的安全區(qū)。實(shí)驗(yàn)時(shí)先將大鼠置于跳臺(tái)儀中,適應(yīng)環(huán)境3 min,然后底部銅柵通以36 V交流電,動(dòng)物受到電擊的正常反應(yīng)是跳上平臺(tái)以躲避傷害性刺激,如此訓(xùn)練5 min,并記錄動(dòng)物受到電擊的次數(shù)稱錯(cuò)誤次數(shù),作為學(xué)習(xí)成績(jī)。24 h后將大鼠置于跳臺(tái)儀中適應(yīng)3 

20、min,再將其置于橡皮墊上,記錄第1次跳下橡皮墊的潛伏期和5 min內(nèi)的錯(cuò)誤次數(shù),作為記憶成績(jī)3。 1.8 標(biāo)本的采集與制備     大鼠經(jīng)10%水合氯醛(0.4 mL/100 g體重)麻醉后,打開胸腔,暴露心臟,經(jīng)左心室插管至升主動(dòng)脈,灌注預(yù)冷的生理鹽水,然后灌注預(yù)冷的4%多聚甲醛溶液；取腦,蒸餾水漂洗,置4%多聚甲醛溶液后固定45 min；常規(guī)石蠟包埋。石蠟切片機(jī)冠狀連續(xù)切片,片厚6 m,常溫保存?zhèn)溆谩?1.9 免疫組化方法     

21、;按照SP、VIP試劑盒使用說明操作。 1.10 光鏡觀察及圖像處理     利用OLYMPUS顯微鏡和真彩色病理圖像分析系統(tǒng)4.0版進(jìn)行圖像采集和處理,測(cè)量海馬CA1區(qū)、前額葉皮層、下丘腦腹內(nèi)側(cè)核SP、VIP免疫陽性反應(yīng)物的平均光密度,每組切片的每個(gè)部位測(cè)5個(gè)視野。 1.11  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法     結(jié)果均采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,所用數(shù)據(jù)用x±s表示,組間差異采用方差分析及q檢驗(yàn)。轉(zhuǎn)貼于 免費(fèi)論文下載中心  2  結(jié)果 2.1

22、  各組大鼠的狀態(tài)和體征變化    模型組從造模第3天起,逐漸出現(xiàn)倦怠懶動(dòng)、拱背、扎堆、瞇眼或顫抖等,皮毛疏松粗糙無光澤,毛色發(fā)黃、易脫落,足蹼、鼻尖、耳緣黏膜色變淡,身體開始消瘦,肛門周圍充血、濕潤,大便稀溏,此后時(shí)干時(shí)溏,拉尾排便試驗(yàn)呈陽性。正常組大鼠反應(yīng)靈敏、動(dòng)作靈活,皮毛白而有光澤,皮膚黏膜紅潤,飲食量、飲水量多,體重呈直線上升。健脾組在處理的第1周表現(xiàn)同模型組大鼠,但以后癥狀逐漸減輕,體重逐漸回復(fù)增長(zhǎng)。補(bǔ)腎組表現(xiàn)與模型組相似,但其活動(dòng)較靈活,反應(yīng)較靈敏。 2.2  學(xué)習(xí)記憶能力觀察結(jié)果 (見表1、表2)&

23、#160; 表1  各組大鼠水迷宮學(xué)習(xí)成績(jī)比較(略)注：與正常組比較,*P<0.01(下同)。表2  各組大鼠水迷宮記憶成績(jī)比較(x±s) 2.3  跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果 (見表3) 表3  各組大鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)成績(jī)比較(x±s) 2.4  SP、VIP免疫組化檢測(cè)結(jié)果 (見表4、表5) 表4  各組大鼠腦內(nèi)SP免疫陽性反應(yīng)物平均光密度比較(x±s) 表5  各組大鼠腦內(nèi)VIP免疫陽性反應(yīng)

24、物平均光密度比較(x±s) 3 討論    苦降瀉下、飲食失節(jié)加勞倦過度法是較有代表性的造模要素,本實(shí)驗(yàn)采用制備大鼠脾虛模型的方法屬于多因素造模,是目前應(yīng)用較廣泛的脾虛模型4-5。腎藏精生髓,精盛髓充則腦健聰慧。如素問遺篇?刺法論所稱：“精氣不散,神守不分?！敝挥蟹e精才能全神。精虧則神疲,智力減退。脾為后天腎為先天,先后天相互資生。景岳全書?脾胃說：“水谷之海,本賴先天為之主；而精血之海,又賴后天為之資?！睔w脾湯具有益氣補(bǔ)血、健脾養(yǎng)心之功,但以健脾為主,臨床治療由脾虛引起的健忘、失眠、怔仲等神志疾病時(shí)多使用歸脾湯。六味地黃丸為補(bǔ)腎之基

25、礎(chǔ)方,近來研究表明,六味地黃湯可改善快速老化模型小鼠(SAM)學(xué)習(xí)記憶能力,并顯著減少該模型血漿皮質(zhì)酮水平,發(fā)揮益智作用6。    本研究結(jié)果表明,模型組在水迷宮中游全程時(shí)間較長(zhǎng),錯(cuò)誤次數(shù)較多,潛伏期時(shí)間較短,說明脾虛大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力降低,出現(xiàn)認(rèn)知功能的變化。而健脾組與補(bǔ)腎組游全程時(shí)間較短,錯(cuò)誤次數(shù)少潛伏期時(shí)間較長(zhǎng)；跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)期和記憶期,模型組錯(cuò)誤次數(shù)較多,潛伏期短；健脾組錯(cuò)誤次數(shù)較少,潛伏期長(zhǎng)；在學(xué)習(xí)期補(bǔ)腎組錯(cuò)誤次數(shù)較少,潛伏期較長(zhǎng),但記憶期錯(cuò)誤次數(shù)較多。表明歸脾湯對(duì)脾虛模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力與認(rèn)知功能變化有明顯改善作用；六味地黃丸也有相似改善作用。

26、    腹腔內(nèi)注射SP 可促進(jìn)學(xué)習(xí)功能的保持7,將SP直接注射到基底核能促進(jìn)并加強(qiáng)記憶。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),SP在脾虛大鼠海馬CA1區(qū)、前額葉皮層和下丘腦腹側(cè)的免疫陽性反應(yīng)物平均光密度均減少,提示脾虛模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的下降與腦內(nèi)SP的改變有關(guān)。健脾組在上述腦區(qū)免疫陽性反應(yīng)物平均光密度顯著增加；補(bǔ)腎組海馬CA1區(qū)和前額葉皮層免疫陽性反應(yīng)物平均光密度明顯增加,提示歸脾湯對(duì)脾虛大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用與其對(duì)上述腦區(qū)SP的調(diào)節(jié)影響有關(guān)；六味地黃丸也有相同作用,但對(duì)SP的調(diào)節(jié)影響主要部位可能在海馬和皮層。VIP對(duì)東莨菪堿誘導(dǎo)的空間識(shí)別障礙有改善作用,轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)VIP水平較低學(xué)習(xí)發(fā)生障礙8。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),VIP在脾虛大鼠海馬CA1區(qū)、前額葉皮層的免疫陽性反應(yīng)物均減少,推測(cè)脾虛模型學(xué)習(xí)記憶能力的下降與腦內(nèi)VIP的改變有關(guān)。健脾組與補(bǔ)腎組海馬CA1區(qū)、前額葉皮層VIP免疫陽性反應(yīng)物平均光密度與正常組相比無顯著差異；但在下丘腦腹側(cè)核模型組、健脾組與補(bǔ)腎組平均光密度與正常組相比均無顯著差異。提示歸脾湯與六味地黃丸對(duì)脾虛大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用與其對(duì)腦內(nèi)VIP的調(diào)節(jié)有關(guān)。 【參考文獻(xiàn)】  1 陳小野.脾氣虛證動(dòng)物模型初步規(guī)范化