前列腺組織二氫睪酮結(jié)合蛋白與性激素作用的研究(一)

1、前列腺組織二氫睪酮結(jié)合蛋白與性激素作用的研究(一)    【摘要】 目的 測(cè)定前列腺組織中DHT結(jié)合蛋白的DHT結(jié)合容量，研究睪酮、雌二醇、孕酮對(duì)DHT結(jié)合容量的影響，初步分析DHT結(jié)合蛋白與性激素作用的性質(zhì)。方法 20例正常前列腺組織，制備組織胞漿提取液，乙醚萃取去除提取液中所有的內(nèi)源性類固醇激素，加入3H-DHT測(cè)定結(jié)合容量，并以等量和10倍量的T、E2、Po與3H-DHT競(jìng)爭(zhēng)DHT結(jié)合容量。結(jié)果 前列腺組織胞漿單純DHT結(jié)合容量是(0.0143±0.0022)nmol/g濕組織，T、E2與DHT競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合蛋白的作用較強(qiáng)，降低DHT結(jié)合容量的

2、作用比較明顯，Po的結(jié)合作用較弱，對(duì)結(jié)合容量的影響較小。 結(jié)論 前列腺組織胞漿中的DHT結(jié)合蛋白組成復(fù)雜，性質(zhì)各異，有很強(qiáng)的結(jié)合DHT能力，與T、E2、Po相互作用，共同影響前列腺組織中DHT的狀態(tài)。 【關(guān)鍵詞】 前列腺 雄激素 雌激素 孕激素 雄激素結(jié)合蛋白【Abstract】 Objectives This experiment is to quantify the total DHT (Dihydrotestosterone)-binding ability of DHT-binding proteins in prostate by assaying the DHT-binding c

3、apacity, and to study the change of DHT-binding capacity causing by the combination of T（Testosterone）, E2(Estrodiol), Po(Progestosterone) and DHT-binding protein, and to analyze preliminarily the effects of sex hormone on DHT-binding protein of prostate.Method To obtain cytosolic fracions from 20 n

4、ormal tissues taken from accident-death corpses without serious diseases, and then to remove all the endogenous hormone from the cytosolic fracions by ether stripping.To assay the content of the bound 3H DHT. To add the same dose of T、E2、Po to compete against 3H DHT for DHT protein, and then to add

5、10 times dose of T、E2、Po to compete with 3H DHT for DHT protein. Results The alone DHT-binding capacity of the cytosolic fractions in prostate is (0.0143±0.0022)nmol/g wet tissue. T and E2 have more obvious effect on reducing the DHT-binding capacity of the cytosolic fraction while Po has less

6、effect on reducing the DHT-binding capacity. Conclusions There are many kinds of DHT-binding proteins in the cytosolic fraction in prostate tissues and their mechanisms are different. The proteins have strong DHT-binding capacity, and they interact with T、E2、Po to affect the DHT state in the prostat

7、e tissues.【Key words】 Prostate Androgen Estrogen Progestosterone Androgen-binding protein 前列腺組織中存在多種二氫睪酮（Dihydrotestosterone，DHT）結(jié)合蛋白，這些蛋白的性質(zhì)和生理作用尚不十分明確。作者自2001年2月至2007年5月實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)測(cè)定DHT結(jié)合容量來(lái)描述這些結(jié)合蛋白總的DHT結(jié)合能力，并以睪酮(CT)、雌二醇(E2)、孕酮(PO)與DHT競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合蛋白的作用研究正常前列腺DHT結(jié)合容量的變化，并初步分析DHT結(jié)合蛋白與性激素作用的性質(zhì)。1 材料和方法1.1 前列腺組織標(biāo)本 20

8、例正常前列腺組織取自無(wú)嚴(yán)重疾患的健康男性尸體，年齡2244歲，平均35.7歲。組織塊獲取距臨床診斷死亡時(shí)間15min。所有組織均經(jīng)病理證實(shí)。組織獲取后以冰生理鹽水洗凈血跡，保留腺體實(shí)質(zhì)部分，濾紙吸干，置入液氮中凍結(jié)，然后轉(zhuǎn)放-70冰箱存放待用。1.2 試劑 3H-DHT購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海核技術(shù)開(kāi)發(fā)公司（1.2.4.53H -DHT，放射性比強(qiáng)度：50ci/mmol，放化純度：95%，放射性濃度：1mci/mmol），檢測(cè)儀器為BECKMAN公司LS-6500型液態(tài)閃爍記數(shù)儀。E2、T、PO為SIGMA公司產(chǎn)品。1.3 實(shí)驗(yàn)方法 (1)胞漿提取液準(zhǔn)備：制備胞漿提取液，去除胞漿提取液內(nèi)源性類固醇激

9、素，將胞漿提取液加入2倍體積的乙醚（萃取類固醇激素），均勻而柔和震蕩2min，靜置6h，1000g離心1min，去除上層乙醚，重復(fù)1次，去乙醚后，靜置過(guò)夜，以揮發(fā)殘余乙醚，吸取所需量的下層樣品。(2)3H -DHT結(jié)合和測(cè)定：3H-DHT溶液準(zhǔn)備：0.4ml3H-DHT試劑加入1.2ml 99%乙醇混勻，取50l溶于4950l甘油磷酸鹽緩沖液1nM 磷酸二氫鉀(KH2PO4)，氫氧化鈉(NaOH) 微調(diào)至pH 7.4，含10% 甘油(Glycerol) (v/v) ，3H -DHT終濃度為50nM。T、E2、Po溶液：先配置5mm pH激素濃度的異丙醇溶液，用99%乙醇稀釋10倍，再以上述甘油

10、磷酸鹽緩沖液稀釋1000倍，此濃度500nM，為3H -DHT溶液濃度的10倍，留取一部分備用；另一部分繼續(xù)甘油磷酸鹽緩沖液稀釋10倍，濃度50nM，等同于3H -DHT溶液濃度，備用。另配不含任何激素的空白對(duì)照溶液，過(guò)程同。閃爍液：PPO 6g 、POPOP 0.3g 、 萘 50g 溶于甲苯 1000ml。操作步驟：取已去除內(nèi)源類固醇激素的樣品，每一樣品分為4份，每份350l，分別加入20l空白對(duì)照溶液、50nM的T溶液、50nM的E2溶液、50nM的Po溶液，然后所有樣品溶液均加入3H-DHT溶液20l，混勻，靜置孵育18h。加入2倍體積的乙醚，均勻而柔和震蕩 2 min（萃取未結(jié)合的3

11、H-DHT），1000g離心1min，去除上層乙醚，吸取200l下層樣品。實(shí)驗(yàn)同時(shí)以2份350l PGB緩沖液各加入20l 3H -DHT溶液分別作為空白對(duì)照記數(shù)（步驟同前）和總記數(shù)（略去乙醚萃取步驟，其余同前）。以上全部操作在4進(jìn)行。將吸取的200l樣品加入蛋白酶K（終濃度100g/ml）、SDS（終濃度0.5%），37過(guò)夜，加入5ml閃爍液，輕微震蕩2h做液閃記數(shù)。 以上為等量激素的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)，再用500nM的T溶液、E2溶液、Po溶液替換相應(yīng)的激素溶液，其余步驟同，做10倍激素的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)。根據(jù)已知3H -DHT含量的計(jì)數(shù)：（總記數(shù)cpm-空白對(duì)照cpm），和待測(cè)樣品的計(jì)數(shù)：（樣品cpm-空白對(duì)照cpm）計(jì)算樣品結(jié)合3H -DHT含量。實(shí)驗(yàn)為同一樣品不同處理的自身配對(duì)設(shè)計(jì)，統(tǒng)計(jì)分析為t檢驗(yàn)。2 結(jié)果2.1 前列腺組織胞漿單純DHT結(jié)合容量是(0.0143±0.0022)nmol/g濕組織，均數(shù)相當(dāng)于4.2 ng/g濕組織。2.2 與DHT等量性激素對(duì)胞漿DHT結(jié)合容量的影響，見(jiàn)表1。加入 T或E2的DHT結(jié)合容量低于單純DHT結(jié)合容量，有顯著性差異（P0.05），Po的作用無(wú)顯著性差異（P0.05）。等量時(shí)T和E2