山茱萸總甙對(duì)正常小鼠T淋巴細(xì)胞免疫功能影響的實(shí)驗(yàn)研究

1、    山茱萸總甙對(duì)正常小鼠T淋巴細(xì)胞免疫功能影響的實(shí)驗(yàn)研究         摘要：研究了從山茱萸中提取的山茱萸總甙對(duì)正常小鼠T淋巴細(xì)胞及其亞群和產(chǎn)生IL-2的 影響，以期探討山茱萸總甙的免疫抑制機(jī)理。結(jié)果表明：山茱萸總甙不同劑量均可抑制 T淋巴細(xì)胞增殖（P<0.01）、T淋巴細(xì)胞膜表面CD3的表達(dá)（P<0.01）和抑制T淋巴 細(xì)胞膜表面 CD4、CD8的表達(dá)（P<0.05或P<0.01），中大劑量還可以提高CD4/CD8的比值，說(shuō)明山 茱萸總 甙抑制

2、CD8的作用比抑制CD4的作用更明顯。不同劑量的山茱萸總甙還可以抑制T淋巴細(xì)胞產(chǎn) 生IL-2(P<0.05或P<0.01）。抑制IL-2的產(chǎn)生可能是山茱萸總甙抑制機(jī)體免疫功能 的主要機(jī)理之一。關(guān)鍵詞：山茱萸總甙； T淋巴細(xì)胞； 小鼠； 免疫功能中分類號(hào)：R285.5The Effects of the Total Glycoside from Cornus Officinalison Immunologic Function of T Lymphocytes in Healthy MiceLi Jianmin (李建民), Zhou Yong (周勇), Xiang Jingche

3、n (項(xiàng)靜辰), et al.(Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100029)The effects of the total glycoside extracted from Cornus officin alis ( TGECO) on T lymphocytes and T lymphocyte subgroup, and the IL-2 production of T lymphocytes were studied in healthy mice in order to explore the

4、immunosuppressi ve mechanism of TGECO. The results showed that all the different TGECO doses cou ld inhibit the multiplication of T lymphocytes (P<0.01), CD3 surface expres sion in T lymphocytes (P<0.01), and CD4 and CD8 surface expression in T lymphocy t es (P<0.05 or P<0.01); besides,

5、middle and large TGECO doses could inc rease the rati o of CD4/CD8, which implies that the TGECO effect of inhibiting CD8 is stronger than that of inhibiting CD4. The results also showed that all the different TGEC O doses could inhibit the IL-2 production of T lymphocytes (P<0.05 or P < 0.01)

6、, which may be one of the main causes of the immunosuppressive effects of TGECO.KEY WORDS: Total Glycoside from Cornus Officinalis; T Lymphocyte; Mouse; I mmunologic Function近年來(lái)對(duì)于山茱萸的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：山茱萸的水煎劑具有免疫抑制作用，其提取物山 茱萸總甙等也有明顯的免疫抑制作用。我們以往的研究工作表明:山茱萸總甙具有免疫抑制 作用,在本實(shí)驗(yàn)中我們初步探討了山茱萸總甙(total glycosides from corn

7、us officinalis ,TGCC）對(duì)正常小鼠T淋巴細(xì)胞增殖及其亞群和產(chǎn)生IL-2的影響,現(xiàn)報(bào)道如下。1材料與方法11動(dòng)物BAlB/C小鼠一級(jí)，雌性，體重為1820 g，購(gòu)于中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院流行病與微生 物研究所，合格證號(hào)為醫(yī)動(dòng)字第01-3058號(hào)。C57BL/6J小鼠一級(jí), 雌性,體重1822 g,購(gòu)于 中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院流行病與微生物研究所,合格證號(hào)為醫(yī)動(dòng)字第01-3059號(hào)。12藥物與試劑（1） 山茱萸總甙膠囊由中日友好醫(yī)院臨床研究所藥物藥理室趙世萍研究員提供。批號(hào)為： 991129，用蒸餾水溶解，用碳酸氫鈉調(diào)pH 7.2，按人60 kg體重折算的10倍為臨床等效劑量 作為小鼠實(shí)

8、驗(yàn)的中劑量用量，用于實(shí)驗(yàn)研究。（2） 地塞米松,片劑,規(guī)格0.75 mg/片,由天津市力生制藥廠生產(chǎn),批號(hào)為: 9807003。用生理鹽水配制,按人60 kg體重折算的10倍為臨床等效劑量作為小鼠實(shí)驗(yàn)的中劑 量用量。（3） 試劑：RPMI 1640培養(yǎng)基，美國(guó)GIBCO公司產(chǎn)品，加入25 mmol/L的Hepes，16 mmol/L NaH CO3,0.1 mol/L丙酮酸鈉，0.01 mol/L 2-巰基乙醇，過(guò)濾除菌，使用時(shí)加入青霉素100 U/mL，鏈霉素100 mg/mL，2 mmol/L谷氨酰胺，配成10%滅活的胎牛血清培養(yǎng)基即為完全RPMI 1640培養(yǎng)基 。ConA、LPS 均為

9、美國(guó)Sigma產(chǎn)品。3H-TdR為中國(guó)原子能科學(xué)研究院產(chǎn)品。熒光標(biāo)記抗體，CD3為FITC標(biāo) 記抗體、 CD4為PE標(biāo)記抗體和CD8為FITC標(biāo)記抗體，購(gòu)于北京醫(yī)科大學(xué)免疫研究中心。染色緩沖液： 0 .1%NaN3,2%NBS，pH 7.4 0.15 mol/L PBS 100 mL，購(gòu)于北京醫(yī)科大學(xué)免疫研究中心。 13主要儀器高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)HERMLE,Z360K。CO2日本池本理化工業(yè)株氏會(huì)社RJK。倒置顯微鏡 ，重慶光學(xué)儀器廠。超凈工作臺(tái)，北京市半導(dǎo)體設(shè)備廠。低溫冰箱，日本SANYO。電子天平A E100,瑞士。多頭微量細(xì)胞收集器，紹興坡塘醫(yī)療械器廠。液體閃爍計(jì)數(shù)儀，美國(guó)Beckm

10、an。 流式細(xì)胞計(jì),美國(guó) COULTER公司EPICS XL. 液體閃爍計(jì)數(shù)儀，美國(guó)Beckman。14方法14.1制備脾細(xì)胞懸液： 將上述BAlB/C小鼠60只,隨機(jī)分為正常組、地塞米松組及山茱萸總甙大、中、小組，每組 12只,連續(xù)灌胃7d，處死小鼠，分離脾細(xì)胞，制備單個(gè)脾細(xì)胞懸液。14.2T淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)1: 將上述脾細(xì)胞懸液調(diào)細(xì)胞濃度為5×109L-1。加入96孔培養(yǎng)板中，100 L/孔， 同時(shí)每孔加 入100 L含ConA（終濃度5 mg/L）的1640完全培養(yǎng)基，每組12孔,置37 、5%CO2培養(yǎng) 箱中 孵育72 h， 培養(yǎng)結(jié)束前6 h加入3H-TdR 1.85

11、5;104 Bq/孔，最后用多頭微量細(xì)胞收集 器收集細(xì)胞于49型玻璃纖維紙上，以液閃儀測(cè)定細(xì)胞的摻入值（cpm）。14.3山茱萸總甙對(duì)正常小鼠T細(xì)胞亞群影響：采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)2。取上述每組8只動(dòng)物的脾細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞濃度為1×109L-1。取出1 mL細(xì)胞懸液, 分加入EP管中,用熒光洗液洗2次，每次加入熒光洗液0.5 mL, 每次均為4 離心1 200 r/mi n，7 min,分別加入熒光標(biāo)記的抗體,其中抗CD3mAb為50 L,抗CD4和CD8 mAb 各為20 L, 混勻,4 ，30 min,用熒光洗液洗2次，每次加入熒光洗液0.5 mL, 每次均為4 離心1 200 r/

12、min，7 min 。用PBS液0.5 mL重懸細(xì)胞，經(jīng)200目尼龍膜過(guò)濾后以流式細(xì)胞計(jì)檢測(cè)T細(xì)胞亞群，整個(gè)染色 過(guò)程均在4 冰浴中進(jìn)行。14.4IL-2測(cè)定：采用胸腺細(xì)胞增殖法2。(1)IL-2的誘生：將上述脾細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞濃度為5×109L-1，加入到24孔培 養(yǎng)板中，1 mL/孔 ，同時(shí)每孔加入10 L含ConA（終濃度5 mg/L）的1640完全培養(yǎng)基，置37 、5%CO2培 養(yǎng)箱 中孵育48 h，2 000 r/min離心10 min，吸取上清，即為IL-2的粗制品，-20 保存待測(cè)。 (2)IL-2的測(cè)定：采用胸腺細(xì)胞增殖法，采用雌性C57BL/6J小鼠，無(wú)菌分離其胸腺

13、，按常規(guī) 制備胸腺懸液，調(diào)細(xì)胞濃度為5×109L-1，加入96孔培養(yǎng)板中，100 L/孔，并使C onA的終濃度為3 mg/L，然后加入不同稀釋度的IL-2樣品(12和14)，每種稀釋度重復(fù)6 孔,置37 、5%CO2 培養(yǎng)箱中孵育72 h， 培養(yǎng)結(jié)束前6 h加入3H-TdR 1.85×104Bq/孔，最后用多頭微量細(xì) 胞收集器收集細(xì)胞于49型玻璃纖維紙上，以液閃儀測(cè)定細(xì)胞的摻入值（cpm）。145統(tǒng)計(jì)方法：實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)t檢驗(yàn)，以<"0 (881 bytes)" src="/med/cano/201003/2010032418564

14、3580" 12 14>±s表示。2結(jié)果21山茱萸總甙對(duì)正常小鼠T淋巴細(xì)胞增殖的影響結(jié)果見(jiàn)表1。22山茱萸總甙對(duì)正常小鼠T細(xì)胞亞群的影響結(jié)果見(jiàn)表2。23山茱萸總甙對(duì)正常小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-2的影響結(jié)果見(jiàn)表3。表1山茱萸總甙對(duì)正常小鼠T淋巴細(xì)胞增殖的影響 (<"0 (881 bytes)" src="/med/cano/201003/20100324185643580" 12 14>±s)組別n劑量cpm生理鹽水組12-131769.4±11793.2地塞米松組120.125 mg/kg31642.

15、5±10957.7*山茱萸總甙組120.08 g/kg108315.8±10032.8*山茱萸總甙組120.16 g/kg78675.8±15494.6*山茱萸總甙組120.32 g/kg63105.1±22001.8*     注：與生理鹽水組比較*P<0.01 表2山茱萸總甙對(duì)正常小鼠T細(xì)胞亞群的影響(<"0 (881 bytes)" src="/med/cano/201003/20100324185643580" 12 14>±s )分組n劑

16、量CD3%CD4%CD8%CD4/CD8生理鹽水組8-47.56±3.5935.51±1.3918 .88±1.031.89±0.11地塞米松組80.125 mg/kg37.48±0.50*26.95±1.67* *14.10±1.06*1.92±0.11山茱萸總甙組80.08 g/kg46.35±0.9925.69±10.10*17.28±1.90 1.47±0.54山茱萸總甙組80.16 g/kg46.48±1.6431.41±1.08*15.00&#

17、177;1 .16*2.10±0.16*山茱萸總甙組80.32 g/kg43.36±1.15*28.13±2.47*13.45±1.56*2.10±0.13*     注：與生理鹽水組比較*P<0.05*P<0.01     表3山茱萸總甙對(duì)正常小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-2的影響 (<"0 (881 bytes)" src="/med/cano/201003/20100324185643580" 12 14>

18、±s)組別劑量cpm(12)cpm(14)生理鹽水組-15487.9±4988.110638.8±4999.0地塞米松組0.125 mg/kg3468.8±1033.1*3670.3±1502.6* *山茱萸總甙組0.08 g/kg7022.3±2200.5*8637.4±6442.6*山茱萸總甙組0.16 g/kg3010.2±1025.2*3252.2±2513.9*山茱萸總甙組0.32 g/kg2912.0±1490.3*2981.3±2485.8*注：與生理鹽水組比較*P<

19、;0.05*P<0.01 3討論山茱萸為山茱萸科植物山茱萸的果肉，具有補(bǔ)肝腎、澀精氣、固虛脫的作 用。近年來(lái)對(duì)于山茱萸的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：山茱萸的提取物山茱萸總甙具有較強(qiáng)的免疫抑制作 用48,是山茱萸免疫抑 制的主要有效部位。機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，T淋巴細(xì)胞的活化、增殖 需 經(jīng)抗原、有絲分裂原的刺激后表達(dá)IL-1受體，在IL-1作用下，T淋巴細(xì)胞活化，并由G0期 進(jìn) 入G1期，活化后的T淋巴細(xì)胞合成IL-2，并表達(dá)IL-2受體，IL-2與高親和力的膜受體結(jié) 合 相互作用，刺激T淋巴細(xì)胞進(jìn)入S期，進(jìn)行增殖和分化。因此，IL-2是T淋巴細(xì)胞增殖的關(guān)鍵 免疫促進(jìn)因子。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)

20、果表明：山茱萸總甙的大、中、小三種不同劑量均可以抑制T 淋巴 細(xì)胞增殖（P<0.01）、T淋巴細(xì)胞膜表面CD3的表達(dá)（P<0.01）和抑制T淋巴細(xì)胞 膜表面CD4、 CD8的表達(dá)（P<0.05或P<0.01），中大劑量還可以提高CD4/CD8的比值，說(shuō)明山茱萸總 甙抑制 CD8的作用比抑制CD4的作用更明顯。不同劑量的山茱萸總甙還可以抑制T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-2 （P<0.05或P<0.01）。抑制IL-2的產(chǎn)生可能是山茱萸總甙抑制機(jī)體免疫功能的主要 機(jī)理之一。國(guó)家新藥研究基金 (No.96-901-05-177)李建民， 男， 37歲， 在讀醫(yī)學(xué)博士， 副主任醫(yī)師李建民(北京中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所免疫室北京