我國常見粉蚧類害蟲雙基因條形碼鑒定技術研究

1、我國常見粉蚧類害蟲雙基因條形碼鑒定技術研究粉蚧屬半翅目Hemiptera、粉蚧科Pseudococcidae,是一類重要的世界性檢疫性害蟲。粉蚧類害蟲種類繁多,已知種類2000余種;且體形微小、形態(tài)多樣、寄主范圍廣、隱蔽性強,極易隨國際貿(mào)易活動傳播擴散,給農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大威脅。通常,口岸截獲的粉蚧多為若蟲或殘體,加之隱存種/復合種的存在和較小的近緣種間差異,嚴重影響了基于形態(tài)學特征的粉蚧類害蟲識別鑒定的準確性和時效性。本研究以線粒體COI基因和核糖體28SrRNA為靶標，研究探討了雙基因DN煤形碼在粉蛇鑒定中的作用,評價了該技術對重大潛在入侵害蟲大洋臀紋粉蚧的鑒定有效性;同時,針對重大檢疫

2、性害蟲木薯綿粉蚧研發(fā)出了其種特異性檢測鑒定技術體系。具體研究結果如下：(1)粉蛇類昆蟲全基因組DNAI取方法的評價研究。以雌性成蟲、卵、各齡期若蟲等為對象,分析比較了8種DNA1取方法,明確了SDS法最適于粉蛇類害蟲高齡若蟲和雌成蟲DNAE取,DeBarro法適于卵和低齡若蟲DNA1取，有效解決了粉蛇類害蟲體表蠟質(zhì)較厚,DNA得率不高的難題。(2)雙基因條形碼技術在我國常見粉蚧鑒定中的應用。以來自國外11個種群、國內(nèi)93個種群的9屬22種粉蛇461個個體為對象,以COI基因5'端和28S基因D2-D3區(qū)段為靶標,通過堿基序列測定和分析,以及種內(nèi)種間遺傳距離計算,并同時整合數(shù)據(jù)庫中高質(zhì)量

3、的相關種的靶標序列,分別構建系統(tǒng)發(fā)育樹。結果顯示,22種粉蛇的COI基因5'端序列具有48個單倍型，而28S基因D2-D3序列則具有33個單倍型。當以COI基因5'端序列為靶標時，22種粉蛇的種內(nèi)遺傳距離為0.00000.0160,平均為0.0034;種間遺傳距離均大于2%,為0.02200.1780,平均為0.0921;種間遺傳距離是種內(nèi)遺傳距離的27.1倍;且種內(nèi)遺傳距離與種間遺傳距離之間不存在重疊區(qū)域。在基于COI-5'序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，各物種均具有獨立的進化分支。當以28S基因D2-D3區(qū)段為靶標時，部分屬內(nèi)十分保守，種內(nèi)遺傳距離與種間遺傳距離之間存在重疊

4、現(xiàn)象,不能對部分近緣種進行有效區(qū)分;而屬間變異相對較大。同時,研究還顯示,大洋臀紋粉蚧和柑橘臀紋粉蚧可能存在隱存種或復合種;而粉蛇屬可能存在多起源現(xiàn)象。進而表明，COI基因較28S基因更適合于種間的物種鑒定；而COI基因和28S基因的聯(lián)合應用，有利于提高DN原形碼技術對粉蛇類害蟲的鑒定能力,實現(xiàn)對粉蚧類害蟲的準確識別與鑒定。(3)DNA條形碼技術對近緣種粉蛇-重大潛在入侵害蟲大洋臀紋粉蛇和土著種柑橘臀紋粉蚧的鑒定有效性研究。以旅檢截獲的36頭大洋臀紋粉蚧為對象、其近緣種柑橘臀紋粉蚧為參照,序列分析表明,當分別以COI基因5端和3端序列為靶標時,截獲大洋臀紋粉蚧的堿基序列與數(shù)據(jù)庫中靶標種的序列相

5、似性分別為100%和99100%,而與近緣種柑橘臀紋粉蚧的相似性分別為9798%和9698%;且大洋臀紋粉蚧和柑橘臀紋粉蚧分別存在5個和12個穩(wěn)定的物種特異性鑒別位點;系統(tǒng)發(fā)育分析顯示,截獲的大洋臀紋粉蚧均與數(shù)據(jù)庫中的靶標種聚為一支。當以28S基因D2-D3區(qū)段序列為靶標時，臀紋粉蛇屬各物種間高度保守，無法區(qū)分大洋臀紋粉蚧與其近緣種柑橘臀紋粉蚧;種間遺傳距離僅為0.004。此外,進一步的物種識別軟件評價結果顯示,基于COI基因5端和3端序列的鑒定結果完全正確，而基于28S基因D2-D3區(qū)段序列的鑒定結果卻存在45.261.9%的模糊鑒定。表明，基于COI基因5'端和3'端的DN

6、A形碼技術完全可用于大洋臀紋粉蚧的準確鑒定及檢測監(jiān)測,對有效阻截其入侵和進一步擴散蔓延意義重大。(4)重大潛在入侵害蟲木薯綿粉蛇的快速PCR僉測技術研究?；跍y序獲得的COI基因5'端序列，設計木薯綿粉蛇的種特異性SS-COI引物1又t(PMSSZW-1F/PMSSZW-lR)擴增片段大小為353bp;以我國口岸經(jīng)常截獲的扶桑綿粉蚧等8種粉蚧為參照,研究驗證該引物對的種特異性,以及檢測靈敏性和檢測閾值。結果顯示,該引物對只對木薯綿粉蚧具有擴增能力,對我國口岸經(jīng)常截獲的其他8種粉蚧不具擴增效果;同時,對不同蟲態(tài)、齡期、成蟲殘體以及來自不同寄主植物的木薯綿粉蚧亦具良好的擴增效果,其最低檢出閾值為135.22±10.41pg/仙L(相當于1/20480頭雌性成蟲)。木薯綿粉蚧的種特異性快速檢測技術具有快速、可靠、準確、靈敏的特點,能大大提高口岸檢驗檢疫效率,該技術體系的建立為木薯綿粉蚧的檢測、監(jiān)測與有效阻截提供了技術支撐,對保障我國木薯產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。本研究圍繞粉蚧科昆蟲種類多、體形小、存在多型、多態(tài),對農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)威脅巨大,卻難以快速準確識別的問題，研究構建了較為完善的粉蛇科雙基因DNAIt形碼鑒定技術體系。而重大潛在入侵物種木薯綿粉蚧種特異性快速檢測技