設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)微生物菌種的分離純化、培養(yǎng)、、鑒定-以及保藏技術(shù)

1、設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)：微生物菌種的分離純化、培養(yǎng)、鑒定 以及保藏技術(shù) 一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 學(xué)習(xí)大腸菌群分離純化、鑒定的原理。2. 掌握平板表面涂布法、平板劃線法的分離技術(shù)。3. 學(xué)習(xí)掌握菌種保藏的原理和方法。二.實(shí)驗(yàn)原理菌種的分離純化從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物分離與純化。在分子生物學(xué)的研究及應(yīng)用中，不僅需要通過分離純化技術(shù)從混雜的天然微生物群中分離出特定的微生物，而且還必須隨時(shí)注意保持微生物純培養(yǎng)物的“純潔”，防止其他微生物的混入。1.涂布平板法因?yàn)閷⑽⑸飸乙合燃拥捷^燙的培養(yǎng)基中再倒平板易造成某些熱敏感菌的死亡，且采用稀釋倒平板法也會(huì)使一些嚴(yán)格好氧菌因被固定在瓊脂中間

2、缺乏氧氣而影響其生長(zhǎng)，因此在微生物學(xué)研究中常用的純種分離方法是涂布平板法。2.平板劃線法最簡(jiǎn)單的分離微生物的方法是平板劃線法，其原理是將微生物樣品在固體培養(yǎng)基表面多次作“由點(diǎn)到線”稀釋而達(dá)到分離目的的。劃線的方法很多，常見的比較容易出現(xiàn)單個(gè)菌落的劃線方法有斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等。大腸菌群的培養(yǎng)鑒定大腸菌群能在乳糖膽鹽液體培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，并且產(chǎn)氣產(chǎn)酸，使培養(yǎng)液變色。還能在伊紅美蘭固體培養(yǎng)上生長(zhǎng)，形成黑紫色的菌落，有的還有金屬光澤。其他病原菌的菌落呈粉紅色。再做鏡檢觀察是無芽孢的革蘭氏陰性桿菌（呈紅色）。即可鑒定是有大腸菌群的菌存在。菌種保藏菌種保藏是將微生物的菌種經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間的保存，

3、不污染其它雜菌，及可保持其形態(tài)特征和生理性狀，減少變異，防止衰老，以便于將來使用。保藏菌種一般是選用它的休眠休，如孢子；芽孢等等，并且要?jiǎng)?chuàng)造一個(gè)低溫；干燥；缺氧；避光和缺少營(yíng)養(yǎng)的環(huán)境條件，以利于休眠體能長(zhǎng)期地處于休眠狀態(tài)。對(duì)于不產(chǎn)孢子的微生物，應(yīng)使其新陳代謝處于最低狀態(tài)，又不會(huì)死亡，從而達(dá)到長(zhǎng)期保存的目的三.實(shí)驗(yàn)器材1. 菌種：污水中的大腸菌群、酵母菌和霉菌2、培養(yǎng)基：乳糖膽鹽液體培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥芽汁固體斜面培養(yǎng)基和馬鈴薯固體斜面培養(yǎng)基。3.器材：接種環(huán)、安培瓶、干燥器、冰箱、產(chǎn)氣管、試管、培養(yǎng)皿、無菌平皿、無菌玻璃涂棒移液管、電爐、雙目顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、無

4、菌操作臺(tái)、高壓滅菌鍋、恒溫干燥箱等。4.試劑：革蘭氏一(草酸銨結(jié)晶紫)、革蘭氏二(路哥氏碘液) 、革蘭氏三（95%乙醇）、 革蘭氏四（蕃紅）；試劑：醫(yī)用液體石臘（比重0.830.89）。四試驗(yàn)方法及步驟1.大腸菌群的分離純化第一天a涂布平板法：將已熔化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基倒入無菌平皿，制成無菌平板，冷卻凝固后，將一定量的含大腸菌群的污水滴加在平板表面，再用無菌玻璃涂棒將菌液均勻分散至整個(gè)平板表面，置培養(yǎng)箱中37培養(yǎng)24小時(shí)。經(jīng)培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落。第二天b平板劃線法：經(jīng)培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落，接種環(huán)以無菌操作沾取少許菌落，在無菌伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基平板表面進(jìn)行連續(xù)劃線，微生物細(xì)胞數(shù)量將隨著劃線次數(shù)的增加而

5、減少，并逐步分散開來，如果劃線適宜的話，微生物能一一分散。在37經(jīng)培養(yǎng)24小時(shí)后，可在平板表面得到單菌落。（有時(shí)這種單菌落并非都由單個(gè)細(xì)胞繁殖而來的，故必須反復(fù)分離多次才可得到純種.）2.大腸菌群的培養(yǎng)鑒定第三天a觀察固體培養(yǎng)基菌落a將菌落轉(zhuǎn)入裝有玻璃珠的滅菌錐形瓶中調(diào)節(jié)酸堿度為7，充分搖勻備用。b液體發(fā)酵：取處理好的樣品液1mL加入滅菌的乳糖膽鹽液體培養(yǎng)基中。搖勻后置培養(yǎng)箱中37培養(yǎng)24小時(shí)第四天c觀察液體培養(yǎng)基菌落d鏡檢 3.菌種保藏一）斜面低溫保藏法： 此法為最常用的一種。一般霉菌；放線菌和有芽孢的細(xì)菌可保存24個(gè)月，酵母菌可保存2個(gè)月，無芽孢的細(xì)菌最好每周移接一次。操作過程如下：1、接

6、種：將要保藏的菌種接入斜面培養(yǎng)基上，試管上貼好標(biāo)簽，寫上菌種名稱，時(shí)間。2、培養(yǎng)：各類菌按其所需溫度和時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng)。3、保藏：選取生長(zhǎng)健壯的菌種，于其試管帶棉塞的上半部用滅菌的塑料包扎好，以防棉塞受潮感染雜菌。置于4冰箱中保藏。（二）液體石臘保藏法：此法可用不分解石臘的菌種保藏。保存時(shí)間是半年至一年。放線菌；霉菌和產(chǎn)芽孢菌可保藏二年。液體石臘可防止培養(yǎng)基水分的蒸發(fā)，而引起的菌種死亡。同時(shí)可阻止氧氣進(jìn)入，防止好氧菌的生長(zhǎng)。從而延長(zhǎng)菌種保藏的時(shí)間。但需注意的是試管必須直立放置，并且不便攜帶。操作過程如下：1、液體石臘的滅菌：將液體石臘裝入錐形瓶中，量不超出錐形瓶體積的1/3，塞上棉塞，包扎好后，進(jìn)行高壓蒸汽滅菌二次（12030分鐘）。再在110120干燥箱中蒸發(fā)掉蒸汽滅菌時(shí)帶入的水分。此時(shí)石臘透明清亮狀。經(jīng)檢驗(yàn)確定無菌后備用。2、菌種培養(yǎng)：將所需的菌種經(jīng)培養(yǎng)后，選取健狀的保藏。3、加石臘油：用無菌管吸取石臘油加入菌種試管中，以高出菌種斜面頂點(diǎn)1cm為宜。少了會(huì)因培養(yǎng)基露出油面，而使培養(yǎng)基變干造成菌死亡。4、收藏：試管上部用塑料包扎好，垂直立于冰箱中4。5、恢復(fù)使用：當(dāng)要使用菌種時(shí)。傾出石臘油。此石臘油可再滅菌重復(fù)