耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌和耐萬古霉素的腸球菌的預(yù)防和快速檢

1、 耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌和耐萬古霉素的腸球菌 的預(yù)防和快速檢測尉景娟天津醫(yī)科大學檢驗系 天津 (300000louis2004304摘 要 :耐甲氧西林(苯唑西林的金葡菌(MRSA和耐萬古霉素的腸球菌(VRE是醫(yī)院感 染和社區(qū)感染的重要病原菌, 其檢出率在逐年增高, 耐藥性也不斷增強, 所以對這兩種耐藥 菌的快速檢測就顯得尤為重要,也是預(yù)防和控制MRSA和VRE感染的重要環(huán)節(jié),現(xiàn)在就MRSA和 VRE的預(yù)防控制和快速檢測作一綜述。關(guān)鍵詞:金葡菌, 腸球菌, 快速檢測院內(nèi)感染增加了臨床治療的難度,有超過 70%的致病菌對臨床常用的一種或多種抗生 素耐藥 1。院內(nèi)致病菌的耐藥率逐年升高:現(xiàn)在金

2、葡菌對苯唑西林耐藥率和腸球菌對萬古霉 素的耐藥率越來越高 2。耐甲氧西林(苯唑西林的金葡菌(MRSA 占院內(nèi)獲得性金葡菌 感染的 50%以上, 耐萬古霉素的腸球菌 (VRE 占所有院內(nèi)獲得性腸球菌感染的 25%以上 1。 美國醫(yī)療保健流行病學學會(SHEA 最近認為 MRSA 和 VRE 是兩種最不受控制的醫(yī)院耐藥 菌 3。1 預(yù)防和控制措施耐藥率的升高是由以下兩種情況引起:1. 敏感菌在抗生素使用的壓力下而變?yōu)槟退幘?;2. 耐藥菌從一個人傳染給另一個人。 相應(yīng)的預(yù)防和控制措施就是控制抗生素應(yīng)用和防止耐藥菌 傳播 4。 減少抗生素的濫用是控制細菌耐藥的關(guān)鍵措施, 但是醫(yī)院更注重預(yù)防耐藥菌的傳

3、播。 預(yù)防傳染的基礎(chǔ)是手部衛(wèi)生, 提倡用酒精刷手, 以減少院內(nèi)感染和耐藥菌傳播的發(fā)生率。 美 國疾病控制與預(yù)防中心醫(yī)院感染管制與預(yù)防措施推薦接觸隔離 , 預(yù)防 MRSA 和 VRE 在醫(yī)院的 傳播。接觸隔離需要隔離衣、手套甚至面具來防止耐藥菌的傳播,這些措施都能有效控制 MRSA 和 VRE 傳播 5。但是,大多數(shù)醫(yī)院在標本培養(yǎng)出現(xiàn) MRSA 和 VRE 時才會使用接觸隔離。很多攜帶 MRSA (前鼻腔或傷口 和 VRE (胃腸道 的患者沒有感染的癥狀, 所以院內(nèi)大量攜帶 MRSA 和 VRE 而未確診的患者就成為傳染源 6。 MRSA 和 VRE 感染率和傳染率逐年提高,很多人認為現(xiàn)在 對其

4、控制措施不足,如果沒有發(fā)現(xiàn)傳染源并防止耐藥菌的傳播,就不可能控制 MRSA 和 VRE 7。2 有效監(jiān)測 MRSA 和 VRE 控制的障礙有效監(jiān)測 MRSA 和 VRE 的控制受到幾個障礙的限制。 首先, 現(xiàn)在用的篩選技術(shù)需要細菌 - 1 -培養(yǎng),限制了檢測 VRE 的靈敏度,整個檢測需要 48-72小時甚至更多時間。在出結(jié)果的時 間里,一定要對病人進行隔離,如果結(jié)果是陰性的,那么隔離就不必要,而那些沒有被隔離 但攜帶 MRSA 或 VRE 的病人就成為傳染源。其次,對廣大患者進行篩選需要大量資金,主要 是培養(yǎng)細菌以及隔離患者的費用。 最后, 隔離本身對患者的負面影響, 包括減少病人和護理 人

5、員的接觸和對患者不良的心理影響 8。在臨床快速、 靈敏、 廉價的篩選化驗檢測 VRE 和 MRSA 的應(yīng)用能克服很多前面提到的 問題。 直接檢測患者標本, 而不需要細菌培養(yǎng), 在短短的幾個小時里快速隔離 MRSA 和 VRE 攜帶者, 快速排除 MRSA 和 VRE 攜帶者以減少不必要的病人隔離。 集中精力在提高被隔離 患者的護理和監(jiān)護,減少負面作用的發(fā)生?？焖贆z測 MRSA 和 VRE 不僅有利于更集中有效的隔離, 而且還可以達到預(yù)防的目的從而 減少院內(nèi)感染。文獻中描述過很多快速檢測 MRSA 和 VRE 的方法, 9但是這些方法中大部分 還是在檢測之前需要細菌培養(yǎng),需要 24個小時或者更多

6、的時間來完成整個鑒定過程。本文 主要關(guān)注直接從病人標本中快速、 實時檢測 MRSA 和 VRE , 這個領(lǐng)域?qū)εR床指導有重要意義, 關(guān)于這方面的論述也相對較少。3直接檢測耐甲氧西林(苯唑西林的金葡菌3.1 MRSA的耐藥機制耐甲氧西林 (苯唑西林 的金葡菌是通過青霉素結(jié)合蛋白 PBP2a 的產(chǎn)物介導。 這種蛋白 由 mecA 基因編碼,使細菌對所有-內(nèi)酰胺類抗生素都耐藥,所以檢測 mecA 基因成為檢測 或確證耐甲氧西林的葡萄球菌(包括金葡菌的金標準 10。但是,在金葡菌中發(fā)現(xiàn)的 mecA 基因在所有葡萄球菌種類中都是高度保守,而且和凝固酶陰性的葡萄球菌(CoNS 攜帶的 基因同源,高達 80

7、%的耐甲氧西林株 11。從有菌部位(例如鼻腔拭子取材的臨床標本中 CoNS 經(jīng)常存在, 所以臨床取材有混合細菌的標本中只檢測 mecA 基因不足以區(qū)別 MRS 和耐甲 氧西林的 CoNS 。直接從臨床標本中快速檢測 MRSA 的方法可以直接檢測到 mecA 基因,也可以從表現(xiàn) 為 CoNS 的菌株中區(qū)分出金葡菌。在患者拭子中同時混有耐甲氧西林的金葡菌和 CoNS 時, 它也不能克服假陽性的結(jié)果。因此需要富集 MRSA 的方法。3.2 MRSA的直接檢測方法用苯唑西林肉湯集菌抑制 MSSA 的生長的方法需要孵育步驟,會延長檢測時間。例如, Levi et al.用比色檢測系統(tǒng)檢測 mecA 基因

8、和 coa 基因的等溫信號擴增法, 檢測 100個患者拭子 標本,相對于 mec-femB PCR結(jié)果,其敏感性為 58%,特異性 99%。但是這個檢測需要苯唑 西林肉湯集菌 18個小時 12。多重 PCR :樣本培養(yǎng)用更短的集菌時間(1-2個小時,用含有 6g/ml的苯唑西林 (抑制 MSSA 和 4%NaCl (抑制 CoNS 的培養(yǎng)肉湯。這種方法是在高鹽的條件下觀察金 葡菌,而不觀察 CoNS 。- 2 -快速一步免疫磁富集技術(shù):Francois et al.用抗體與蛋白 A 結(jié)合, 富集病人標本中金葡菌, 然后用三重定量 PCR 檢測 mecA 基因,金葡菌 femA 基因和 CoNS

9、 femA基因。用這個方法檢測 48個臨床標本(鼻腔,腹股溝和傷口拭子,與 MRSA 檢測培養(yǎng)結(jié)果比較,其敏感性 100 %,特異性 64%(9個假陽性結(jié)果。這個試驗所用時間不到 6個小時 13。乳膠凝集篩選試驗:將抗PBP2a的單克隆抗體結(jié)合在乳膠上.將待測菌株用提取試劑處 理后離心, 取上清液并與致敏乳膠混合, 以1O min內(nèi)出現(xiàn)凝集為陽性。 根據(jù)其凝集檢測PBP2a 的存在以PCR為對照,該方法特異性為100% ,敏感性為98.8%。此法簡便,特異性強,有 較高的敏感性,但該膠乳試劑的不易獲得,限制了其應(yīng)用 。隨著技術(shù)的發(fā)展,此項檢測方 法將越來越得到應(yīng)用。商品化的實時 PCR :直接

10、從鼻腔拭子標本中快速檢測 MRSA 。 這種方法由 SmartCycler 儀 器公司開發(fā),擴增的靶序列連接葡萄球菌的 mec 染色體和從 orfX 基因中的一段序列,這段序 列是金葡菌所特有。其敏感性為 92.5%,特異性為 94.6%。東京的Denka Seiken公司研制的 快速MRSAScreen檢測系統(tǒng). 已被肯定有較高的準確率(97% 的敏感性和接近100%的特異 性。這種檢測只需15分鐘即可。4 直接檢測 VRE4.1 VRE的耐藥機制耐萬古霉素的腸球菌由幾個不同的基因介導,包括 vanA , vanB , vanC , vanD , 和 vanE 。 以 vanA 和 vanB

11、 最常見,他們耐藥基因存在于質(zhì)粒上,耐藥性可以轉(zhuǎn)移。 VanA 和 vanB 基因多 見于屎腸球菌和糞腸球菌。 vanA 型對萬古霉素和替考拉寧的高水平耐藥,而 vanB 型對萬古 霉素高水平耐藥而對替考拉寧敏感。 VanA 和 vanB 都能編碼產(chǎn)生連接酶,能優(yōu)先產(chǎn)生腸球菌 細胞壁肽聚糖層的 D-AlaD-Lac 2肽,代替正常肽聚糖前體 5肽中的 D-AlaD-Ala ,造成了對 藥物的親和力下降 1000倍以上,從而導致了對萬古霉素的高水平耐藥 14。4.2 VRE的直接檢測方法多重 PCR :Satake et al.首先用多重 PCR 凝膠試驗從糞便中直接檢測到 vanA 和 van

12、B 。據(jù) 報道,從糞便或者腸拭子中用凝膠技術(shù)直接檢測 vanA 和 vanB 的敏感率為 68%-87%,特異 性接近 100%15。雖然凝膠技術(shù)能在收集到標本后的 6-8小時出結(jié)果,但是和實時 PCR 相比 較,它會提高實驗室和標本污染的機率,需要更多技術(shù)人員的時間,延長檢測的時間。 實時 PCR :Palladino et al.最近報道了用實時 PCR 直接從患者標本或者分離菌株中檢測 vanA 和 vanB 。 相對于萬古霉素肉湯增菌的金標準, PCR 直接檢測直腸拭子的敏感率為 50%, 好過對直腸拭子直接培養(yǎng)的敏感率。在萬古霉素增菌肉湯培養(yǎng) 24小時后的標本再做 PCR , 其敏感

13、率會大幅度提高到 88%。這個步驟會增加一整天的培養(yǎng)時間,但和傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術(shù) 相比,它仍然會提前 2-3天得出結(jié)果。但研究者發(fā)現(xiàn)由于高水平的標本抑制的原因,使實 時 PCR 直接檢測 vanA 和 vanB 不適合臨床常規(guī)使用 16。- 3 -5 實時 PCR 從患者標本中直接檢測 MRSA 和 VRE 的缺陷實時 PCR 試驗迅速快捷,臨床容易接受,也顯著增多了它的使用。至于任何實驗室試 驗都有超量使用的潛在可能性-檢測所有住院病人的費用,包括那些不大可能是 VRE 和 MRSA 攜帶者檢查所用的費用,會使試驗的利大于弊。所以這些試驗需要合理使用。用快 速方法對高危病房的病人進行有效的檢測,

14、 或者是對攜帶有 MRSA 和 VRE 危險因素的病人 進行有效的監(jiān)測。對高危病人用這些測定法是因為 PCR 的極高敏感性。 但是, 現(xiàn)在還不清楚帶有極低水平 細菌的病人, 其發(fā)生 VRE 傳播的機率多大。 如果對低水平 VRE 攜帶者用抗生素很可能會快速 增加 VRE 的負擔 17。相反,對那些幾乎沒有危險因素的病人和只是希望短期住院的病人, 檢測他們的低水平攜帶者,就沒有任何好處。不需要培養(yǎng)的快速檢測耐藥基因的方法,另一個局限性是得不到分純的細菌。培養(yǎng)細 菌的分純可以估計細菌對抗生素的耐藥性,也可以確定院內(nèi)傳染細菌的分子類型 18。所以 對一些病人的標本做接種培養(yǎng)非常重要, 而當 PCR

15、陰性且沒有標本抑制現(xiàn)象, 就不需要做接 種培養(yǎng)。6 結(jié)語醫(yī)院內(nèi)最重要的兩種耐藥菌是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 (MRSA 和耐萬古霉素腸球 菌(VRE ,他們通常在病人中相互傳染造成死亡率的增高和醫(yī)療費用的增加。對 MRSA 和 VRE 攜帶者的早期而準確的檢測可利于進行集中隔離和預(yù)防, 從而降低相互感染和發(fā)病。 但現(xiàn)在快速(實時檢測 MRSA 和 VRE 的 PCR 技術(shù)在很大程度上不能滿足臨床的需要。 本文介紹了最新的實時快速檢測方法, 并分析了此方法的原理、 優(yōu)點極其存在的不足, 對今 后的研究工作提出了幾點建議。參考文獻1 Centers for Disease Control and

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