水蛭素在畢赤酵母中的分泌表達

1、水蛭素在畢赤酵母中的分泌表達龍錮，劉家云，劉莉，王宗仁【關鍵詞】畢赤酵母SecretoryexpressionofhirudinsinPichiapastorisAbstractAIM:ToconstructhirudinexpressionvectorsandobtainitssecretoryexpressioninPichiapastoris(P.pastoris).METHODS:HirudinHV2andHV2N47KgeneswereamplifiedbyPCRandthecorrectgeneswerefusedtopPIC9afactorsignalandsubclonedin

2、topPIC9Ksecretoryexpressionvector.TheconstructsweretransformedintoP.pastorisstrainGSM1168,stablemulticopyintegrantswerescreenedonmediumcontainingincreasingconcentrationsofG418.Thenthescreenedoutcloneswereinducedbymethanoltoexpresshirudinproteins.ThesupernatantsofexpressionproductswereidentifiedbySDS

3、PAGEandWesternblotanalysis,anditsantithromboticactivitywasdeterminedtoo.RESULTS:Theexpressionvectorsweresuccessfullyconstructed,hirudinswereexpressedinsupernatantsofP.pastoris,andtheexpressionproductspossessedantithromboticactivity.CONCLUSION:HirudinscanbeexpressedsecretorilyinP.pastoris,whichoffers

4、abasisfornewdrugresearches.Keywordshirudin;Pichia;secretoryexpression【摘要】目的：構(gòu)建水蛭素畢赤酵母表達載體，取得重組蛋白在畢赤酵母中的分泌型表達.方式：通過PCR擴增取得水蛭素HV2,HV2X47K基因，將序列正確的基因序列插入酵母表達載體pPIC9a分泌信號下游，再亞克隆入高拷貝載體PPIC9K,構(gòu)建表達質(zhì)粒pPIC9KHV2,pPIC9KHV2X47K.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌GSM1168,G418抗性挑選高拷貝的穩(wěn)固表達菌株，經(jīng)甲醇誘導表達并對表達產(chǎn)物進行鑒定.結(jié)果：成功構(gòu)建了水蛭素畢赤酵母表達載體，取得水蛭素在畢赤酵母

5、中的分泌型表達，表達產(chǎn)物具有抗凝血酶活性.結(jié)論：水蛭素在畢赤酵母中取得分泌型表達，為研究新藥奠定了基礎.【關鍵詞】水蛭素；畢赤酵母；分泌表達0引言水蛭素(hirudin)是從水蛭(Hirudomedicinalis)中分離出的抗凝血活性成份，是凝血酶的天然抑制劑1,具有高效的抗血栓形成作用和超級廣漠的應用前景2-3.可是天然水蛭素來源匱乏,限制了其研究和臨床應用，咱們以水蛭素HV2,HV2X47K的氨基酸序列為對象，通過PCR擴增取得了目的基因，克隆入畢赤酵母(PichiaPastoris)表達載體pPIC9K中，構(gòu)建了水蛭素酵母分泌型表達載體，轉(zhuǎn)化SMD1168畢赤酵母細胞并進行誘導表達，取

6、得了具有抗凝血酶活性的表達產(chǎn)物，為水蛭素的研究及臨床應用奠定了基礎.1材料和方式材料質(zhì)粒pPIC9,pPIC9K,ToplOF菌株及畢赤酵母菌SMD1168由本實驗室保留.TaKaRaTaq酶，限制性內(nèi)切酶(EcoRI,Xhol,BamHI,Sall),T4DA連接酶均購自寶生物公司.發(fā)色底物ChromozymTH及ECL化學發(fā)光檢測試劑盒購自Roche公司，鼠抗hirudin單抗(mAb)購自AntibodyShop公司，酵母基因組DA純化試劑盒購自上海華舜生物工程公司.電泳儀、電轉(zhuǎn)儀均為BioRad公司產(chǎn)品.引物合成及DNA測序由北京三博遠志生物技術公司完成.方式水蛭素基因的獲取依照水蛭素

7、HV2的氨基酸序列，依照文獻4方式，采納分段合成寡核甘酸片段，互補寡核甘酸片段的退火配對后，進行PCR擴增而取得HV2基因.HV2N47K是通過DNA改組和噬菌體親和挑選取得的具有較高抗凝血酶活性的水蛭素變異體5,HV2N47K基因經(jīng)PCR從pCANTAB5EHV2X47K載體中獲取.用于PCR擴增的上游引物P1：5'CTCTCGAGAAMGAATTACTTAC3z,引入Xhol酶切位點，下游引物P2：5'GGGAATTCCTATTGTAAATATTC3',引入EcoRI位點.PCR擴增參數(shù)：94c變性45s,55退火45s,72延伸50s,共進行30個循環(huán).擴增的PC

8、R產(chǎn)物于15g/L瓊脂糖凝膠中進行電泳鑒定.酵母表達載體的構(gòu)建將PCR產(chǎn)物用EcoRI和Xhol雙酶切，回收目的片段，插入經(jīng)相同酶切的PPIC9載體，轉(zhuǎn)化宿主菌T0P10F,提取質(zhì)粒，酶切鑒定含有全長HV1基因的重組子，并將其送上海生工生物工程公司測序.DNA測序正確后（命名為pPIC9HVl）,再經(jīng)BamHI,Sall酶切后定向插入畢赤酵母表達載體PPIC9K,取得高拷貝表達載體PPIC9KHV2.酵母菌的轉(zhuǎn)化及高拷貝整合菌株的挑選挑取GSM1168單菌落接種于10mLYPD中，30C振蕩留宿，1%體積轉(zhuǎn)接至100mLYPD中擴大培育至A600=；菌液于4,1000g離心5min,菌體依次用

9、50mL預冷的去離子水和10mL預冷的1mol/L山梨醇洗滌，最后將細胞重懸于mL預冷的山梨醇溶液中.Sall線性化的pPIC9KHVl及空載體pPIC9K各10Ug別離與100UL酵母細胞混勻，加入電轉(zhuǎn)杯，冰浴5min,BioRad電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)化，電擊終止后當即加入1mL預冷的1mol/L的山梨醇溶液，混勻.取mL轉(zhuǎn)化物涂布于ID（g/LYNB,4X10-4g/LBiotin,20g/LDextrose,20g/L瓊脂，1mol/L山梨醇）選擇平板上，30培育24d,觀看轉(zhuǎn)化子的生長.再將MD平板上生長的陽性克隆依次轉(zhuǎn)種至含1,2,3,4,5g/LG418的MD平板上，以在高濃度G418上正常生

10、長的菌落為高拷貝整合菌株.挑取高拷貝整合單菌落進行擴增，提取其基因組DNA,別離用P1和P2引物進行PCR擴增.表達菌株的培育及誘導表達取鑒定的單克隆菌株于2mLYPD中，30250r/min搖床培育過液，再以1%的量接種于10mLBMGY培育液（10g/L酵母提取物，20g/L蛋白豚，10g/L甘油，g/LYNB,mg/L生物素，L磷酸鉀緩沖液）中，于30C,250r/min的搖床上培育至A600為48.離心搜集菌體,棄去BMGY培育基，改換為20mLBMMY培育液（10g/L酵母提取物，20g/L蛋白豚，mol/L磷酸鉀緩沖液，g/LYNB,mg/L生物素，5mL/L甲醇）于30c誘導表達

11、，每24h加入甲醇（終濃度為50mL/L,V/V）并取樣，離心搜集上清進行SDSPAGE鑒定.表達產(chǎn)物的分析表達菌株經(jīng)誘導培育后，取表達上清進行15%的SDSPAGE電泳，用轉(zhuǎn)印儀將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用封鎖液37處置膜2h,漂洗后加人兔抗人酸性成纖維細胞生長因子的多克隆抗體于37c孵育1h.用PBS漂洗后，加入鼠抗hirudinmAb和HRP羊抗鼠IgG室溫孵育1h,用ECL化學發(fā)光底物壓片曝光，顯影后觀看結(jié)果.表達產(chǎn)物的活性檢測取誘導表達的酵母上清液50HL,凝血酶50UL(60U/L)力口入至lj1mL反映緩沖液(50mmol/LTrisHClpH,mol/LNaCl)中,37保溫5

12、小1.11,加入發(fā)色底物ChromozymTH,405nm波長下測定表達產(chǎn)物的活性，結(jié)果以每分鐘A值的轉(zhuǎn)變A405/min表示.2結(jié)果水蛭素基因的獲取參照水蛭素HV2的氨基酸序列，分段合成的寡核甘酸片段磷酸化后，互補配對的堿基經(jīng)退火形成雙鏈DXA,經(jīng)PCR擴增，取得約220bp的基因片段；同理，經(jīng)PCR從pCANTAB5EHV2N47K載體中擴增，取得HV2N47K基因片段(圖1).1: HV2基因PCR結(jié)果;2:HV2N47K基因PCR結(jié)果;3:pPIC9HV2；4:pPIC9HV2N47K；5:pPIC9；6:pPIC9KHV2；7:pPIC9KHV2N47K；8:pPIC9K；M:DL2

13、000DNA分子量標準；入:入HindHI酶切片斷.圖1目的基因的獲取及表達載體的Xhol和EcoRI雙酶切鑒定結(jié)果(略)酵母表達載體的構(gòu)建及鑒定HV2,HV2N47K基因PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)EcoRI和Xhol雙酶切，插入pPIC9載體，轉(zhuǎn)化宿主菌T0P10F,提取質(zhì)粒，DNA測序結(jié)果說明所取得的水蛭素基因與預期序列完全一致.序列正確的重組質(zhì)粒命名為PPIC9HV2,pPIC9HV2X47K,后者經(jīng)BamHI,Sall酶切后定向插入PPIC9K,取得高拷貝表達載體pPIC9KHy2,PPIC9KHV2N47K,經(jīng)Xhol,EcoRI雙酶切鑒定，取得約220bp的目的基因片段和被切成約kb的兩個載

14、體片段（圖1）,說明目的基因已正確克隆入表達載體中.的轉(zhuǎn)化及高拷貝整合菌株的挑選Sall線性化的pPIC9KHV2,PPIC9KHV2N47K質(zhì)粒轉(zhuǎn)化GSM1168感受態(tài)細胞，在MDS平板上培育，取得His+轉(zhuǎn)化菌落，將轉(zhuǎn)化的His+菌落點種至含G418濃度為1,2,3,4,5g/L的MD平板上，隨G418濃度的增加，GSM1168轉(zhuǎn)化His+菌生長速度顯現(xiàn)不同.取5g/LG418平板上生長的菌落增菌培育，提取酵母基因組DNA,進行PCR鑒定，結(jié)果以P1和P2引物所進行的PCR擴增均為陽性（圖2）,提示水蛭素基因己成功整合到畢赤酵母染色體中.M:DL2000DNA分子量標準；1,8:SMD11

15、68；2"4:pPIC9KHV2整合克隆；57:pPIC9KHV2N47K整合克隆.圖2PCR鑒定目的基因的整合（略）水蛭素的誘導表達重組有水蛭素基因的酵母菌株GSM1168經(jīng)誘導表達后于培育基中可檢出Mr約為7000的蛋白質(zhì)，該蛋白在培育基中的含量隨誘導時刻的延長而增多，在誘導表達120h后接近峰值.經(jīng)Westernblot鑒定表達的蛋白能與鼠抗hirudinmAb結(jié)合，提示水蛭素在畢赤酵母菌SMD1168中取得分泌性表達（圖3）.A:表達產(chǎn)物的SDSPAGE分析；B：表達產(chǎn)物的Westernblot鑒定.M:蛋白分子量標準；1:pPIC9HV2誘導72h培育上清；2:PPIC9H

16、V2未誘導培育上清；3:pPIC9HV2N47K誘導120h培育上清；4:pPIC9HV2誘導72h培育上清；5:pPIC9HV2N47K誘導120h培育上清.圖3表達產(chǎn)物的SDSPAGE和Westernblot鑒定（略）表達產(chǎn)物的抗凝血酶活性分析酵母誘導表達產(chǎn)物采納發(fā)色底物ChromozymTH測定其抗凝血酶活性，水蛭素HV2和HV2N47K表達上清的A405/min別離為，說明表達產(chǎn)物具有抗凝血酶活性，且HV2N47K的活性比HV2強.3討論巴斯德畢赤酵母（P.Pastoris）是一種最近幾年來普遍利用的真核基因表達系統(tǒng)，它具有表達效率高、遺傳穩(wěn)固性好、糖基化適中、表達產(chǎn)物可分泌和發(fā)酵工藝

17、成熟等許多優(yōu)勢，尤其是在分泌表達方面，由于自身細胞分泌的蛋白少，重組蛋白分泌量高，適合工業(yè)生產(chǎn)時的高密度發(fā)酵，有利于下游純化.因此，畢赤酵母表達系統(tǒng)是最近幾年來被公認的最有效的外源蛋白表達系統(tǒng)之一，己有多種外源蛋白在該宿主系統(tǒng)中取得了成功表達6.畢赤酵母是一種甲基營養(yǎng)型酵母，在缺乏抑制性碳源如葡萄糖、甘油時，能利用甲醇作為惟一碳源，其甲醇利用的關鍵基因醇氧化酶基因(A0X1)的表達量可占細胞總mRNA的5%,該酶可占細胞總蛋白的30%以上，A0X1啟動子受甲醇的嚴格誘導表達，被普遍用于驅(qū)動外源蛋白的高效表達，PPIC9,pPIC9K表達載體即采納了A0X1高效表達啟動子7.實驗中咱們將水蛭素基

18、因插入PPIC9a分泌信號下游，利用A0X1高效啟動子使目的基因能在酵母中高效分泌表達.在畢赤酵母表達系統(tǒng)中，外源基因是通過同源重組整合到宿主菌的染色體上的，因此構(gòu)建的表達菌株穩(wěn)固性很高.載體與酵母染色體的同源重組有兩種方式：一是線性化載體與宿主染色體發(fā)生雙互換，取代宿主染色體A0X1基因；另一種是經(jīng)單互換插入宿主染色體的A0X1位點或His4位點.單互換轉(zhuǎn)化效率比雙互換高，且易患到多拷貝整合.一樣來講，整合的拷貝數(shù)越多，表達量越高8.咱們采納Sall單酶切使表達載體線性化，表達框與宿主基因組發(fā)生單互換而整合于染色體中.由于PPIC9K載體帶有卡那抗性基因，使陽性轉(zhuǎn)化菌產(chǎn)生G418抗性，且整合

19、的拷貝數(shù)與G418抗性之間有必然的計量依托關系，通過提高G418濃度，容易挑選到高拷貝穩(wěn)固整合菌株?實驗結(jié)果說明，表達菌株即使在非選擇性培育基中經(jīng)120h誘導培育，仍能夠有效地分泌具有生物學活性的目的蛋白.咱們通過PCR擴增取得了目的基因，成功構(gòu)建了水蛭素HV2,HV2N47K畢赤酵母表達載體，經(jīng)抗性挑選取得穩(wěn)固整合菌株并進行誘導表達，取得了具有抗凝血酶活性的表達產(chǎn)物，為水蛭素的新藥研究及臨床應用奠定了基礎.【參考文獻】1 MarkwardtF.HirudinasalternativeanticoagulantahistoricalreviewJ.SeminThrombHemost,2002,28(5):405-414.2 SohnJH,KangHA,RaoKJ,etal.Currentstatusoftheanticoagulanthirudin:itsbiotechnologicalproductionandclinicalpracticeJ.ApplMicrobiolBiotechnol,2001,57(56):606-613.3YavinYY,WolozinskyM,Cohen