微生物感染的診斷及防治

1、1第十三章 微生物感染的診斷與防治2微生物學(xué)診斷微生物學(xué)診斷Microbiological diognosis病原學(xué)診斷病原學(xué)診斷血清學(xué)診斷血清學(xué)診斷直接依據(jù)直接依據(jù)間接依據(jù)間接依據(jù)第一節(jié) 微生物感染的診斷3（一）細菌學(xué)診斷（一）細菌學(xué)診斷標(biāo)本的采集和送檢四原則標(biāo)本的采集和送檢四原則區(qū)別取材區(qū)別取材盡快送檢盡快送檢無菌操作無菌操作妥善處理妥善處理4無菌采集無菌采集 嚴(yán)格無菌操作，避免標(biāo)本被污染嚴(yán)格無菌操作，避免標(biāo)本被污染。標(biāo)本。標(biāo)本收集于無菌容器中，容器須先經(jīng)高壓滅菌、收集于無菌容器中，容器須先經(jīng)高壓滅菌、煮沸、干熱等物理方法滅菌，或用一次性無煮沸、干熱等物理方法滅菌，或用一次性無菌容器，而不

2、能用消毒劑處理。菌容器，而不能用消毒劑處理。5取樣部位取樣部位v不同疾病、不同時期取不同部位標(biāo)本不同疾病、不同時期取不同部位標(biāo)本 如流腦病人取如流腦病人取CSFCSF、血液或出血瘀斑；傷寒病人、血液或出血瘀斑；傷寒病人在病程在病程1 12 2周內(nèi)取血液，周內(nèi)取血液，2 23 3周時取糞便。周時取糞便。v盡可能取病變明顯部位的材料盡可能取病變明顯部位的材料 取局部病變標(biāo)本，取局部病變標(biāo)本，不可使用消毒劑不可使用消毒劑，必要時以無，必要時以無菌生理鹽水沖洗，拭干后取材。菌生理鹽水沖洗，拭干后取材。6早期采集早期采集v采集時間最好是病程早期、急性期或癥狀采集時間最好是病程早期、急性期或癥狀典型時，且

3、典型時，且必須在抗菌藥物使用前，必須在抗菌藥物使用前，否則否則這份標(biāo)本在分離培養(yǎng)時要加入藥物拮抗劑。這份標(biāo)本在分離培養(yǎng)時要加入藥物拮抗劑。7 v一般標(biāo)本采集后最好在一般標(biāo)本采集后最好在2h內(nèi)內(nèi)送檢，大多細送檢，大多細菌可菌可4冷藏運送、特殊（如腦膜炎奈瑟菌、冷藏運送、特殊（如腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌）需淋病奈瑟菌）需保溫立即送檢保溫立即送檢。v糞便標(biāo)本中雜菌多，常置于甘油緩沖鹽水糞便標(biāo)本中雜菌多，常置于甘油緩沖鹽水保存液中。保存液中。盡快送檢、冷藏運送盡快送檢、冷藏運送8（二）病原菌的檢驗程序檢查致病菌檢查致病菌 1 1、形態(tài)學(xué)檢查形態(tài)學(xué)檢查examination in morphologye

4、xamination in morphology直接鏡檢：直接鏡檢：形態(tài)和染色性上有特征的致病菌形態(tài)和染色性上有特征的致病菌，直接涂片鏡檢后有助于初步診斷。 如：痰中查抗酸性桿菌，膿液中找G+葡萄串狀球菌，霍亂弧菌等。910112、分離培養(yǎng)（、分離培養(yǎng)（isolation and cultivation）：）： 所有標(biāo)本均應(yīng)作分離培養(yǎng)獲得純培養(yǎng)后進一步所有標(biāo)本均應(yīng)作分離培養(yǎng)獲得純培養(yǎng)后進一步鑒定，根據(jù)不同要求選用不同培養(yǎng)基。鑒定，根據(jù)不同要求選用不同培養(yǎng)基。 分離培養(yǎng)比直接涂片鏡檢陽性率高，但需時較分離培養(yǎng)比直接涂片鏡檢陽性率高，但需時較久；大多細菌久；大多細菌1624h，結(jié)核桿菌需，結(jié)核桿菌

5、需48w。 分離培養(yǎng)是微生物學(xué)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。分離培養(yǎng)是微生物學(xué)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。12分離培養(yǎng)分離培養(yǎng)isolation and cultivation 分離培養(yǎng)是分離培養(yǎng)是微生物學(xué)診微生物學(xué)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，斷的金標(biāo)準(zhǔn)，是最可靠的是最可靠的傳統(tǒng)診斷技傳統(tǒng)診斷技術(shù)。術(shù)。（圖為普通孵箱）（圖為普通孵箱）13 厭氧箱 厭氧袋14 各種細菌所具有的酶不完全相同，對營養(yǎng)物各種細菌所具有的酶不完全相同，對營養(yǎng)物質(zhì)的分解能力亦不一致，因而其代謝產(chǎn)物有別，質(zhì)的分解能力亦不一致，因而其代謝產(chǎn)物有別，藉此可對不同致病菌進行鑒別（如腸道桿菌）。藉此可對不同致病菌進行鑒別（如腸道桿菌）。3 3、生化試驗、生化試驗糖發(fā)酵試驗1

6、54 4、血清學(xué)試驗：、血清學(xué)試驗： 含特異抗體的免疫血清未知純種細菌進含特異抗體的免疫血清未知純種細菌進行血清學(xué)實驗，可確定致病菌的種和型。常見行血清學(xué)實驗，可確定致病菌的種和型。常見有有玻片凝集試驗玻片凝集試驗。玻片凝集試驗165、動物試驗：v主要用于分離、鑒定致病菌，測定菌株產(chǎn)毒性等。 v常用動物：小鼠、豚鼠、家兔 v接種途徑：皮內(nèi)、皮下、腹腔、肌肉、靜脈、腦內(nèi)等。176 6、藥物敏感試驗、藥物敏感試驗 v測定標(biāo)本中致病菌對藥物的敏感程度；對指導(dǎo)臨床用藥及控制感染有重要意義。v 常用紙碟法和試管稀釋法。18檢測致病菌的成分檢測致病菌的成分病原菌的抗原病原菌的核酸：免疫熒光免疫熒光ELIS

7、AELISA對流免疫電泳對流免疫電泳PCRPCR雜交：雜交：SouthernSouthern，檢測，檢測DNADNA Northern Northern，檢測，檢測RNARNA 原位雜交原位雜交 斑點雜交斑點雜交1920分子生物學(xué)技術(shù)分子生物學(xué)技術(shù) molecular biological techniques 核酸雜交核酸雜交 nucleotide hybridization 原位雜交原位雜交 in situ hybridization 斑點雜交斑點雜交 dot blot Southern blot Northern blot PCR 技術(shù)：多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)：多聚酶鏈反應(yīng) (polymera

8、se chain reaction,PCR )21（三）血清學(xué)診斷 采用已知的細菌或其特異性抗原，檢測患者血清或其他體液中有無相應(yīng)特異性抗體及其效價的動態(tài)變化，可作為某些傳染病的輔助診斷。 22p在血清學(xué)診斷中，最好采取患者急性期和恢復(fù)期雙份血清標(biāo)本雙份血清標(biāo)本。 p結(jié)果結(jié)果：以抗體效價明顯高于正常人水平或患者恢復(fù)期抗體效價比急性期升高升高44倍倍方有意義。p常用有凝集實驗、沉淀實驗、補體結(jié)合實驗、中和試驗、ELISA等。23 肥達試驗肥達試驗 玻片凝集實驗玻片凝集實驗24細菌學(xué)診斷基本方法25二、病毒學(xué)診斷26檢測內(nèi)容檢測內(nèi)容查抗原查抗原查特異性抗體查特異性抗體 病毒顆粒病毒顆粒 病毒抗原病

9、毒抗原 病毒核酸病毒核酸 病毒酶類：如逆轉(zhuǎn)錄酶病毒酶類：如逆轉(zhuǎn)錄酶 電鏡直接觀察電鏡直接觀察 光鏡檢查包含體光鏡檢查包含體 分離培養(yǎng)分離培養(yǎng)27 1、采集時間：用于分離病毒或檢測病毒及其核酸的標(biāo)本，應(yīng)采集病人急性期急性期標(biāo)本。血清學(xué)檢查的標(biāo)本最好取雙份。 2、標(biāo)本種類：根據(jù)不同病毒感染采集不采集不同部位同部位標(biāo)本(如鼻咽拭子、腦脊液、血液、糞便或皰疹液)。 （一）標(biāo)本的采集原則283、標(biāo)本運送：應(yīng)立即送檢，運送標(biāo)本中注意冷藏冷藏。保存于含抗生素的運送液中。不能立即送檢時應(yīng)存放于-70低溫冰箱或液氮內(nèi)保存。 4、標(biāo)本處理：有雜菌標(biāo)本應(yīng)用高濃度抗生素抗生素處理（處理（44）并離心）并離心。29細胞

10、培養(yǎng)動物接種 雞胚接種 （二）病毒的分離與鑒定301、動物接種、動物接種 最最原始原始的病毒培養(yǎng)方法。根據(jù)病毒種的病毒培養(yǎng)方法。根據(jù)病毒種類不同，選擇敏感動物及適宜接種部位。類不同，選擇敏感動物及適宜接種部位。 如：如： 狂犬病病毒狂犬病病毒 小鼠腦內(nèi)小鼠腦內(nèi) 柯薩奇病毒柯薩奇病毒 乳鼠腹腔或腦內(nèi)乳鼠腹腔或腦內(nèi) 乙型腦炎病毒乙型腦炎病毒 小鼠腦內(nèi)小鼠腦內(nèi)312、雞胚培養(yǎng)絨毛尿囊膜絨毛尿囊膜/尿囊腔尿囊腔/羊膜腔羊膜腔/卵黃囊卵黃囊32痘苗V、HSVIFV、腮腺炎VIFV嗜神經(jīng)V3334 流感病毒分離培養(yǎng)的最好方法是雞胚接種。接種羊膜腔（初次分離），尿囊腔（傳代）；然后取羊水或尿囊液做血凝和血凝

11、抑制試驗鑒定。v血凝試驗血凝試驗：v羊水羊水/尿囊液尿囊液+雞雞RBC 紅細胞凝集紅細胞凝集v表明有病毒存在和增殖表明有病毒存在和增殖35 血凝實驗血凝實驗363、細胞培養(yǎng) 是從機體中取出組織或細胞，模擬機體內(nèi)的生理條件在體外進行培養(yǎng)，使之生存和生長。3738細胞培養(yǎng)的優(yōu)點：v 來源方便，容易選擇易感細胞。v 無免疫力，利于病毒生長。v 培養(yǎng)條件易于控制：可以用人工控制溫度、氣體、pH、培養(yǎng)基成分。v 接種量大：細胞可以大量生產(chǎn)，而且還可較久地持續(xù)培養(yǎng)。動物和雞胚的接種均受數(shù)量、年齡、途徑的限制。v 加速病毒分離過程：病毒分離采用細胞培養(yǎng)不僅陽性率高，而且分離過程可顯著加速，早出結(jié)果。39（1

12、）細胞類型v原代細胞原代細胞 動物或人組織直接用蛋白酶消化所得的細胞經(jīng)體外培養(yǎng)后可貼壁或懸浮生長。（人胚肺細胞，雞胚細胞、猴腎細胞、兔腎細胞等）40v二倍體細胞二倍體細胞 在體外連續(xù)培養(yǎng)5060代仍保持其二倍染色體數(shù)目的細胞。為生產(chǎn)人用疫苗的首選細胞株。為生產(chǎn)人用疫苗的首選細胞株。v傳代細胞傳代細胞 能在體外連續(xù)傳代，來自腫瘤細胞或發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化、突變的原代細胞或二倍體細胞株。41 優(yōu)優(yōu) 點點 缺缺 點點 用用 途途原代細胞原代細胞 多種V敏感 來源困難、成本高、 分離 攜帶潛伏病毒 二倍體細胞二倍體細胞 多種V敏感 來源易, 50代 診斷/疫苗制備傳代細胞傳代細胞 無限傳代，來源易 致瘤性 分

13、離/鑒定/研究V42（2）病毒在細胞內(nèi)增殖的指征細胞的變化v細胞病變效應(yīng)細胞病變效應(yīng)(cytopathic effect, CPE)(cytopathic effect, CPE)： 病毒在細胞內(nèi)增殖后，可引起細胞形態(tài)學(xué)改變，如細胞腫脹、變圓、皺縮、融合或細胞聚集成葡萄串狀，甚至細胞溶解或脫落等，這種可在普通光鏡下看到的由病毒增殖引起的細胞形態(tài)變化，稱為CPE。v包涵體包涵體43細胞病變效應(yīng)（CPE）4445包涵體形成46紅細胞吸附現(xiàn)象 某些病毒感染的宿主細胞能吸附脊椎動物的紅細胞。干擾現(xiàn)象 474、病毒的鑒定（1）病毒種類與型別鑒定v 初步鑒定：動物感染范圍及潛伏期、對雞胚的敏感性、細胞形態(tài)

14、變化類型、紅細胞吸附、病毒干擾現(xiàn)象、血凝性質(zhì)、理化性質(zhì)（核酸類型測定、大小形態(tài)、乙醚敏感試驗、耐酸試驗）等。v 最后鑒定：主要是血清學(xué)方法（中和試驗、補體結(jié)合試驗、血凝抑制試驗、IFA和ELISA等）和分子生物學(xué)方法。48（2）病毒感染性測定v50%組織培養(yǎng)感染量（ 50% tissue culture infective dose ，TCID5050）： 引起半數(shù)培養(yǎng)細胞發(fā)生病變（CPE）的病毒量。v蝕斑形成單位（ plaque forming unit，PFU）： 在細胞培養(yǎng)表面覆蓋一層半固體物質(zhì)使細胞病變形成蝕斑。49病毒標(biāo)本（充分稀釋） 單層細胞 37，60min，吸附，洗滌覆蓋瓊脂

15、37，35d觀察蝕斑（中性紅/結(jié)晶紫染色）PFU/mlPFU/ml： 定量測定病毒感染性定量測定病毒感染性50（三）血清學(xué)診斷v 中和試驗：中和試驗是指病毒在活體內(nèi)或細胞培養(yǎng)中被特異性抗體中和而失去感染性的一種試驗。 可用來檢查患病后或人工免疫后機體血清中抗體的增長情況，也可用來鑒定病毒或研究其抗原結(jié)構(gòu)。中和抗體特異性高，維持時間較長，因此流行病學(xué)常用此法。51v 血凝抑制試驗：許多病毒能凝集雞、豚鼠、人等的紅細胞，稱為血凝現(xiàn)象。這種現(xiàn)象能被相應(yīng)抗體所抑制，稱血凝抑制試驗。常用于含血凝素的病毒（如流感病毒、乙腦病毒）的輔助診斷和流行病學(xué)調(diào)查。v 補體結(jié)合試驗：可作為近期感染的指標(biāo)。v ELIS

16、A：可檢測多種病毒抗體，應(yīng)用廣泛。52l形態(tài)學(xué)檢查1、光學(xué)顯微鏡檢查 ： 檢查包涵體包涵體2、電子顯微鏡檢查： 如輪狀病毒、冠狀病毒等l病毒抗原檢查 有免疫熒光（IFA）、放射免疫技術(shù)、酶免疫技術(shù)（EIA）等。（四）病毒感染的快速診斷53輪狀病毒54l特異性抗體（IgM）的檢測： 如：HAV、風(fēng)疹病毒和針對EBV早期抗原的抗體； 用于急性感染急性感染，特別是先天性感染先天性感染的診斷。l檢測病毒核酸 ： 包括核酸分子雜交技術(shù)和PCR，如HBV、HCV、HSV、CMV等的檢測。 55三、真菌學(xué)診斷（一）標(biāo)本采集的原則（一）標(biāo)本采集的原則 56（二）病原性真菌的分離與鑒定1.直接鏡檢v 不染色標(biāo)本

17、：皮屑、毛發(fā)、指（趾）甲屑等置玻片上，加10KOH、微微加溫，軟化角質(zhì)。輕壓蓋玻片，使標(biāo)本變薄透明，然后鏡檢。如觀察到菌絲和孢子，可初步診斷。v 染色標(biāo)本：GS、墨汁負染2.分離培養(yǎng)v 標(biāo)本處理后接種沙保培養(yǎng)基或血平板上，觀察菌落及菌絲孢子形態(tài)等加以鑒定，必要時作小培養(yǎng)。573.動物實驗4.核酸的檢測5.真菌毒素的檢測 58第二節(jié) 微生物感染的防治原則59一、細菌感染的特異性防治 特異性防治是應(yīng)用特異性免疫的原理，給機體注射或服用病原微生物抗原（包括類毒素）或特異性抗體以達到預(yù)防和治療感染性疾病的目的。這種方式稱為人工免疫。 人工免疫分為人工主動免疫人工主動免疫和人工被動免疫人工被動免疫兩種。

18、60（一）人工主動免疫v人為地將疫苗（vaccine）或類毒素接種于人體，使機體主動產(chǎn)生特異性免疫力的一種防治微生物感染的措施。v 常用人工主動免疫制劑有： 61常用制劑常用制劑l疫苗疫苗 -滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗、 核酸疫苗、重組活載體疫苗、轉(zhuǎn)基因植物疫苗和治療性疫苗。l類毒素類毒素621.1.死疫苗死疫苗：v選用免疫原性強的細菌經(jīng)人工大量培養(yǎng)后，用理化方法殺死而成。如傷寒、百日咳、霍亂等。v 優(yōu)點：易于保存。v 缺點：接種劑量大；維持時間短；接種次數(shù)多；注射的局部和全身性副反應(yīng)較大；不產(chǎn)生細胞免疫應(yīng)答。632.2.減毒活疫苗減毒活疫苗： v 用減毒或無毒力的活病原體制成；如用減毒

19、或無毒力的活病原體制成；如BCG BCG v優(yōu)點優(yōu)點：只需接種一次、接種劑量較小、：只需接種一次、接種劑量較小、 副反應(yīng)輕副反應(yīng)輕微或無、免疫效果好且持久、能同時產(chǎn)生細胞免微或無、免疫效果好且持久、能同時產(chǎn)生細胞免疫和體液免疫；以自然途徑接種，有疫和體液免疫；以自然途徑接種，有SIgASIgA抗體的抗體的局部粘膜免疫形成。局部粘膜免疫形成。v缺點缺點：不易保存（冷藏且保存期短）、回復(fù)毒力：不易保存（冷藏且保存期短）、回復(fù)毒力的危險性的危險性64區(qū)別點區(qū)別點死疫苗死疫苗活疫苗活疫苗制劑特點制劑特點死，強毒株死，強毒株活減毒株活減毒株接種劑量與特點接種劑量與特點量較大，量較大，23次次量較小，量較

20、小，1次次保存及有效期保存及有效期易保存，約易保存，約1年年不易保存不易保存免疫效果免疫效果較低，體液免疫，較低，體液免疫，維持數(shù)月維持數(shù)月2年年較高，體液及細胞免疫較高，體液及細胞免疫均有，維持均有，維持35年甚至年甚至更長更長死疫苗與活疫苗的區(qū)別死疫苗與活疫苗的區(qū)別653.3.亞單位疫苗：亞單位疫苗： v用化學(xué)方法裂解和提取或通過基因工程產(chǎn)生的細菌保護性抗原組分制成的疫苗。v如:腦膜炎球菌的莢膜多糖，乙肝疫苗等。664.核酸疫苗DNA疫苗基因疫苗 v將能編碼誘發(fā)保護性免疫應(yīng)答的病原體基因片段保護性免疫應(yīng)答的病原體基因片段和能在真核細胞表達的質(zhì)粒質(zhì)粒重組，直接注入宿主體內(nèi)使其表達目的免疫原，

21、進而誘導(dǎo)出保護性抗體和細胞免疫的新型疫苗。 核酸疫苗的出現(xiàn)與發(fā)展是疫苗發(fā)展史上的第三次革命。 67類毒素類毒素： v外毒素經(jīng)外毒素經(jīng)0.30.30.4%0.4%甲醛作用甲醛作用3 34 4周后，毒性消周后，毒性消失仍保持免疫原性的制品。失仍保持免疫原性的制品。v如如白百破三聯(lián)疫苗（白百破三聯(lián)疫苗（DPTDPT）是將白喉類毒素、百是將白喉類毒素、百日咳死菌苗、破傷風(fēng)類毒素混合而成。日咳死菌苗、破傷風(fēng)類毒素混合而成。68 （二）人工被動免疫 v給機體注射含特異性抗體的免疫血清或純化免疫球蛋白抗體，或細胞因子等制劑，使機體即刻獲得特異性免疫力的過程，以治療或緊急預(yù)防感染。v人工被動免疫常用試劑有：6

22、91、抗毒素：、抗毒素： p一般用細菌類毒素或外毒素多次免疫馬后采血，從血清中提取免疫球蛋白精制而成?？苟舅啬苤泻拖鄳?yīng)的外毒素，阻斷其毒性作用。例如用于白喉、破傷風(fēng)等疾病。p 注射前需做皮膚試驗。p 應(yīng)早期、足量注射。 702 2、抗菌血清、抗菌血清3 3、胎盤球蛋白、胎盤球蛋白/ /丙種球蛋白丙種球蛋白 主要用于免疫力低下的人或者球蛋白缺乏患者。主要用于免疫力低下的人或者球蛋白缺乏患者。4 4、免疫細胞和細胞因子、免疫細胞和細胞因子 IFN-IFN-、ILIL、CSFCSF等等71區(qū)別要點區(qū)別要點 人工主動免疫人工主動免疫 人工被動免疫人工被動免疫免疫物質(zhì) 抗原或類毒素 抗體或細胞因子免疫出現(xiàn)時間 慢，24周 快，立即免疫維持時間 長，數(shù)月數(shù)年 短，23周主要用途 預(yù)防 治療或緊急預(yù)防 人工主動免疫和人工被動免疫人工主動免疫和人工被動免疫72（一）病毒感染的預(yù)防人工免疫對于預(yù)防病毒性感染有重要意義。二、病毒感染的防治原則731 1人工主動免疫人工主動免疫傳統(tǒng)疫苗 1）滅活疫苗 2）減毒活疫苗Fig Edward Jenner vac