抗呆合劑對小鼠缺血再灌注腦內(nèi)氨基酸、乙酰膽堿酯酶活力的影響

1、    抗呆合劑對小鼠缺血再灌注腦內(nèi)氨基酸、乙酰膽堿酯酶活力的影響*        摘要：反復(fù)腦缺血再灌注后50min，小鼠腦內(nèi)谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)均升高，-氨基丁酸(GABA)，也隨之升高?？勾艉蟿┐?、小劑量均可抑制Glu、Asp的升高，大劑量還使升高的GABA恢復(fù)至接近正常。造模后50min以及7d，模型組小鼠乙酰膽堿酯酶(AchE)活力降低，抗呆合劑可升高AchE活力。關(guān)鍵詞：腦缺血再灌；抗呆合劑；谷氨酸；乙酰膽堿酯酶；小鼠 Effects of Kan

2、gDaiHeJi on Intracerebral Amino Acid and AchE Activity of Ischemia Reperfusion MouseTang YipengZhao ShuminSun Liping,et al.(Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029)ABSTRACT：After repeated cerebral ischemia and reperfusion,50 minutes later, the mouse intracerebral glutamic acid (Glu) a

3、nd asparaginic acid (Asp) level increased, then the level of gamma aminobutyric acid (GABA) increased as well. Both large and small dose of Kangdaiheji (KDHJ) can inhibit the increase of Glu and Asp. A large dose of KDHJ can lower the GABA near to normal level. In 50 minutes to 7 days after creating

4、 the mouse model of which the acetylcholinesterase (AchE) activity was inhibited, KDHJ improved the AchE activity.KEY WORDS: Cerebral ischemia reperfusion; Kangdaiheji; Glu; AchE; Mouse 我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)1，2，抗呆合劑可以改善小鼠腦缺血后的學(xué)習(xí)記憶障礙，并探討了藥物的部分作用機理， 主要是關(guān)于抗呆合劑對自由基損傷的作用。興奮性氨基酸(EAAs)主要是谷氨酸， 乙酰膽堿(Ach)對腦缺血再灌注損傷以及其后的學(xué)

5、習(xí)記憶障礙有重要作用。在本實驗中， 我們探討了抗呆合劑對腦缺血再灌注小鼠模型腦內(nèi)的興奮/抑制氨基酸的作用， 并以乙酰膽堿酯酶(AchE)活力間接反映腦內(nèi)Ach含量和代謝率， 觀察了抗呆合劑的作用。1材料與方法1.1材料1.1.1動物：昆明小鼠三級雄性2528g，衛(wèi)生部生物制品鑒定所動物中心提供，實驗室條件下自由飲食。1.1.2試劑：谷氨酸(Glu)、-氨基丁酸(GABA)、天冬氨酸(Asp)標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司)；氯化乙酰膽堿(Sigma公司)；三氯化鐵(北京化工廠)；其余試劑均為國產(chǎn)化學(xué)純。1.1.3儀器：835-50氨基酸自動分析儀、低溫離心機(HITACHI日本)；紫外/可見分光光度計

6、UV-120-02(日本 Shimadzu);手術(shù)顯微鏡6212-型、7151型電子溫度計(上海醫(yī)用儀器廠)。1.1.4藥品：抗呆合劑由天麻素等藥物組成，中藥純品由本校魏璐雪教授提供；尼莫地平片劑，山東新華制藥廠生產(chǎn)，批號：9604081。1.2方法1.2.1實驗分組：動物隨機分為假手術(shù)組、模型組，分別以生理鹽水16.6mL/kg灌胃；抗呆合劑大、小劑量組，分別按10、5mg/kg灌胃；尼莫地平組，按50mg/kg灌胃。各組給藥均為1次/d，從術(shù)前3d開始至取材日止。1.2.2腦缺血再灌注模型制備：參照文獻方法加以改進3，在水合氯醛350mg/kg麻醉下，頸正中切口解剖鏡下分離雙側(cè)頸總動脈，以

7、無損微動脈夾夾閉15min，再通15min，再次夾閉15min，第1次缺血同時于鼠尾尖端剪斷1cm放血0.3mL造成低血壓。整個缺血過程中小鼠置于恒溫箱內(nèi)，保持肛溫于36 左右。術(shù)后肌注青霉素0.2萬U，腹腔注射生理鹽水1mL。假手術(shù)組操作同模型組，但不夾閉動脈，不放血。1.2.3取材方法：小鼠斷頭處死，迅速于冰盤上分離腦組織，取視交叉前2mm，后4mm之間區(qū)域內(nèi)組織待用。1.2.4觀察項目：(1) Glu、GABA、Asp 測定：各組小鼠于手術(shù)后50min取材，加4%冷磺酸水楊酸，4離心20000r/min，10min。取上清100L， 氨基酸自動分析儀檢測4。分析條件：分析柱26mm

8、15;150mm；緩沖液流速0.225mL/min。(2)乙酰膽堿酯酶活力測定：取材時間為造模后50min及7d。樣品以冷生理鹽水制成20%勻漿，4500r/min，4離心5min，取上清液，參照文獻5測定。以1mL上清液在37與乙酰膽堿底物作用20min分解1mol/L乙酰膽堿為1個膽堿酯酶活力單位。1.2.5數(shù)據(jù)處理：實驗數(shù)據(jù)用<"xx1 (881 bytes)" src="/med/cano/201003/20100325162308921" 12 14>±s表示，各組間進行t檢驗。2結(jié)果2.1腦組織內(nèi)Glu、GABA、Asp

9、含量的變化腦缺血再灌注50min，模型組小鼠腦內(nèi)Glu、Asp含量明顯高于假手術(shù)組(P<0.001); GABA含量也升高(P<0.01)?？勾艉蟿┐?、小劑量均可抑制腦缺血再灌造成的Glu、Asp升高；同時抗呆合劑大劑量也使升高的GABA降低接近于正常，而抗呆合劑小劑量則對GABA含量影響不明顯。尼莫地平僅可降低Asp含量(P<0.05)，見表1。表1腦缺血再灌50min腦內(nèi)Glu、GABA、Asp含量的變化 (g/g；<"xx1 (881 bytes)" src="/med/cano/201003/20100325162308921&qu

10、ot; 12 14>±s)組別nGluGABAAsp假手術(shù)組10971.47±111.29*424.08±106.85*289.12±50.17*模型組121499.33±201.49513.72±42.68418.55±33.99中藥大劑量組121227.80±42.62*431.86±71.62*341.25±24.85*中藥小劑量組81269.59±46.79*466.52±111.38339.56±51.86*尼莫地平組91420.45±20

11、4.89452.02±86.54377.51±37.21*     注：與模型組比較*P<0.05 *P<0.01 *P<0.001；與假手術(shù)組比較P<0.05P<0.01P<0.0012.2AchE活力的變化造模50min和7d后，腦組織內(nèi)AchE活力變化見表2。表2腦缺血再灌50min和7d腦內(nèi)AChE活力的變化(U/g；<"xx1 (881 bytes)" src="/med/cano/201003/20100325162308921" 12 14

12、>±s)組別再灌50 min再灌7 dnAchE活力nAchE活力假手術(shù)組819.73±1.18*1015.89±2.24*模型組916.89±3.18813.42±2.70中藥大劑量組921.61±2.86*916.68±2.84*中藥小劑量組523.78±1.71*917.26±2.69*尼莫地平組822.14±2.24*916.47±1.65*     注：與模型組比較*P<0.05*P<0.01*P<0.001；與

13、假手術(shù)組比較 P<0.053討論3.1抗呆合劑的抗興奮毒性作用腦缺血后腦組織中氨基酸類遞質(zhì)代謝異常，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷及神經(jīng)功能損害，其中最重要的公認(rèn)為Glu的興奮毒性作用。Glu的興奮毒性機理主要有三種：一是經(jīng)由AMPA受體和KA受體過度興奮所介導(dǎo)的神經(jīng)細胞急性滲透性腫脹，在數(shù)小時內(nèi)發(fā)生，以Na內(nèi)流，隨即Cl-和H2O被動內(nèi)流為特征。二是主要經(jīng)NMDA受體過度興奮介導(dǎo)的神經(jīng)細胞遲發(fā)性操作，可推遲至數(shù)日發(fā)生，主要與Ca2+超載有關(guān)。這種遲發(fā)性損傷是Glu興奮毒性損傷的主要途徑，與海馬區(qū)細胞DND密切相關(guān)6。三是Glu超常釋放造成了主要是海馬區(qū)域內(nèi)病理性的LTP，并有可能造成了以后的信息傳遞障

14、礙形成學(xué)習(xí)記憶缺陷7。Glu和Asp是腦內(nèi)含量最高、毒性最強的氨基酸，而NMDA受體在大腦皮層和海馬、丘腦部位密度較高，這些區(qū)域恰是缺血易損區(qū)，因而Glu、Asp在缺血損傷中具有極其重要的作用。本模型的研究表明，反復(fù)腦缺血再灌后50min,模型組腦內(nèi)Glu、Asp水平仍顯著高于對照組，應(yīng)用抗呆合劑進行防護，可明顯減低腦內(nèi)Glu、Asp的含量，從而對其所介導(dǎo)的興奮毒性起到了抑制作用?？勾艉蟿古d奮毒性的機理可能有如下幾點：我們所選擇的測定Glu含量時間點是再灌注50min，此時Glu正處于恢復(fù)過程中，抗呆合劑的作用之一可能是促進Glu的重攝取，減少組織內(nèi)Glu含量和作用時間；抗呆合劑的作用也有

15、可能是減低了Glu釋放的峰值量，從而在再灌50min時，Glu已經(jīng)恢復(fù)至接近正常水平；直接對抗Glu的興奮毒性，我室在培養(yǎng)神經(jīng)細胞模型中已經(jīng)證實8，抗呆合劑的主要成分之一天麻毒，可明顯減輕谷氨酸引起的神經(jīng)元損害，保持神經(jīng)細胞膜的完整性和形態(tài)結(jié)構(gòu)。總之，抗呆合劑缺血保護作用與Glu有直接的關(guān)系。至于藥物作用的具體環(huán)節(jié)如：釋放、重攝取、受體環(huán)節(jié)，尚待進一步研究。GABA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，其作用需要經(jīng)過GABA受體方式。缺血時GABA腦內(nèi)釋放量也升高。Westerhberg研究表明，GABA受體的缺血耐受性低于谷氨酸受體，因而腦缺血到一定程度時，GABA受體功能受損，增加的GAB

16、A并不能對抗興奮性氨基酸引起的神經(jīng)功能損害9。本實驗結(jié)果也說明，缺血再灌50min時，GABA含量仍高于對照組，而抗呆合劑大劑量組的GABA含量低于模型組，與對照組持平，說明抗呆合劑的應(yīng)用使得造模后腦內(nèi)氨基酸的變化情況與對照組相一致，從而維持興奮/抑制氨基酸的相對平衡，穩(wěn)定了腦組織內(nèi)的生理狀態(tài)。尼莫地平是二氫吡啶類鈣通道阻滯劑，有研究表明它可以改善缺血區(qū)腦血流，抑制Ca2+內(nèi)流，從而保護缺血腦組織10，但尚未見到對Glu作用的報道。我們的實驗表明，尼莫地平對Glu釋放的增加無抑制作用，它的保護缺血損傷的作用與Glu無關(guān)，而主要在于抑制Glu介導(dǎo)的Ca2+超載。3.2抗呆合劑調(diào)節(jié)腦內(nèi)AchE活性

17、作用Ach是腦內(nèi)的經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)，與認(rèn)知、學(xué)習(xí)、記憶等大腦高級神經(jīng)功能有關(guān)。學(xué)習(xí)記憶任務(wù)的完成伴隨著腦內(nèi)Ach的變化11。AchE是Ach的分解酶，它的活力變化可間接反映腦內(nèi)Ach含量和代謝情況。對于缺血后學(xué)習(xí)記憶障礙與Ach含量的關(guān)系，目前尚未有統(tǒng)一的認(rèn)識，各家說法不一12。據(jù)文獻資料，腦內(nèi)功能狀態(tài)不同，Ach和AchE變化也不一致，即使在正常個體也是如此11；本課題顯示，缺血再灌后50min及7d，腦內(nèi)AchE活力降低，而抗呆合劑和尼莫地平均可對抗這種變化，AchE活力接近于對照組。顯示了腦缺血伴隨著AchE活力的變化，抗呆合劑通過調(diào)節(jié)腦內(nèi)AchE的活力影響了腦內(nèi)的Ach，從而對缺血后的腦功

18、能恢復(fù)產(chǎn)生影響，改善學(xué)習(xí)記憶障礙。*國家中醫(yī)藥管理局資助課題(No.95B111)作者簡介：唐一鵬，男，58歲，研究員，醫(yī)學(xué)博士生導(dǎo)師作者單位：北京中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所北京100029參考文獻1趙樹民，唐一鵬，洪慶濤，等.抗呆合劑對小鼠腦血管性學(xué)習(xí)記憶障礙的保護作用.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，1998，21(2)：41422唐一鵬，趙樹民，孫承琳，等.抗呆合劑對小鼠腦缺血再灌注模型腦內(nèi)脂質(zhì)過氧化物、SOD活力及海馬CA1區(qū)細胞形態(tài)的影響.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，1998，21(6)：23263李巍，嚴(yán)徽瑾，趙慧敏.腦缺血再灌對小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響及藥物保護.中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，1995，10(2)：67694徐叔云，卞如濂，陳修.藥理學(xué)實驗方法.第2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，1992.4334355衛(wèi)生部醫(yī)政司.全國臨床檢驗操作規(guī)程.南京：東南大學(xué)出版社，1992.2002026李麟仙.鈣離子、興奮性氨基酸與缺血性腦損傷.生理科學(xué)進展,1992.23：1311367Edwards FA. Anatomy and electrophysiology of fast central syn