HBVcccDNA熒光定量PCR檢測方法的建立及初步應用-

1、乙肝病毒感染影響了全球約三億五千萬人口,而且絕大多數(shù)為慢性感染,其中約5%最終發(fā)展成肝硬化或肝癌,每年約有一百萬人死于HBV 感染引起的各種終末期肝病1。目前認為,HBV 復制經(jīng)由一個特殊的中間體形式介導,即共價閉合環(huán)狀雙鏈DNA(Covalently closed circularDNA ,cccDNA 。HBV cccDNA 熒光定量PCR 檢測方法的建立及初步應用單幼蘭,王箭,尹一兵(重慶醫(yī)科大學檢驗系,重慶400016【摘要】目的:評估一個新設計的HBV cccDNA 熒光定量PCR 檢測方法。方法:以肝穿組織為檢測標本,采用Lightcycle T M 探針,通過一對特殊引物,使HB

2、VcccDNA 可以擴增而病毒基因組不能擴增;同時利用一種依賴于ATP 的特異性DNase 提高反應的特異性,以此實現(xiàn)對cccDNA 的檢測。結果:成功建立了HBV cccDNA 熒光定量PCR 的檢測方法,線性范圍為2.5×1012.69×109拷貝/ml 。對5個病例的肝穿樣本進行分析,其中3例為乙肝感染患者,并均接受抗病毒治療達1年,另2例為乙肝陰性患者。檢測結果如下:12例乙肝陰性患者的肝組織檢測結果cccDNA 及tDNA 皆為陰性。2接受拉米夫定治療1年的病人tDNA 為7.10×103拷貝/ml ,cccDNA 為2.64×103拷貝/ml

3、 ;接受恩替卡韋治療1年的病人tDNA 為1.00×105拷貝/ml ,cc-cDNA 為4.04×103拷貝/ml ;第3例病人接受拉米夫定治療前tDNA 為6.62×103拷貝/ml ,cccDNA 為3.03×102拷貝/ml ,拉米夫定治療1年后tDNA 為5.19×103拷貝/ml ,cccDNA 為1.51×102拷貝/ml 。結論:本研究結果顯示,所建立的HBVcccDNA 熒光定量PCR 方法具有良好的線性范圍,靈敏度、特異性及準確性均達到預期目標,而且檢測所需樣本量少,只需約1mg 肝穿組織。可作為臨床監(jiān)測抗病毒治療

4、效果的有效手段和開展HBV 復制調(diào)控研究的重要工具?！娟P鍵詞】乙型肝炎病毒;熒光定量;PCR ;檢測方法【中國圖書分類法分類號】R373.2+1【文獻標識碼】A【收稿日期】2006-10-13Establishment and application of a fluorescent quantitative pcr method forcccDNA of HBVSHAN Youlan ,et al(Department of Laboratory Medicine ,Chongqing Medical University 【Abstract 】Objective :To evaluated

5、 a new fluorescent quantitative PCR method for HBV cccDNA.Methods :The specimens wereobtained by hepatic puncturation.We designed a pair of specific primers to amplify not HBV genome but cccDNA as a method to detect it ,using the ATP dependent Dnase to increase the specificity greatly.Results :We ha

6、ve established a new fluorescent quantitative PCR method for HBV cccDNA successfully ,the linear range is from 2.5×101to 2.69×109copies per milliliter.The three of five patients were shown HBV positive and the other two were negative using the new method to analyze hepatic puncturation spe

7、cimens.The HBV positive patients have all received one year long anti-virus therapy.1the two HBV negative patients were both cccDNA negative and tDNA negative.2the patient who has received one year long Lamivudine therapy had a DNA concentration of 7.10×103copies tDNA per milliliter serum and 2

8、.64×103copies cccDNA per milliliter serum.The pa-tient who has received one year long entecavir therapy had a DNA concentration of 1.0×105copies tDNA per milliliter serum and 4.04×103copies cccDNA per milliliter serum in his blood.tDNA concentration in the third patient was 6.62×

9、103copies per milliliter serum ,3.3×102copies cccDNA per milliliter serum before anti-virus therapy ,but after one year long Lamivudine ther-apy ,the tDNA and cccDNA concentration reduced to 5.19×103copies and 1.51×102copies per milliliter serum respectively.Conclusion :This study sho

10、wn that the fluorescent quantitative PCR had a good linear range ,high sensitivity ,specificity and ac-curacy ,so it needs less specimen ,for example 100milligram hepatic puncturation specimen is enough.Although further study is needed ,the fluorescent quantitative PCR will definitely become an effi

11、cient tool for anti-virus therapeutic effect monitoring be-cause of its high sensitivity ,specificity ,efficiency and accuracy.【Key Words 】HBV ;Fluorescentquantitative ;PCR ;Detective method作者介紹:單幼蘭(1963-,女,主管技師,碩士研究生,主要研究方向:臨床檢驗。文章編號:0253-3626(200706-0601-05論著圖1乙肝病毒基因結構cccDNA庫的存在被認為是乙肝抗病毒治療過程中產(chǎn)生藥物耐

12、受和停藥反跳的重要原因。大量研究表明,HBV慢性感染患者肝細胞內(nèi)的cccDNA水平是決定抗病毒治療效果的一個重要參數(shù)。發(fā)展一種快速、靈敏、高效的檢測肝細胞內(nèi)HBVcccDNA的實驗方法,已成為臨床藥物試驗研究及病理診斷的迫切需要。近期的諸多研究表明,利用實時定量PCR技術能夠檢測并定量病毒顆粒中的HBV DNA,但絕大多數(shù)的實驗設計僅限于檢測病人外周血中存在的RC DNA,只有極少檢測肝組織提取物中HBV復制中間體的報道28。本研究旨在建立一種檢測肝穿組織中低復制水平的HBVcccDNA的熒光定量PCR方法。其特點是使用一對跨越負鏈缺口區(qū)的特殊引物,將cccD-NA與其它復制模板區(qū)分開來。照此

13、設計,在擴增中,以RCDNA為模板的DNA合成將自動停止在每一條模板缺口處的5末端,而cccDNA因沒有缺口,合成不會停止。然而由于部分延伸產(chǎn)物存在互補區(qū)域,通過互相雜交可形成假陽性,因此通過采用一種依賴于ATP的脫氧核糖核酸內(nèi)切酶處理可以消除此假陽性現(xiàn)象,同時,RCDNA由于包含一個對上述脫氧核糖核酸酶敏感的單鏈區(qū)域,采用該酶消化后的PCR擴增,其陽性信號理論上只應產(chǎn)生于HBVcccDNA9,10。這一處理極大地降低了產(chǎn)生假陽性的機率,并且提高了HBVcccDNA定量的準確性和特異性。1材料與方法1.1病例及臨床樣本兩例乙肝陰性肝穿組織樣本來自2005年1月于重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院接受手術

14、的患者。3例慢性乙肝肝穿組織樣本來自2003年8月2004年8月于重慶醫(yī)科大學附屬二院傳染科臨床藥理基地參加“恩替卡韋與拉米夫定對照用于治療中國成人慢性乙肝安全性和抗病毒活性的期臨床試驗”的自愿者。特異性實驗中對照血清標本采自重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院傳染科臨床實驗室,標本經(jīng)HBV DNA 熒光定量PCR檢測為陽性(拷貝數(shù)均大于107。1.2實驗材料1.2.1主要試劑質粒和菌株:重組質粒pCDNA-HBV1.3,帶有HBV完整基因組,由美國芝加哥大學分子腫瘤中心何通川博士惠贈。宿主菌DH5由重慶醫(yī)科大學病毒性肝炎研究所提供。熒光探針:由何通川博士委托美國PROLIGO公司合成。序列如下:(1cc

15、cDNA探針HBV_1562(上游探針或供體探針5-TTCTCATCTGCCGGACCGTG_fluorescein-3HBV_1584(下游探針或受體探針5-LC_Red640_CACTTCGCTTCACCTCTGCACGT_phosp hote-3(2tDNA探針HBV_377(上游探針或供體探針5-GGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCA_florescein-3HBV_403(下游探針或受體探針5-LC_Red640_TTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCC_pho sphote-3引物:由北京三博遠志生物技術有限責任公司合成。使用M EGALGN程序比較乙肝病毒AF

16、6種基因型的同源性,于保守序列區(qū)段,使用Oligo軟件Version5.0設計引物。序列如下:(1cccDNA引物HBV_1523(上游引物5-GGGGCGCACCTCTCTTTA-3HBV_1874(下游引物5-AGGCACAGCTTGGAGGC-3(2tDNA引物HBV_305(上游引物5-GCCAAAATTCGCAGTCC-3HBV_663(下游引物5-AAACTGAGCCAGGAGAAA-3Plasmid_safeTM ATP_dependent DNase購自EPI-CENTRE公司。肝穿組織DNA提取試劑盒購自QIAGEN公司。酶純化試劑盒購自QIAGEN公司。1.3實驗方法肝組織

17、中DNA的提取按照試劑盒說明書操作。酶處理及純化按照試劑盒說明書操作。熒光定量PCR在獨立密閉的毛細管中,用兩種引物和探針擴增每一個樣品。經(jīng)過反復優(yōu)化擴增條件, 得到擴增循環(huán)條件如下:1.預變性955min ,2.變性9525s ,退 火5430s ,延伸7225s ,共40個循環(huán)。擴增反應液配方為:引物1(25mol/l 1.2l ,引物2(25mol/l 0.4l ,探針1(5mol/l 0.4l ,探針2(5mol/l 0.4l ,Taq (2.5U 0.5l ,M gCl 2(25mmol/l 1.0l ,10×PCR 緩沖液2.0l ,dNTP(2.5m mol/l 2.0

18、l ,H 2O5.5l ,模板5.0l 。數(shù)據(jù)在退火期的“single ”模式獲得,選擇F 2/F 1通道,以“fit point ”描點法分析熒光曲線,樣本的熒光信號高于基線被認為是陽性。2結果2.1方法學研究2.1.1引物設計目前已知,HBV 共分AH 8種基因型。采用MEGALGN 軟件分析發(fā)現(xiàn),AF 6種基因型中分別存在兩個高度保守的區(qū)段,可用于引物和探針的設計9。其中305/663區(qū)引物可擴增幾乎所有的HBV 復制中間體,用于HBV 總DNA 檢測;1523/1874區(qū)引物,由于橫跨HBV 的缺口區(qū),理論上只能擴增不含缺口的cccDNA 而無法擴增含缺口的RcDNA 等復制中間體。2

19、.1.2模板制備HBVcccDNA 標準模板制備pCDNA-HBV1.3為含HBV 完整基因組的重組質粒,大小為9.4ku ,由于提取質粒主要以共價閉合環(huán)狀雙鏈DNA 形式存在,其中HBV 基因組類似于肝組織中HBVcccDNA ,因此,pCDNA-HBV1.3可作為方法學研究中替代HBVcccDNA 的標準模板。血清/肝組織中HBVDNA 制備分別采用Roche 公司和Qiagen 公司產(chǎn)品提取血清/肝組織中HBVDNA 。與傳統(tǒng)的酚/氯仿方法比較,無論是回收率或重復性均有明顯改善。其肝組織用量減少至1mg ,提取時間由7h 減少至3h 以內(nèi),同時兼顧了大規(guī)模篩查及熒光定量PCR 對樣本的要

20、求。2.1.3熒光定量PCR 方法的建立及標準曲線的繪制以梯度稀釋的質粒pCDNA-HBV1.3為起始模板,分別用cccDNA 引物/探針和tDNA 引物/探針進行熒光定量PCR 擴增,通過優(yōu)化反應體系,得到線性范圍為2.5×1012.69×109拷貝/ml 。采用cccDNA 引物、探針擴增建立的標準曲線(見圖2。圖2為擴增曲線圖,下圖為標準曲線回歸圖,回歸曲線相關系數(shù)r=-1.00。采用tDNA 引物、探針擴增建立的標準曲線與cccDNA 引物、探針擴增建立的標準曲線基本相同,本文不再贅列。2.1.4檢測靈敏度在標準曲線制作過程中,通過測定Ct 值可直接反應檢測的靈敏度

21、。在熒光定量PCR 方法中,模板的起始拷貝數(shù)越低,Ct 值越大。當Ct 值大于38時,定量結果被認為是不確切的。由圖3可見,低至2.5×101拷貝/ml 的樣本經(jīng)40次循環(huán)擴增后,瓊脂糖凝膠電泳中仍可見明顯的擴增條帶。即檢測限為 2.5×101拷貝/ml 。2.1.5檢測特異性以四份HBVDNA 陽性血清標本中提取的DNA 為實驗對象,編號分別為364,365,366,367。采用常規(guī)熒光定量PCR 檢測其RCDNA 含量,定量結果分別為:1.36×108(拷貝/ml ,4.24×108(拷貝/ml ,2.86×108(拷貝/ml ,2.09&

22、#215;108(拷貝/ml 。采用Plasmid_safeTM ATP_dependent DNase處理上述樣品,然后以cccDNA 引物進行擴增,與未處理組比較,處理組全部未擴增,與預期結果相符,圖2cccDNA 引物擴增的標準曲線From M to 10reprent marker ,2.69×109copies/ml ,2.69×108copies/ml ,2.69×107copies/ml ,2.69×106copies/ml ,2.69×105copies/ml ,2.69×104copies/ml ,2.69×

23、;103copies/ml ,2.69×102copies/ml ,5×101copies/ml ,2.5×101copies /ml ,respectively圖3cccDNA標準曲線擴增產(chǎn)物電泳圖譜表明血清中不存在cccDNA;未處理組雖有少量擴增,但Ct值較高,與102質粒擴增的Ct值相當,估計為非特異性擴增所致的假陽性,此類擴增經(jīng)酶處理后消失,也進一步證實上述推理的可靠性(結果未詳列。采用tDNA引物對上述樣品進行擴增時,未處理組Ct值與107質粒擴增的Ct值相當,酶處理組全部未擴增,表明血清中HBVRCDNA對酶處理極為敏感。為進一步驗證酶處理對于提高H

24、BVcccDNA 檢出特異性的作用,在上述樣品中加入2.69×102拷貝/ml的質粒DNA(cccDNA后再進行酶處理,結果表明,當采用cccDNA引物進行擴增時,處理組與未處理組Ct值基本相當,說明ATP_dependent DNase 只選擇性降解RCDNA,而對cccDNA沒有作用;對照組(2.69×102拷貝/ml的質粒酶處理前后Ct值變化不明顯也進一步支持上述結論(結果未詳列。上述結果還進一步提示,若RCDNA與cccDNA 同時存在,即使cccDNA/RCDNA比例約為1: 100000時,采用ATP_dependent DNase酶處理,也能有效排除RCDNA

25、等的干擾,準確、靈敏、特異地檢出cccDNA。2.2病例研究在建立了分析方法的標準曲線、分析了方法的靈敏度與特異性之后,開始對5個病例的肝組織樣本進行HBVcccDNA及tDNA檢測。拉米夫定(Lamivudine,LAM為一口服核苷類藥物,全稱2,3-雙脫氧-3-硫胞嘧啶核苷。LAM 抑制HBV復制的作用機理,系藥物在細胞內(nèi)經(jīng)磷酸化后,與脫氧胞嘧啶核苷(dCTP競爭,進入合成中的DNA鏈,使其不能繼續(xù)延伸而終止復制。這一反應不僅存在于合成負股HBVDNA的逆轉錄過程中,同樣也可在合成正股HBVDNA的轉錄過程中實現(xiàn)。恩替卡韋的作用機理與LAM類似。本研究共檢測了3例HBV陽性肝穿樣本的HBV

26、cccDNA。在抗病毒治療1年后其HBVcccDNA分別為:20601, 2.6×103拷貝/ml;20278,4.0×103拷貝/ml;20100治前,3.0×102拷貝/ml,治后1.5×102拷貝/ml。病例20601與20100抗病毒治療1年后,血清HBVDNA 降至檢測限以下,但肝組織內(nèi)HBVcccDNA不受影響。病例20100治療前后的HBVcccDNA含量沒有明顯變化,其在血清HBV DNA降至低于檢測限后繼續(xù)服藥半年,停藥2個月后出現(xiàn)反跳,血清HB-VDNA升至1.5×108;病例20278治療52周后血清HBVDNA為4.4&

27、#215;103拷貝/ml,繼續(xù)服用恩替卡韋12周,血清HBVDNA仍為1.0×104拷貝/ml。由此可見,抗病毒治療過程中的藥物耐受及停藥反跳現(xiàn)象確與肝細胞內(nèi)HBVcccDNA的存在息息相關。3討論如前所述,本研究旨在建立一種肝組織內(nèi)HB-VcccDNA的定量檢測方法。cccDNA為HBV復制的起始分子,也是HBV賴以生存的關鍵分子。檢測其表達水平,無論對抗病毒療效的評價,還是對病毒復制規(guī)律的認識,無疑都至關重要。但長期以來,由于受以下因素的制約,HBVcccDNA檢測進展緩慢。首先cccDNA主要存在于肝細胞中,標本取材困難,加上含量甚微,普通檢測方法難以奏效,既往主要采用Sou

28、thern雜交進行檢測,肝組織標本用量較大且操作復雜,無法作為臨床藥物監(jiān)測的工具;其次, HBV在復制過程中,存在眾多的復制中間體,包括cccDNA、RCDNA、ssDNA、dsDNA等,常規(guī)PCR方法很難從中選擇性擴增cccDNA。針對上述存在的問題,我們從以下兩方面提出可能的解決措施。其一,采用近年發(fā)展起來的基于雜交探針的熒光定量PCR方法解決檢測靈敏度問題;其二,采用特異性引物設計和核酸酶處理提高cccDNA檢出的特異性。通過本項目研究,我們成功建立了一種高效特異、簡便易行的檢測乙肝患者肝組織內(nèi)HBVcccD-NA的定量分析方法,尤其適用于臨床大規(guī)模評價抗病毒療效研究。迄今為止,見于資料

29、報道的HBVcccDNA實時熒光定量檢測方法分別由He et al10(2002年和Jnu-Bin et al(2003年建立11。兩者均采用Taqman技術,線性范圍分別為1×1021×107拷貝/ml;5×1015×105拷貝/ml。PCR反應體系的總體積分別為20l及50l,檢測所需的肝組織量,He,et al未報道,Jnu-Bin,et al.為10mg。與使用LighcyclerTM探針的本研究所建立的方法相比,檢測下限低24倍,檢測上限低約2005000倍。而且本研究的擴增反應體積為20l,檢測所需肝組織量僅為1mg。本研究尤為重要的是采用了

30、特殊的酶切技術。這一技術的應用,徹底解決了由于部分延伸產(chǎn)物互相雜交而產(chǎn)生假陽性的問題。從所進行的特異性驗參考文獻1廖二元,伍賢平,黃干,等.用三次回歸模型建立女性多骨骼部位骨密度參考數(shù)據(jù)庫及其應用評價J.中華內(nèi)分泌代謝雜志,2003; 19:282-286.2Phillipov G,Phillips PJ.Skel,et al.site bone mineral density heterogeneity in women and menJ.Osteoporos Int,2001;12:362-365.3陳建庭,譚小云,金大地,等.廣州地區(qū)1403例成年女性骨密度測定分析J.中國骨質疏松雜志,

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33、提示cccDNA不受酶切影響,而RCDNA被特異地除去;當102拷貝/ml質粒與108拷貝/ml血清樣本混合在一起時,可以看到:未酶切時得到的擴增Ct 值與單獨的血清樣本基本相同,而酶切后得到的結果則為質粒擴增Ct值。這一實驗結果清楚地證明運用我們所建立的酶切技術及PCR定量擴增條件可以高效地將RcDNA與cccDNA區(qū)分開來。為了更好地評價實驗的分析特異性,我們?nèi)∫唤M四個血清樣本進行酶切前后對照實驗,正如所期望的那樣,四個高拷貝數(shù)的陽性血清樣本未酶切時用cccDNA 引物、探針擴增有假陽性存在,其Ct值與質粒102拷貝/ml接近,而酶切后四例樣本均為陰性。由于方法具有的高靈敏度,使得病例研究

34、中的肝穿組織需要量小到1mg,這是目前為止最小的肝穿組織檢測量。由于肝穿組織較為難于得到,本方法為臨床肝穿組織HBVcccDNA檢測提供了更現(xiàn)實的可行性。綜上所述,本研究建立了一種高靈敏度、高特異性、快速、簡便、可靠的檢測肝穿組織中HBVcc-cDNA的熒光定量PCR方法,此方法對于監(jiān)測抗乙肝病毒藥物療效、指導臨床用藥以及探討乙肝病毒復制調(diào)控規(guī)律均具有十分重要的作用。參考文獻1Seeger C,Mason WS.Hepatitis B virus biologyJ.Microbiol.Mol.Biol.Rev,2000;64:51-68.2Brechtbuehl K,Whalley SA,Du

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