蛋白酶活力測定方法

1、中華人民共和國專業(yè)標準蛋白酶活力測定法 SB/T 10317-1999Measurement of proteinase activity本方法適用于釀造醬油時在制品菌種、成曲的蛋白酶活力測定。1 福林法1.1 試劑及溶液: 以下試劑都為分析純1.1.1 福林試劑(Folin試劑:于2000mL磨口回流裝置內(nèi),加入鎢酸鈉(Na2WO4·2H2O 100g,鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O25g,蒸餾水700mL,85%磷酸50mL,濃鹽酸100mL,文火回流10h。取去冷凝器,加入硫酸鋰(Li2SO450g,蒸餾水50mL,混勻,加入幾滴液體溴,再煮沸15min,以驅(qū)逐殘溴

2、及除去顏色,溶液應(yīng)呈黃色而非綠色。若溶液仍有綠色,需要再加幾滴溴液,再煮沸除去之。冷卻后,定容至1000mL,用細菌漏斗(No45過濾,置于棕色瓶中保存。此溶液使用時加2倍蒸餾水稀釋。即成已稀釋的福林試劑。1.1.2 0.4mol碳酸鈉溶液: 稱取無水碳酸鈉(Na2CO342.4g,定容至1000mL。1.1.3 0.4mol三氯乙酸(T C A溶液: 稱取三氯乙酸(CCL3COOH65.4g,定容至1000mL。1.1.4 pH7.2磷酸鹽緩沖液:稱取磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O31.2g,定容至1000mL,即成0.2mol溶液(A液。稱取磷酸氫二鈉(Na2HPO4

3、83;12H2O71.63g,定容至1000mL,即成0.2mol溶液(B液。取A 液28mL 和B 液72mL,再用蒸餾水稀釋1倍,即成0.1mol pH7.2的磷酸鹽緩沖液。1.1.5 2%酪蛋白溶液:準確稱取干酪素2g,稱準至0.002g,加入0.1N氫氧化鈉10mL,在水浴中加熱使溶解(必要時用小火加熱煮沸,然后用pH7.2磷酸鹽緩沖液定容至100mL即成。配制后應(yīng)及時使用或放入冰箱內(nèi)保存,否則極易繁殖細菌,引起變質(zhì)。1.1.6 100g/mL酪氨酸溶液:精確稱取在105烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g,逐步加入6mL 1N鹽酸使溶解,用0.2N鹽酸定容至100mL,其濃度為100

4、0g/mL,再吸取此液10mL,以0.2N鹽酸定容至100mL,即配成100g/mL的酪氨酸溶液。此溶液配成后也應(yīng)及時使用或放入冰箱內(nèi)保存,以免繁殖細菌而變質(zhì)。1.2 儀器a. 分析天平: 感量0.1mg;b. 581-G型光電比色計或72型分光光度計;c. 水浴鍋;d. 1、2、5、10mL移液管等。1.3 操作1.3.1 標準曲線的繪制1.3.1.1 按下表配制各種不同濃度的酪氨酸溶液(表1。表 1 配制各種不同濃度的酪氨酸溶液管號試劑 1 2 3 4 5 6蒸餾水,mL 10 8 6 4 2 0100g/mL酪氨酸,mL 0 2 4 6 8 10酪氨酸最終濃度,g/ml 0 20 40

5、60 80 1001.3.1.2 測定步驟:取6支試管編號按表1分別吸取不同濃度酪氨酸1mL,各加入0.4mol 碳酸鈉5mL,再各加入已稀釋的福林試劑1mL。搖勻置于水浴鍋中。40保溫發(fā)色20min 在581-G型光電比色計上分別測定光密度(OD (濾色片用65*#或用72型分光光度計進行測定(波長660nm。一般測三次,取平均值。將16號管所測得的光密度(OD減去1號管( 蒸餾水空白試驗所測得的光密度為凈OD數(shù)。為了清楚起見。再列出表格如下(表2。表 2管號試劑 1 2 3 4 5 6按表1制備的不同濃度酪氨酸,mL 1 1 1 1 1 10.4mol/L Na2CO3,mL 5 5 5

6、5 5 5福林試劑,mL 1 1 1 1 1 1 1 2 O D值 3 平均凈O D值0 以凈O D值為橫坐標,酪氨酸的濃度為縱坐標,繪制成標準曲線(或可求出每度OD所相當?shù)睦野彼崃縆。1.3.2 樣品稀釋液的制備。1.3.2.1 測定酶制劑: 稱取酶粉0.100g,加入pH7.2磷酸鹽緩沖液定容至100mL,吸取此液5mL,再用緩沖液稀釋至25mL,即成5000倍的酶粉稀釋液。1.3.2.2 測定成曲酶: 稱取充分研細的成曲5g,加水至100mL,在40水浴內(nèi)間斷攪拌1h,過濾,濾液用0.1mol pH 7.2磷酸鹽緩沖液稀釋到一定倍數(shù)(估計酶活力而定。1.3.3 樣品測定: 取15

7、5;100mm試管3支,編號1、2、3(做2只也可,每管內(nèi)加入樣品稀釋液1mL,置于40水浴中預(yù)熱2min,再各加入經(jīng)同樣預(yù)熱的酪蛋白1mL,精確保溫10min,時間到后,立即再各加入0.4mol三氯乙酸2mL,以終止反應(yīng),繼續(xù)置于水浴中保溫20min,使殘余蛋白質(zhì)沉淀后離心或過濾,然后另取15×150mm試管3支,編號1、2、3,每管內(nèi)加入濾液1mL,再加0.4mol碳酸鈉5mL,已稀釋的福林試劑1mL,搖勻,40保溫發(fā)色20min后進行光密度(OD測定?？瞻自囼炓踩≡嚬?支,編號(1、(2、(3,測定方法同上,唯在加酪蛋白之前先加0.4mol三氯乙酸2mL,使酶失活,再加入酪蛋白

8、。為了清楚起見,分別列出表格于下(見表3及表4。表 3管號試劑管號試劑1 2 3 (1 (2 (3預(yù)熱酶液, mL 1 1 1 預(yù)熱酶液, mL 1 1 1預(yù)熱2%酪蛋白, mL 1 1 1 0.4mol三氯乙酸, mL 2 2 2作用10min (精確計時 作用10min (精確計時0.4mol三氯乙酸, mL 2 2 2 預(yù)熱2%酪蛋白, mL 1 1 1表 4管號試劑1 2 3 (1 (2 (3濾液, mL 1 1 1 1 1 10.4mol Na2CO3,mL 5 5 5 5 5 5福林試劑, mL 1 1 1 1 1 1O D值平均O D值凈O D值0樣品的平均光密度(O D一空白的

9、平均光密度(OD=凈OD值。1.4 計算在40下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1g酪氨酸,定義為1個蛋白酶活力單位。A 1樣品蛋白酶活力單位(干基=×4×N× (110 1 - W式中:A由樣品測得OD值,查標準曲線得相當?shù)睦野彼嵛⒖藬?shù)(或OD值×K;44毫升反應(yīng)液取出1 mL測定(即4倍;N酶液稀釋的倍數(shù);10反應(yīng)10min;W樣品水分百分含量。1.5 注意事項以上介紹的方法用于測定中性蛋白酶(pH7.2。若要測定酸性蛋白酶或堿性蛋白酶,則把配制酪蛋白溶液和稀釋酶液用的pH緩沖液換成相應(yīng)pH緩沖液即可。現(xiàn)把幾種常用pH緩沖液配方提供如下:1.5.1 pH7.5磷

10、酸鹽緩沖液 (0.02mol/L稱取磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O6.02g和磷酸二氫鈉 (NaH2PO4·2H2O0.5g以蒸餾水溶解定容至1000mL。1.5.2 pH2.5乳酸-乳酸鈉緩沖液 (0.05molA 液: 稱取80%90%乳酸10.6g,加蒸餾水稀釋定容至1000mL。B 液: 稱取70%乳酸鈉16g,加水稀釋定容至1000mL。取A 液16mL與B 液1mL混合稀釋一倍即成。1.5.3 pH 3.0乳酸-乳酸鈉緩沖液 (0.05molA 液: 稱取80%90%乳酸10.6g,以水定容至1000mL。B 液: 稱取70%乳酸鈉16g,蒸餾水溶解定容

11、至1000mL。取A 液8mL與B 液1mL,混合稀釋一倍即成。1.5.4 pH 10硼砂-氫氧化鈉緩沖液A 液: 稱取硼砂19.08g,用蒸餾水溶解定容至1000mL (0.05mol。B 液: 稱取氫氧化鈉8g,用蒸餾水溶解定容至1000mL (0.2N。取A 液250mL,B 液215mL混合,用蒸餾水稀釋定容至1000mL即成。1.5.5 pH 11.0硼砂-氫氧化鈉緩沖液A 液: 稱取硼砂19.08g,用蒸餾水定容至1000mL 。B 液: 稱取氫氧化鈉4g,用蒸餾水定容至1000mL 。取A 液與B 液等量混合。1.5.6 2%酪蛋白溶液配成酸性時,須先加數(shù)滴濃乳酸,使之濕潤以加速

12、其溶解。2 甲醛法成曲蛋白酶活力的測定,如用福林法測定確有困難時,可用甲醛法測定作過渡。2.1 儀器a. 分析天平:感量0.01g;b. 水浴鍋;c. 電烘箱;d. 容量瓶、吸管、滴定管等。2.2 試劑與溶液a. 1%酚酞指示劑;b. 0.1%麝香草酚藍;c. 0.1N氫氧化鈉液、甲醛(試劑配制法同氨基態(tài)氮的測定,見ZB X 6603887氨基態(tài)氮測定法。2.3 操作2.3.1 目測法稱取研細均勻的成曲樣品10g,放入250mL錐形瓶中,加55溫水80mL,充分搖勻,置于55水浴鍋中保溫3h,取出后加熱煮沸以破壞酶活力,冷卻后定容至100mL,充分搖勻后以脫脂棉過濾,吸取濾液10mL,移至15

13、0mL錐形瓶中,加水50mL, 1%酚酞指示劑0.2mL,以0.1N氫氧化鈉標準溶液滴定至剛顯微紅色(pH 8.2,記下滴定數(shù)作為總酸,繼續(xù)加甲醛10mL,用0.1N氫氧化鈉液滴定至深紅色(pH 8.5為終點,若再加麝香草酚藍1mL作指示劑,則滴至紫紅色為終點。記下滴定數(shù),減去空白數(shù)后計算成氨基態(tài)氮。另稱取曲10g做水分,再折算成干基數(shù)。2.3.2 酸度計法所用儀器、藥品、操作方法等與氨基態(tài)氮測定法同(見ZB X 66038-87。2.4 計算蛋白酶活力(克氨基態(tài)氮/100g(干基(V-*Vo×N×0.014 100=× (210 1 -W10×100式中:V加入甲醛后氫氧化鈉標準液滴定數(shù), mL;*Vo甲醛空白滴定數(shù), mL;W曲水分,%;N氫氧化鈉標準溶液的當量數(shù),N;0.014氮的毫克當量數(shù)。附加說明:本標準由商業(yè)部副食品局提出。本標準由上海市釀造科學研究所起草。本標準主要起草人須鳳高。*本法實質(zhì)上是在一定溫度下、一定時間內(nèi),成曲利用自身的蛋白酶把自身原料中的蛋白質(zhì)水解成氨基酸。以