大腸桿菌生產制備重組人胰島素工藝

1、1. 提取目的基因 :既從人的 DNA中提取胰島素基因 , 可使用限制性內切酶將目的基因 從原 DNA中分離 .2. 提取質粒 :使用細胞工程 , 培養(yǎng)大腸桿菌 , 從大腸桿菌的細胞質中提取質粒, 質粒為環(huán)狀DNA.3. 基因重組 :取出目的基因 與質粒 , 先利用同種限制性內切酶將質粒切開 , 再使用 DNA連接酶將目的基因與質粒 " 縫合 ", 形成一個能表達出胰島素的 DNA質粒 .4. 將質粒送回大腸桿菌 :再大腸桿菌的培養(yǎng)液中加入含有Ca+的物質 , 如 CaCl2, 這使細胞會吸收外源基因.此時將重組的質粒也放入培養(yǎng)液中, 大腸桿菌便會將 重組質粒 吸收 .5.

2、 胰島素的產生 :再大腸桿菌內 , 質粒通過表達轉錄與翻譯后 , 便產生出胰島素蛋白質 . 通過大腸桿菌的大量繁衍 , 便可大量生產出胰島素 !學習要求知道 DNA的粗提取與鑒定的原理； 掌握并能分析 DNA粗提取的技術方法和要求；學會DNA分子的鑒定方法【預習指導】在課前時間通過閱讀教材、同學交流和討論，完成下列問題，并初步鞏固。一、基礎知識【活動 1】閱讀教材 P54“基礎知識”，討論并回答下列問題：1（記憶） 提取生物大分子的基本思路是利用它們的理化性質的不同進行分離。2（記憶） DNA的溶解性特點：DNA在不同濃度 NaCl 溶液中溶解度不同； DNA不溶于酒精而蛋白質溶于酒精?！舅伎?/p>

3、 1】據(jù)圖 51 分析：DNA在不同濃度 NaCl 溶液中溶解度有何特點在L 時溶解度最??；要使 DNA溶解，需要使用什么濃度較高濃度，可使DNA溶解；要使 DNA析出，又需要使用什么濃度L 可使 DNA析出?！舅伎?2】利用 DNA不溶于酒精的原理，可以達到將DNA和蛋白質進一步分離目的。3（記憶） DNA的耐受性特點：蛋白酶能分解蛋白質而不能分解DNA；在 6080時蛋白質變性沉淀而DNA分子不變性。洗滌劑能與蛋白質結合瓦解細胞膜而不破壞DNA分子。4（記憶） DNA的鑒定原理當鑒定提取出的物質是否是DNA時，需要使用二苯胺（甲基綠）進行鑒定。在沸水浴條件下，該試劑與DNA反應，呈現(xiàn)（淺）

4、藍色。二、實驗設計【活動 2】閱讀教材 P55“實驗設計”，討論并回答下列問題：1（記憶） 實驗材料的選?。哼x取材料時應本著DNA含量高、材料易得、便于提取的原則?！舅伎?3】你認為教材提供的材料中哺乳動物的血液不適合提取DNA。2（記憶） 破碎細胞，獲取含DNA的濾液：雞血：向雞血細胞液中加入一定量蒸餾水并玻棒攪拌，用紗布過濾后，收集濾液。洋蔥：向研缽中加入一定量洗滌劑和食鹽，攪拌研磨，用紗布過濾后，收集濾液。【思考 4】在以上實驗中，蒸餾水的作用是使血細胞大量吸水而脹裂，洗滌劑的作用是瓦解細胞膜，食鹽的作用是溶解DNA物質。3（學會） 去除濾液中的雜質：方案一： 30mL濾液加 NaCl

5、使 DNA溶解過濾得濾液加蒸餾水使DNA析出過濾得過濾物放到2mol/LNaCl 溶液中溶解 DNANaCl 溶解液方案二： 30mL濾液加嫩肉粉（木瓜蛋白酶）靜置10 分鐘得 DNA濾液方案三： 30mL濾液 60 67處理過濾得DNA濾液【思考 5】以上三個方案的原理分別是什么方案一原理： DNA在不同濃度 NaCl 溶液中溶解度不同；方案二原理：蛋白酶分解蛋白質，不分解DNA；方案三原理： DNA耐高溫而蛋白質不耐高溫?！舅伎?6】方案一中：“加NaCl 使 DNA溶解過濾得濾液”的目的是除去不溶（可溶、不溶）于NaCl 溶液中的細胞雜質；“加蒸餾水使DNA析出過濾得過濾物”的目的是除去

6、可溶（可溶、不溶）于NaCl 溶液中的細胞雜質。4（記憶） DNA的析出：DNA濾液與等體積冷卻酒精混合， 靜置一段時間后析出的白色絲狀物就是DNA。5（記憶） DNA的鑒定：取 2 支潔凈的試管，編號甲、乙，各加入等量的2mol/L NaCl 溶液。甲中放入少量白色絲狀物，使之溶解。在甲、乙試管中各加4mL二苯胺，混合均勻。沸水浴 5min，觀察顏色變化，甲試管呈現(xiàn)藍色。三、操作提示【活動 3】（記憶）閱讀教材P56“操作提示”和P57“課題延伸”，關注下列注意事項：1在雞血中加入檸檬酸鈉防止凝固；雞血靜置或離心后除去血漿，以提高細胞懸液濃度。2實驗中使用塑料燒杯和尼龍布，以免DNA被吸附。

7、3玻棒沿同一方向緩慢攪拌（細胞破裂時快速攪拌），玻棒不要碰到燒杯壁。4二苯胺試劑要現(xiàn)用現(xiàn)配。5為提高 DNA純度，實驗中通常使用的洗滌劑有CTAB、 SDS等?！净顒?4】觀看視頻： 觀看“ DNA的粗提取與鑒定”視頻，體會并學會相關技術方法。課后學習1嘗試從植物組織中提取DNA分子。2基礎訓練冊：將基礎知識整理到作業(yè)本上；完成該節(jié)訓練題。學習要求嘗試 PCR技術的基本操作， 體驗 PCR技術的分子生物學實驗方法； 理解 PCR技術的原理；討論 PCR技術的應用【預習指導】在課前時間通過閱讀教材、同學交流和討論，完成下列問題，并初步鞏固。一、基礎知識【活動 1】閱讀教材 P58“PCR原理”，

8、討論并回答下列問題：1（記憶） PCR技術擴增 DNA的過程與細胞內的DNA復制過程類似。【思考 1】填寫下表： （記憶） 細胞內 DNA復制條件分析條件參與的組分在 DNA分子復制中的作用模板DNA的兩條單鏈提供復制的模板原料四種脫氧核苷酸合成 DNA子鏈的原料解旋酶打開 DNA雙螺旋RNA聚合酶合成 RNA引物酶DNA聚合酶催化合成 DNA子鏈；切除引物DNA連接酶將不連續(xù)的 DNA子鏈連接起來能量ATP為解螺旋和合成子鏈提供能量引物RNA為 DNA聚合酶提供合成的 3端起點2（理解） 細胞內 DNA的復制（ 1） DNA的結構：脫氧核苷酸分子通過 3,5 磷酸二酯鍵連接形成核苷酸長鏈，兩

9、條脫氧核苷酸長鏈反向平行排列并螺旋化，形成 DNA雙螺旋結構。（ 2）DNA的復制：首先，在解旋酶的作用下，由 ATP供能， DNA發(fā)生解旋形成兩條 DNA單鏈。其次，在 DNA單鏈的 3端，在 RNA聚合酶在作用下， 合成 RNA引物。再次，在DNA聚合酶的作用下，從引物的3端開始合成 DNA子鏈。最后， DNA聚合酶將引物切去，并合成空缺處DNA單鏈，再由 DNA連接酶將不連續(xù)的 DNA子鏈連接起來。3（記憶） DNA分子復制的人工控制解開螺旋：在 80100時， DNA雙螺旋打開，形成兩條DNA單鏈，稱為變性?；謴吐菪涸?060左右時，兩條 DNA單鏈重新形成雙螺旋結構，稱為復性。復制

10、條件：緩沖液， DNA模板、四種脫氧核苷酸、熱穩(wěn)定DNA聚合酶、兩種引物?？刂苾x器： PCR儀（溫度周期性自動調節(jié)儀）?！舅伎?2】緩沖液相當細胞內的什么成分核液?！净顒?2】閱讀教材 P59“PCR的反應過程”，討論并回答下列問題：1（記憶） 填寫 PCR反應流程：2（理解） PCR反應過程是：在升溫至90以上時 DNA解旋；在降溫至50左右時引物與 DNA單鏈結合；在升溫至72左右時合成 DNA子鏈。二、實驗操作【活動 3】閱讀教材 P62“實驗操作”，討論并回答下列問題：1（記憶） 在 PCR反應體系的配方中，含有的成分有緩沖液、DNA模板、四種脫氧核苷酸、熱穩(wěn)定DNA聚合酶、兩種RNA

11、引物、水。2（了解） 實驗操作步驟：按照PCR反應體系配方配制反應液；將PCR反應體系 50L 用微量移液器轉移到微量離心管（）中；將微量離心管放到PCR儀中；設置 PCR儀的工作參數(shù)； DNA在 PCR儀中大量擴增。3（了解） 水浴法：將微型離心管依次在95、 55、 72恒溫水浴鍋中循環(huán)處理。三、操作提示【活動 4】閱讀教材 P62“操作提示”，討論并回答下列問題：1（記憶） 避免外源 DNA污染，所用儀器、緩沖液、蒸餾水等使用前高壓滅菌。2（記憶） 將緩沖液和酶分裝成小份，20低溫保存。3（記憶） 每添加一種反應成分，更換一個移液器槍頭。4（記憶） 混勻后離心處理，使反應液集中在離心管底部。四、結果分析與評價【活動 4】閱讀教材 P63“結果分析與評價”，討論并回答下列問題：1（記憶） 反應液稀釋：取 2LPCR反應液，添加 98L 蒸餾水。2（記憶） 分光光度計調零：將100L 蒸餾水添加到比色杯中，在260nm處將分光光度計讀數(shù)調節(jié)為