高中生物第章基因工程第節(jié)基因工程的操作程序目的基因的獲得基因表達載體的構(gòu)建同步備課教學(xué)案

1、專題課件第1課時目的基因的獲得、基因表達載體的構(gòu)建目標(biāo)導(dǎo)讀1.閱讀教材P7274圖文，掌握獲取目的基因的兩種方法。2.結(jié)合教材P77圖411，理解基因表達載體的構(gòu)建過程。重難點擊1.目的基因的含義及常用獲取方法。2.基因表達載體的構(gòu)建。3.大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取。抑制疾病傳播的轉(zhuǎn)基因蚊子巴西等拉美國家深受致倦庫蚊的危害。致倦庫蚊可攜帶多種病毒和寄生蟲，能夠傳播腦炎、絲蟲等傳染病，而這些傳染病常年在拉美國家肆虐。為了抑制疾病的傳播，巴西科學(xué)家培育出了一種轉(zhuǎn)基因雄性致倦庫蚊。科學(xué)家在雄性致倦庫蚊體內(nèi)植入一種特殊基因，當(dāng)具該基因的轉(zhuǎn)基因雄蚊與野生雌蚊交配時，這種基因可以進入雌蚊的基因組，并使雌蚊死

2、亡，從而減少了該種蚊子的數(shù)量，達到抑制疾病傳播的目的。怎樣才能最終得到轉(zhuǎn)基因雄蚊呢？讓我們一起來學(xué)習(xí)基因工程的基本操作程序吧！一、目的基因的獲得1目的基因：是指人們所需要的進行研究的基因，如抗蟲基因、抗病基因等。2獲取目的基因的方法(1)化學(xué)合成法概念：利用化學(xué)反應(yīng)直接合成基因。適用條件：已知核苷酸序列的、相對分子質(zhì)量較小的目的基因。儀器：DNA自動合成儀。缺點：成本昂貴，不適用于序列未知的目的基因。(2)從基因組中直接分離法鳥槍法(如圖所示)(3)PCR擴增：在掌握了目的基因的部分或全部信息后，可以設(shè)計引物，利用DNA擴增儀(PCR儀)直接擴增目的基因。(4)反轉(zhuǎn)錄法以mRNA為模板，借助反

3、轉(zhuǎn)錄酶，通過PCR儀合成與mRNA序列互補的DNA片段，然后在DNA聚合酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需要的目的基因。如圖表示基因工程中獲取水稻某目的基因的不同方法。據(jù)圖分析：1圖示分別是哪種方法？是在體內(nèi)還是體外進行的？答案三種方法分別是：反轉(zhuǎn)錄法、直接分離法和化學(xué)合成法，都是在體外進行的。2三種方法都需要酶，分別是哪些酶？答案方法a需要反轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶；方法b需要限制性內(nèi)切酶；方法c需要DNA聚合酶。3三種方法獲取的目的基因的堿基對的排列順序都相同嗎？答案不都相同。方法b得到的是天然基因，方法a得到的目的基因和天然基因相比不含內(nèi)含子，方法c得到的目的基因的堿基序列可能有多種。1

4、下列獲得目的基因的方法中需要模板鏈的是()化學(xué)合成法鳥槍法反轉(zhuǎn)錄法PCR擴增目的基因A B C D答案C解析化學(xué)合成法是利用DNA自動合成儀合成已知核苷酸序列的較小的基因。鳥槍法是用很多個限制性內(nèi)切酶去切割DNA獲得目的基因，和化學(xué)合成法一樣不需要模板。反轉(zhuǎn)錄法利用mRNA作為模板反轉(zhuǎn)錄出一條單鏈DNA，然后以這條單鏈的DNA為模板合成出雙鏈的DNA，也是目的基因。PCR技術(shù)也需要模板。2下列屬于PCR技術(shù)的條件的是()單鏈的脫氧核糖核苷酸序列引物目的基因所在的DNA片段脫氧核糖核苷酸核糖核苷酸DNA連接酶DNA聚合酶限制性內(nèi)切酶A BC D答案B解析PCR技術(shù)需要一對引物，即一對單鏈的脫氧核

5、糖核苷酸序列引物，正確；PCR技術(shù)需要模板，即目的基因所在的DNA片段，正確；需要脫氧核糖核苷酸作為原料，正確；核糖核苷酸是合成RNA的原料，而PCR合成的是DNA，錯誤；采用PCR合成DNA時，不需要DNA連接酶，而需要DNA聚合酶，錯誤、正確；體外合成DNA時，不需要限制性內(nèi)切酶，錯誤。知識拓展PCR技術(shù)的基本原理和過程(1)原理：DNA雙鏈復(fù)制。(2)前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列。(3)過程第一步：加熱至9498 ，DNA解鏈為單鏈；第二步：冷卻至4060 ，引物結(jié)合到互補DNA鏈；第三步：加熱至72 左右，熱穩(wěn)定DNA聚合酶(TaqDNA酶)從引物起始進行互補鏈的合成。如此重復(fù)

6、循環(huán)多次。(4)結(jié)果：每一次循環(huán)后，目的基因的量可以增加一倍，即成指數(shù)形式擴增(約為2n，n為擴增循環(huán)的次數(shù))。二、基因表達載體的構(gòu)建1實驗：大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取(1)實驗原理釋放(2)方法步驟在超凈工作臺上(或在酒精燈旁)，取1 mL含質(zhì)粒的大腸桿菌菌液，接種于100 mL LB培養(yǎng)基中，于37 搖床振蕩培養(yǎng)810 h，如無搖床可每0.5 h用手搖晃一次。取1.4 mL菌液于1.5 mL EP管中，以10 000 rpm離心0.5 min，棄上清液。加0.1 mL預(yù)冷的溶液，充分混合。加入0.2 mL溶液輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，靜置5 min(溶液要現(xiàn)配現(xiàn)用)。再加入0.15 mL預(yù)冷溶液，輕輕翻

7、轉(zhuǎn)混勻，靜置5 min。以10 000 rpm離心20 min，取上清液于另一新EP管中。加入等體積預(yù)冷的異丙醇或乙醇，混勻后靜置于冰箱的冷凍室2030 min。10 000 rpm離心15 min，棄上清液。待沉淀稍干后，溶于50 L蒸餾水中。取兩支試管，分別加入1 mL蒸餾水，其中的一支加入提取的質(zhì)粒DNA溶液，向兩支試管中各加入1 mL二苯胺，混勻后，放入沸水中加熱5 min。待試管冷卻后，觀察兩支試管中溶液顏色的變化發(fā)現(xiàn)，加入提取的質(zhì)粒DNA的溶液變藍，另一個不變色。2基因表達載體的構(gòu)建(1)構(gòu)建基因表達載體的原因單個基因或DNA片段導(dǎo)入另一生物體的細(xì)胞后，往往會被細(xì)胞內(nèi)的防御系統(tǒng)消滅

8、掉，降低了目的基因的表達效率。將目的基因和運載體一起進入受體細(xì)胞，可以保護目的基因不被受體細(xì)胞識別并破壞。(2)構(gòu)建過程用限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒，使環(huán)狀質(zhì)粒出現(xiàn)一個切口，露出DNA末端。用同樣的限制性內(nèi)切酶切割目的基因，暴露出兩個與質(zhì)粒相同的DNA末端。用DNA連接酶使質(zhì)粒和目的基因結(jié)合成新的環(huán)狀質(zhì)粒DNA分子表達載體。結(jié)合下圖重組質(zhì)粒的構(gòu)建過程分析：1圖中和分別用到哪種酶？答案用限制性內(nèi)切酶，用DNA連接酶。2同一種限制性內(nèi)切酶切割后的質(zhì)粒和目的基因片段混合后，是不是一定是質(zhì)粒和目的基因結(jié)合？答案不一定。也可能發(fā)生質(zhì)粒的自我環(huán)化或者目的基因的自我環(huán)化。3重組質(zhì)粒上除了具有目的基因外，為了方便監(jiān)

9、測和篩選，還應(yīng)具備哪種基因？答案遺傳報告基因。3下列關(guān)于圖中P、Q、R、S、G的描述，正確的是()AP代表的是質(zhì)粒RNA，S代表的是外源DNABQ表示限制性內(nèi)切酶的作用，R表示RNA聚合酶的作用CG是RNA與DNA形成的重組質(zhì)粒DG是轉(zhuǎn)基因形成的重組質(zhì)粒DNA答案D解析質(zhì)粒是很小的環(huán)狀DNA分子，因此P是質(zhì)粒DNA，S是外源DNA，G是質(zhì)粒和外源DNA通過DNA連接酶連接而成的重組質(zhì)粒；質(zhì)粒和外源DNA需要經(jīng)過同一種限制性內(nèi)切酶切割出相同的黏性末端。4如圖為基因表達載體的模式圖，若結(jié)構(gòu)X是表達載體所必需的，則X最可能是()A氨芐青霉素抗性基因 B啟動子C限制酶 DDNA連接酶答案B解析啟動子是

10、該表達載體所必需的，功能是啟動插入基因的轉(zhuǎn)錄過程。氨芐青霉素抗性基因可以作為報告基因，但不是必須用它作報告基因。限制酶和DNA連接酶都不是表達載體所需要的。知識拓展基因表達載體的構(gòu)成目的基因的獲得基因表達載體的構(gòu)建1在基因工程技術(shù)中，下列方法與目的基因獲得無關(guān)的是()A輻射誘變法 B從cDNA中獲取C反轉(zhuǎn)錄法 D人工合成法答案A2如圖為用于基因工程的一個質(zhì)粒示意圖。用EcoR限制性內(nèi)切酶切割目的基因和該質(zhì)粒，再用DNA連接酶連接形成重組質(zhì)粒，然后導(dǎo)入大腸桿菌，最后將大腸桿菌放在四種培養(yǎng)基中培養(yǎng)：a無抗生素的培養(yǎng)基，b含四環(huán)素的培養(yǎng)基，c含氨芐青霉素的培養(yǎng)基，d含四環(huán)素和氨芐青霉素的培養(yǎng)基。含重

11、組質(zhì)粒的大腸桿菌能生長的是()Aa Ba和cCa和b Db和c答案B3不屬于目的基因與運載體結(jié)合過程的是()A用一定的限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒，露出黏性末端B用同種限制性內(nèi)切酶切割目的基因，露出黏性末端C將切下的目的基因插入質(zhì)粒的切口處D將重組DNA引入到受體細(xì)胞中進行擴增答案D4下列哪項不是表達載體所必需的組成()A目的基因 B啟動子C終止子 D抗青霉素基因答案D5下面是將某細(xì)菌的基因A導(dǎo)入大腸桿菌內(nèi)，制備“工程菌”的示意圖。請據(jù)圖回答：(1)獲得A有兩條途徑：一是以A的mRNA為模板，在_的催化下，合成互補的單鏈DNA，然后在_作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需基因；二是根據(jù)目標(biāo)蛋白質(zhì)的_序列

12、，推測出相應(yīng)的mRNA序列，然后按照堿基互補配對原則，推測其DNA的_序列，再通過化學(xué)方法合成所需基因。(2)利用PCR技術(shù)擴增DNA時，需要在反應(yīng)體系中添加的有機物質(zhì)有_、_、4種脫氧核糖核苷酸和耐熱性的DNA聚合酶，擴增過程可以在PCR擴增儀中完成。(3)由A和運載體B拼接形成的C通常稱為_。答案(1)反轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶氨基酸脫氧核糖核苷酸(2)引物模板(A基因)(3)基因表達載體解析(1)利用反轉(zhuǎn)錄法合成目的基因的過程是：以mRNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的催化作用下合成單鏈DNA，然后在DNA聚合酶的作用下，合成雙鏈DNA分子；根據(jù)蛋白質(zhì)工程合成目的基因的過程是：根據(jù)目標(biāo)蛋白質(zhì)的氨基酸序列

13、，推測相應(yīng)的mRNA序列，然后按照堿基互補配對原則，推測DNA中脫氧核糖核苷酸的排列順序，通過化學(xué)方法合成。(2)PCR過程中需要酶、底物、模板、引物等條件。(3)目的基因和運載體結(jié)合，形成基因表達載體。課時作業(yè)基礎(chǔ)過關(guān)1基因工程中科學(xué)家常采用細(xì)菌、酵母菌等微生物作為受體細(xì)胞，主要原因是()A結(jié)構(gòu)簡單，操作方便B繁殖速度快C遺傳物質(zhì)含量少D性狀穩(wěn)定，變異少答案B2從浩瀚的“基因海洋”中獲得特定目的基因的方法有()從供體細(xì)胞的基因組中直接分離基因從受體細(xì)胞的基因組中直接分離基因化學(xué)合成法復(fù)制A B C D答案B解析基因工程獲取目的基因的方法有兩種：一是化學(xué)合成法；二是從基因組中直接分離法。3下列

14、有關(guān)PCR技術(shù)的說法，不正確的是()APCR技術(shù)的原理是DNA雙鏈復(fù)制BPCR擴增中必須有解旋酶才能解開雙鏈DNACPCR是一項在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)D利用PCR技術(shù)獲取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列答案B解析PCR擴增中不使用解旋酶，是利用高溫破壞氫鍵解開雙鏈DNA的，B錯誤。4下列對基因表達載體構(gòu)建的敘述，不正確的是()A需要限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶等特殊工具B基因表達載體中有的含有啟動子和密碼子C標(biāo)記基因不一定是抗生素抗性基因D基因表達載體的構(gòu)建是基因工程的核心答案B解析基因表達載體是目的基因與運載體的結(jié)合，在此過程中需用同一種限制性內(nèi)切酶切割目的

15、基因與載體，用DNA連接酶將相同的末端連接起來，A正確；基因表達載體含有啟動子、終止子、標(biāo)記基因和目的基因，密碼子位于mRNA上，B錯誤；抗生素抗性基因可作為標(biāo)記基因，但標(biāo)記基因不都是抗生素抗性基因，C正確；基因表達載體的構(gòu)建是基因工程的核心，在細(xì)胞外進行，使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并且可以遺傳給下一代并表達和發(fā)揮作用，D正確。5由于質(zhì)粒與目的基因具有相同的黏性末端，結(jié)合過程中不可能出現(xiàn)下列哪種情況()A可能形成環(huán)狀的外源DNAB可能形成環(huán)狀的載體DNAC可能出現(xiàn)重組DNAD只出現(xiàn)重組DNA答案D6在基因表達載體的構(gòu)建中，下列說法不正確的是()一個基因表達載體的組成包括目的基因、啟動子、終

16、止子有了啟動子才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA終止子的作用是使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止所有基因表達載體的構(gòu)建是完全相同的A BC D答案B解析一個基因表達載體的組成，除了目的基因外，還必須有啟動子、終止子以及報告基因等。由于目的基因的不同，所以構(gòu)建的基因表達載體也是不同的。其中，啟動子是與RNA聚合酶結(jié)合的位點，控制著轉(zhuǎn)錄的開始；而終止子控制著轉(zhuǎn)錄的結(jié)束。能力提升7有關(guān)基因工程的敘述，正確的是()A限制性內(nèi)切酶只在獲取目的基因時才用B重組質(zhì)粒的形成是在細(xì)胞內(nèi)完成的C質(zhì)粒都可以作為運載體D蛋白質(zhì)的氨基酸排列順序可以為合成目的基因提供線索答案D8小鼠雜交瘤細(xì)胞表達的單克隆抗體用于人體試驗時易引起過敏反應(yīng)，

17、為了克服這個缺陷，可選擇性擴增抗體的可變區(qū)基因(目的基因)后再重組表達。下列相關(guān)敘述正確的是()設(shè)計擴增目的基因的引物時不必考慮表達載體的序列用PCR方法擴增目的基因時不必知道基因的全部序列PCR體系中一定要添加從受體細(xì)胞中提取的DNA聚合酶一定要根據(jù)目的基因編碼產(chǎn)物的特性選擇合適的受體細(xì)胞A BC D答案C解析要考慮表達載體相關(guān)序列，從而保證目的基因能與表達載體相連接及正常表達；只要設(shè)計出目的基因的引物，接下來即可自動進行；需要特殊的耐高溫的DNA聚合酶，從細(xì)胞內(nèi)提取的DNA聚合酶不耐高溫；選擇特定合適的受體細(xì)胞，從而保證目的基因能表達出所需產(chǎn)物。C正確。9如圖是利用基因工程技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因植

18、物生產(chǎn)可食用疫苗的部分過程示意圖，其中Pst、Sma、EcoR、Apa 為四種限制性內(nèi)切酶。下列說法錯誤的是()A圖示過程是基因工程的核心步驟B表達載體構(gòu)建時需要用到限制性內(nèi)切酶SmaC抗卡那霉素基因的存在有利于將含有抗原基因的細(xì)胞篩選出來D除圖示組成外，表達載體中還應(yīng)該含有啟動子和終止子等結(jié)構(gòu)答案B解析圖示過程為基因表達載體的構(gòu)建過程，是基因工程中的核心步驟。構(gòu)建過程中需要將目的基因完整切割下來，此時要用到限制性內(nèi)切酶Pst、EcoR。抗卡那霉素基因是標(biāo)記基因，目的是便于鑒定和篩選含有目的基因的細(xì)胞?；虮磉_載體包括啟動子、目的基因、終止子和標(biāo)記基因等。10“X基因”是DNA分子上一個有遺傳

19、效應(yīng)的片段，若要用PCR技術(shù)特異性地拷貝“X基因”，需在PCR反應(yīng)中加入兩種引物(注：引物的作用是與模板鏈形成雙鏈后在DNA聚合酶的作用下就可以繼續(xù)鏈的延伸)，兩種引物及其與模板鏈的結(jié)合位置如下圖甲所示。經(jīng)4輪循環(huán)后產(chǎn)物中有五種不同的DNA分子，如下圖乙所示，其中第種DNA分子有幾個()A8 B6 C4 D2答案A解析由圖分析可知：X基因第一次復(fù)制得到兩個兩種DNA分子：和；X基因第二次復(fù)制得到四個四種DNA分子：復(fù)制得和、復(fù)制得和；X基因第三次復(fù)制得到八個五種DNA分子：復(fù)制得和、復(fù)制得和、復(fù)制得和、復(fù)制得和；X基因第四次復(fù)制得到16個五種DNA分子：復(fù)制得和、兩個復(fù)制得兩個和兩個、兩個復(fù)制

20、得兩個和兩個、兩個得到4個。從上面的推測可知，第四輪循環(huán)產(chǎn)物中有8個。11根據(jù)基因工程的有關(guān)知識，回答下列問題：(1)限制性內(nèi)切酶切割DNA分子后會產(chǎn)生_末端。(2)質(zhì)粒運載體用EcoR切割后產(chǎn)生的片段如下：GAATTCCTTAAG為使運載體與目的基因相連，含有目的基因的DNA除可用EcoR切割外，還可用另一種限制性內(nèi)切酶切割，該酶必須具有的特點是_。(3)反轉(zhuǎn)錄作用的模板是_，產(chǎn)物是_。若要在體外獲得大量反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，可采用_。(4)基因工程中除質(zhì)粒外，_和_也可作為運載體。答案(1)黏性(2)切割產(chǎn)生的DNA片段黏性末端與EcoR切割產(chǎn)生的相同(3)mRNA(或RNA)DNADNA擴增儀(P

21、CR儀)直接擴增目的基因(4)噬菌體動植物病毒解析(1)DNA分子經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割會產(chǎn)生黏性末端。(2)為了保證目的基因與運載體相連，用另一種限制性內(nèi)切酶切割后形成的黏性末端必須與EcoR切割形成的黏性末端相同。(4)反轉(zhuǎn)錄的模板是mRNA，產(chǎn)物是DNA。大量擴增反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可使用DNA擴增儀(PCR儀)直接擴增目的基因。(5)在基因工程中使用的運載體除質(zhì)粒外，還有噬菌體、動植物病毒等。12HIV屬于反轉(zhuǎn)錄病毒，是艾滋病的病原體。用基因工程方法制備HIV的某蛋白(目的蛋白)時，可先提取HIV中的_，以其作為模板，在_的作用下合成_，獲取該目的蛋白的基因，構(gòu)建重組表達載體，隨后導(dǎo)入受體細(xì)胞。答案RNA反轉(zhuǎn)錄酶cDNA(或DNA)解析HIV是RNA病毒，其核酸是單鏈RNA，而在基因工程中構(gòu)建目的基因表達載體時，運載體一般用的是質(zhì)粒