淺論吡咯喹啉醌對(duì)γ射線照射后AGS細(xì)胞抗氧化力的影響

1、淺論吡咯喹啉醌對(duì)射線照射后AGS細(xì)胞抗氧化力的影響 作者：邱秀芹，劉春亮，徐嵐，趙俊宇，吳士良【摘要】 目的： 探討吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone，PQQ)對(duì)60Co射線照射細(xì)胞清除自由基能力。方法： 培養(yǎng)AGS細(xì)胞至對(duì)數(shù)期，實(shí)驗(yàn)分為6組：正常培養(yǎng)未照射組、單純照射組、PQQ培養(yǎng)12 h未照射組、PQQ培養(yǎng)4 h未照射組、PQQ培養(yǎng)12 h后照射組、PQQ培養(yǎng)4 h后照射組。60Co照射，劑量8Gy。照射后6,12,24 h測(cè)定細(xì)胞總抗氧化力（TAOC），SOD，MDA含量。結(jié)果： 與正常未照組比較，照射后6，12，24 h單純照射組SOD，TAOC顯著降低（P0

2、.05），MDA顯著升高（P0.01）；與單純照射組比較：PQQ培養(yǎng)的照射組SOD，TAOC顯著升高（P0.01），除照射后6 h外MDA顯著降低（P0.05）。結(jié)論： PQQ可通過增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力，降低氧化水平，從而對(duì)輻射細(xì)胞起保護(hù)作用。 【關(guān)鍵詞】 AGS細(xì)胞； 吡咯喹啉醌； 抗氧化力AbstractObjective: To investigate PQQ scavenging free radicals in cells by ray radiation.Methods： AGS cells were cultivated. There were 6 groups in our ex

3、periment: the normal group, simply irradiated group, nonirradiated group treated with PQQ by 12 hours, nonirradiated groups treated with PQQ by 4 hours, irradiated groups treated with PQQ by 12 hours, irradiated groups treated with PQQ by 4 hours. The radiation was 60Corays with the dose of 8Gy. Aft

4、er irradiated 6 h, 12 h, 24 h, the cells were measured of theses level: total antioxidation competence(TAOC),SOD,MDA. Results： The level of TAOC and SOD decreased (P0.05),and the level of MDA increased (P0.01)in simply irradiated groups after irradiated 6 h, 12 h, 24 h,in comparison with the normal

5、group. The level of TAOC and SOD increased (P0.01) in irradiated groups treated with PQQ in comparison with the simply irradiated group; and the level of MDA decreased (P0.05). Conclusion： PQQ can protect radiated cells,by strengthening antioxidative competence and lessening the oxidation of cells.K

6、ey wordsAGS cell; pyrroloquinoline quinone; antioxidation competence從食品輻照、醫(yī)用射線到空間電離輻射，輻射無處不在。大劑量輻射可引起機(jī)體多種組織和器官的損傷，甚至誘發(fā)細(xì)胞突變、癌變、致死等嚴(yán)重后果。如何增強(qiáng)機(jī)體抵抗力，防止或減輕輻射對(duì)人體健康的危害，研究高效、低毒的輻射防護(hù)劑顯得非常重要。 吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone，PQQ)是一種氧化還原酶輔基，作為電子的供體和受體參與氧化還原過程1。PQQ具有一些重要的生物活性和功能：如刺激微生物、人體細(xì)胞生長(zhǎng)和植物發(fā)育等。本實(shí)驗(yàn)室已初步研究PQQ對(duì)高能

7、電子射線照射引起的大鼠皮膚損傷有一定的防護(hù)作用，PQQ能有效提高自由基清除酶系活性，部分清除電子直線加速器照射后產(chǎn)生的自由基2。本實(shí)驗(yàn)以胃癌細(xì)胞AGS為研究對(duì)象，通過檢測(cè)60Co射線照射后AGS細(xì)胞中抗氧化能力及自由基含量的變化，探討PQQ對(duì)細(xì)胞的輻照損傷效應(yīng)的影響。 1 材料與方法 1.1 主要儀器和試劑 胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS購自上海生科院,本室培養(yǎng)；PQQ由上海復(fù)旦大學(xué)生物化學(xué)教研室惠贈(zèng)；丙二醛(MDA)、總抗氧化力(TAOC)和超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；60Co照射裝置由蘇州大學(xué)核輻照中心提供。 1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)分組與處理 胃癌細(xì)胞AGS培養(yǎng)在含1

8、0小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，置37 50 ml/L CO2培養(yǎng)箱中，保持飽和濕度，環(huán)境溫度為25。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色，活細(xì)胞超過80者用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分6組：正常未照射組（A組）、單純照射組（B組）、PQQ培養(yǎng)12 h未照射組（C組）、PQQ培養(yǎng)4 h未照射組（D組）、PQQ培養(yǎng)12 h后照射組（E組）、PQQ培養(yǎng)4 h后照射組（F組）。PQQ溶解在無血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，0.22 m孔徑濾過除菌，4避光放置備用。PQQ在培養(yǎng)液中的終濃度為10 mol/L。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔達(dá)3106，貼壁過夜。C，E組于照射前12 h換含PQQ的培養(yǎng)液

9、，D，F(xiàn)組于照射前4 h換含PQQ的培養(yǎng)液，B，E，F(xiàn)組采用蘇州大學(xué)核輻照中心60Co射線照射裝置，劑量8 Gy，劑量率1 Gy/min進(jìn)行單次照射。共做6批。 1.3 細(xì)胞SOD，TAOC，MDA測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，每孔3106細(xì)胞數(shù)接種于6孔培養(yǎng)板，貼壁過夜。按分組要求加入PQQ。細(xì)胞照射后6,12,24 h，0.25%胰酶消化,離心收集細(xì)胞，PBS洗2 次，棄洗液。取各組細(xì)胞加PBS 1 ml，Tris100裂解細(xì)胞，離心取上清液。用比色法按試劑盒說明測(cè)定SOD，TAOC，MDA含量。 1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，數(shù)據(jù)處理用社會(huì)學(xué)統(tǒng)計(jì)程序包SPSS11.5軟件

10、系統(tǒng)，經(jīng)方差分析后，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。2 結(jié) 果2.1 60Co射線照射后不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞SOD，TAOC含量變化 照射后6，12，24 h，B組細(xì)胞TAOC，SOD明顯低于A組（P0.05）；C，D，E，F(xiàn)組細(xì)胞TAOC，SOD均顯著高于A組（P0.05），C，D，E，F(xiàn)組均顯著高于B組(P0.01)。照射前4 h和照射前12 h換PQQ培養(yǎng)液比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，PQQ培養(yǎng)的未照組與照射組細(xì)胞比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1，表2）。表1 PQQ對(duì)60Co射線照射AGS細(xì)胞TAOC 含量的影響，Tab 1 Effects of TAOC activity by PQQ 60Coray irr

11、adiation on AGS cells（略）；表2 PQQ對(duì)60Co射線照射AGS細(xì)胞TSOD 含量的影響，Tab 2 Effects of TSOD activity by PQQ 60Coray irradiation on AGS cells（略） 照后6，12，24 h，B，E，F(xiàn)組細(xì)胞MDA明顯高于A組（P0.01）；照射后12，24 h，E，F(xiàn)組細(xì)胞MDA明顯低于B組（P0.05）；各時(shí)間點(diǎn)C，D組細(xì)胞MDA與A組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。表3 PQQ對(duì)60Co射線照射AGS細(xì)胞MDA含量的影響，Tab 3 Effects of MDA concentration by P

12、QQ 60Coray irradiation on AGS cells（略） 3 討論 電離輻射對(duì)生物體可造成嚴(yán)重?fù)p害。電離輻射可直接作用于核酸、蛋白質(zhì)及酶類，引起電離和化學(xué)鍵斷裂，使分子變性和細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞；也可以作用于機(jī)體內(nèi)水分子，使其發(fā)生電離和激發(fā)，產(chǎn)生大量具有強(qiáng)氧化性能的自由基，間接使組織細(xì)胞變性、壞死，致使代謝紊亂，引起免疫、神經(jīng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)功能障礙3。本研究顯示8 Gy60Co射線照射AGS細(xì)胞后于6,12,24 h細(xì)胞SOD，TAOC均明顯降低，MDA顯著升高，細(xì)胞死亡增加，發(fā)生了明顯的輻射損傷生物學(xué)效應(yīng)。 吡咯喹啉醌為B族維生素4，Urakami等5用電子自旋共振(ESR)光譜法

13、分析證實(shí)PQQ具有很強(qiáng)的自由基清除能力，其清除自由基的能力比抗壞血酸高50100倍。對(duì)心肌的缺血再灌注實(shí)驗(yàn)表明PQQ是有效的自由基清除劑，是一種高效的心肌保護(hù)劑6；Tao等7研究表明PQQ能減輕過氧化對(duì)心肌細(xì)胞的線粒體滲透，降低過氧化脂質(zhì)的含量；Ohwada等8研究表明PQQ能提高神經(jīng)系統(tǒng)由于氧化壓力導(dǎo)致的認(rèn)知能力下降，能抑制由于氧化造成的神經(jīng)細(xì)胞的死亡9。 有研究表明攜帶PQQ合成酶基因的大腸埃希菌具有抗輻射及抗氧化能力是通過PQQ直接清除活性氧自由基及調(diào)動(dòng)其他自由基清除機(jī)制實(shí)現(xiàn)的10。本研究結(jié)果顯示，照射前PQQ培養(yǎng)的AGS細(xì)胞TAOC，SOD含量于照射后6,12,24 h各時(shí)間點(diǎn)均明顯高

14、于單純照射組，照射前PQQ培養(yǎng)的AGS細(xì)胞MDA含量于照射后12,24 h明顯低于單純照射組，表明PQQ可提高細(xì)胞的抗氧化能力，降低自由基水平，保護(hù)輻照細(xì)胞免受自由基攻擊，從而對(duì)細(xì)胞輻照損傷有一定的防護(hù)作用。同時(shí)，研究結(jié)果顯示，PQQ處理的未照射AGS細(xì)胞TAOC，SOD含量于各時(shí)間點(diǎn)均明顯增加，而MDA含量沒有顯著差異。表明PQQ也能增強(qiáng)正常細(xì)胞的抗氧化酶的合成，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1Matsnshita K，Toyama H，Yamada M，et alQuinoproteins：structure，function，and biotechnological appli

15、cationsJAppl Microbiol Biotechnol，2002，58（1）：13-22 2吳祁生，王建浩，周迎會(huì)，等吡咯并喹啉醌對(duì)急性放射性皮膚損傷大鼠機(jī)體自由基的清除作用J江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2008，18 (5 )：403-4063Boucher D，Hindo J，Averbeck DIncreased repair of gammainduced DNA doublestrand breaks at lower doserate in CHO cellsJCan J Physiol Pharmaco1，2004，82(2)：125-132 4Kasahara T，Kat

16、o TNutritional biochemistry: A new redoxcofactor vitamin for mamalsJNature，2003，422（6934）：8325Urakami T，Yoshida C，Akaike T，et alSynthesis of monoesters of pyrroloquinoline quinone and imidazopyrroloquinoline, and radical scavenging activities using electron spin resonance in vitro and pharmacologica

17、l activity in vivoJJ Nutr Sci Vitaminol，1997，43(1)：19-336Zhu BQ，Zhou HZ，Teerlink JR，et alPyrroloquinoline quinone (PQQ) decreases myocardial infarct size and improves cardiac function in rat models of ischemia and ischemia/reperfusionJCardiovasc Drugs Ther，2004，18(6)：421-4317Tao R，Karliner JS，Simoni

18、s U，et alPyrroloquinoline quinone preserves mitochondrial function and prevents oxidative injury in adult rat cardiac myocytesJBiochem Biophys Res Commun，2007，363(2)：257-2628Ohwada K，Takeda H，Yamazaki M，et alPyrroloquinoline quinone (PQQ) prevents cognitive deficit caused by oxidativeStress in ratsJJ Clin Biochem Nutr，2008，42：29-349Nunome K，Miyazaki S，Nakano M，et alPyrroloquinoline quinone prevents oxidative stressinduced neuronal death pro