蔓性千斤拔總黃酮的提取與分析

1、蔓性千斤拔總黃酮的提取與分析李 華1，馬小軍1，2基金項(xiàng)目 廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(0718009-2C) *通訊作者：馬小軍，Tel：，E-mail：xjma1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所, 北京 100094；2廣西藥用植物園，廣西 南寧 530023摘要：目的：考察超聲波提取千斤拔中總黃酮的最佳條件，并確定一種簡單有效的分析方法。方法：通過單因素多水平及正交試驗(yàn)考察超聲波甲醇法提取千斤拔總黃酮的試驗(yàn)條件，并與加熱回流提取進(jìn)行比較。以蘆丁和染料木素作為對照品，通過比色法測定總黃酮的含量，以高效液相色譜驗(yàn)證結(jié)果。結(jié)果：在85%甲醇，料液比

2、1:40，超聲20min，提取1次的最佳工藝條件下，采用染料木素為對照品測定總黃酮得率為4.98。結(jié)論：首次運(yùn)用超聲波提取千斤拔總黃酮，提取效率高于回流提取，并且建立了以染料木素為對照品測定千斤拔總黃酮的分析方法，該方法簡單可行，易操作。關(guān)鍵詞：千斤拔；總黃酮；提??；超聲法；紫外可見分光光度法；高效液相色譜Extraction and Analysis of Total Flavonoids from Flemingia philippinensisHua Li1 and Xiaojun Ma1,2*1Institute of Medicinal Plant Development, Chin

3、ese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100094, China2Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plant, Nanning 530023, ChinaAbstract Objective: To investigate the optimum extraction condition and a simple effective analysis method of total flavoniod from Flemingia phili

4、ppinensis. Method: Solely solvent extraction, orthogonal experiment and comparison with heating reflux extraction were employed to investigate the extraction condition of total flavonoid with mathanol using supersonic wave from F. philippinensis. The total flavonoid content was determined by rutin a

5、nd genstein standard samples and the results was aided to determine by HPLC. Results: The yield of total flavonoid was 4.98% using genistein standard sample at the optimum conditions of 85% methanol solution, solid-liquid ratio 1:40, 40 min, 1 time for supersonic extraction. Concludsion: It was the

6、first time to extract total flavonoid from F. philippinensis using ultrasonic wave which was better than reflex extraction. The analysis method, ultraviolet spectrophotometry with the genistein as standard sample, was established. It was simple, feasible and easy to operate.Key words Flemingia phili

7、ppinensis; total flavonoid; extraction; supersonic wave; ultraviolet-visible spectrophotometry; HPLC蔓性千斤拔（Flemingia philippinensis Merr.et Rolfe），即千斤拔，為豆科千斤拔屬植物，在我國主要分布于西南、中南和東南地區(qū)，入藥部分為根，其主要功能有祛風(fēng)除濕，消炎止痛，慢性腎炎，及治療一些婦科疾病1,2，廣為民間應(yīng)用。研究表明，該植物中的黃酮類化合物為主要活性物質(zhì)。目前，蔓性千斤拔已經(jīng)能夠成功的進(jìn)行人工栽培，為進(jìn)一步的開發(fā)利用該植物資源，我們采用超聲法提取千斤

8、拔的總黃酮化合物。超聲波提取植物中的有效成分操作便捷，提出率高，速度快，而且化合物的結(jié)構(gòu)不會(huì)受到破壞。因此在分析總黃酮的試驗(yàn)中，超聲波提取越來越成為一種主導(dǎo)的方法。1 實(shí)驗(yàn)材料、設(shè)備及試劑1.1 材料：蔓性千斤拔的根采于2006年4月廣西藥用植物園，粉碎過40目篩；蘆丁（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：F20060526）；染料木素（實(shí)驗(yàn)室提?。?。1.2 儀器：Waters 2690-996高效液相色譜儀，紫外檢測器（DAD），Empower色譜工作站；722分光光度計(jì)（上海儀器分析廠）；紫外分光光度計(jì)（天津天光光學(xué)儀器廠）。1.3 試劑：亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉，甲醇，乙醇，無水冰醋酸，均

9、為分析純；乙腈，為色譜純（Honeywell）；“娃哈哈”純凈水（市售）。2 實(shí)驗(yàn)方法2.1 對照品溶液的制備精確稱取充分干燥后的蘆丁10.0mg置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻制成濃度為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精確稱取充分干燥后的染料木素6.36mg置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻制成濃度為0.636mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作2.2.1 蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線參考文獻(xiàn)3，分別取對照品溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL于10mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉0.4mL，搖勻放置6min后，加10%硝酸鋁0.4mL，搖勻放置6min，

10、再加4%的氫氧化鈉4mL，加甲醇至刻度搖勻，在510nm處測其吸光度。以測定結(jié)果計(jì)算得直線方程Y=0.0147X0.0381，r0.9996。在1050g/mL的范圍內(nèi)，濃度（X）與吸光度（Y）有良好的線性關(guān)系。2.2.2 染料木素的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別取對照品溶液0.0、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12mL于10mL容量瓶中，加甲醇至刻度搖勻，在258nm處測其紫外吸收值4。以測定結(jié)果計(jì)算得直線方程Y=0.1726X0.0756，r0.9996，在2.5447.632g/mL的范圍內(nèi)，濃度（X）與吸光度（Y）有良好的線性關(guān)系。2.3 供試品溶液的制備準(zhǔn)確稱取千斤拔粉末干品0.5 g置

11、于100mL帶蓋三角瓶中，加入所用試劑超聲提取，過濾，定容至50mL容量瓶中，搖勻。2.4 供試品中總黃酮含量的測定取1mL供試品，分別按2.2步驟進(jìn)行操作測定其吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮的含量。2.5 HPLC色譜條件 色譜柱Agilent Eclipse XDB-C18（4.6×250mm，5m）；柱溫30；檢測波長265nm；流速1mL·min1；進(jìn)樣量10L；洗脫時(shí)間95min；流動(dòng)相乙腈0.5%無水冰醋酸；洗脫程序如表1所示。表1 流動(dòng)相洗脫程序Tab.1 the gradient eluted program of mobile phase時(shí)間/min乙腈

12、/ mL0.5%無水冰醋酸/mL0208052278122575203268273565475842555842859010959463 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析3.1單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1.1 提取次數(shù)對總黃酮含量的影響采用甲醇為溶劑考察提取次數(shù)對總黃酮提取率的影響。第1次溶劑體積20mL，提取60min；第2次10mL，提取20min；第3次10mL，提取20min。所得提取液根據(jù)2.2 方法測其吸光度（以下單因素均用此法測定）。結(jié)果（如圖1）表明，提取1次時(shí)黃酮含量最高，而次數(shù)越多含量越低可能是溶出的雜質(zhì)過多而影響了吸光度。3.1.2 溶劑對總黃酮含量的影響在超聲時(shí)間60min，溶劑體積為30mL，

13、提取1次的條件下考察甲醇濃度對總黃酮提取率的影響。結(jié)果（如表2）表明，兩個(gè)對照品測定結(jié)果不一致，千斤拔中所含的黃酮極性譜較寬，因此提取時(shí)水醇要有一定比例才能使總黃酮的提取率最高。3.1.3 提取時(shí)間對總黃酮含量的影響在甲醇，溶劑體積為20mL，提取1次的條件下考察提取時(shí)間對總黃酮提取率的影響。結(jié)果（如圖3）表明，40min時(shí)總黃酮含量即可達(dá)到最大值，而10min時(shí)提取率均可達(dá)總黃酮的80%，充分顯示了超聲提取的高效性。而隨時(shí)間的延長提取率降低，可能也是因?yàn)槿艹鲭s質(zhì)而使吸光度下降。3.1.4 溶劑體積對總黃酮含量的影響在甲醇，超聲時(shí)間60min，提取1次的條件下考察溶劑體積對總黃酮提取率的影響。

14、結(jié)果（如圖4）表明，以染料木素為對照品時(shí)，料液比1:40時(shí)總黃酮含量最高；而以蘆丁為對照品時(shí)，料液比1:40的提取率為1:60的91%。因此從試劑節(jié)省的角度看，采用染料木素更合理。 圖 1 提取次數(shù)不同對總黃酮提取率的影響 圖 2 甲醇濃度不同對總黃酮提取率的影響Fig.1 effect of time on the yield of flavonoid Fig.2 effect of concentration of methanol on the yield of flavonoid 圖3 提取時(shí)間不同對總黃酮提取率的影響 圖4 溶劑體積不同對總黃酮提取率的影響 Fig.3 effect

15、of time on the yield of flavonoid Fig.4 effect of volume of solvent on the yield of total flavonoid以上結(jié)果表明，以蘆丁為對照時(shí)，最佳提取條件為：0.5 g樣品，70%甲醇，超聲40min，溶劑體積30mL，提取1次；而以染料木素為對照品，最佳提取條件為：0.5 g樣品，85%甲醇，超聲40min，溶劑體積20mL，提取1次。同時(shí)，以蘆丁為對照品測定的結(jié)果均明顯低于以染料木素為對照品測定的結(jié)果，雖然蘆丁為測定總黃酮最常用的對照品，但是蔓性千斤拔主要含有異黃酮，綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以染料木素為對照品測

16、定千斤拔的總黃酮含量更準(zhǔn)確。3.2 超聲波提取千斤拔總黃酮的正交試驗(yàn) 在以上單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對影響千斤拔總黃酮得率的主要因素，即提取次數(shù)、溶劑、時(shí)間和溶劑體積進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，并對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果見表3。表2 超聲提取總黃酮的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（L934）水平和因素Tab. 2 test factor and level水平提取次數(shù)（A）（次）溶劑（B）（甲醇，%）提取時(shí)間（C）（min）溶劑體積（D）（mL）1170201022854020331006030表3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析Tab. 3 analysis of test result試驗(yàn)號ABCD蘆丁對照總黃酮得率（）染料木

17、素對照總黃酮得率（）總峰面積117020101.534.50191444218540201.594.751990123110060301.364.31173309427040301.674.38173204528560101.504.511831496210020201.304.25188337737060201.604.41185584838520301.604.381937079310040101.254.09152235k111.491.601.481.43k121.491.561.501.50k131.481.301.491.54R10.010.300.020.11k214.524.4

18、34.384.37k224.384.554.414.47k234.294.224.414.35R20.230.240.030.12k31187921183411191163175609k32181563191956174817190978k33177175171294180680173702R310745206621634617276注：k1、k2、k3分別為蘆丁對照，染料木素對照、9個(gè)峰總峰面積的各因子均值。R1，R2，R3分別為蘆丁對照，染料木素對照、9個(gè)峰總峰面積的各因子極差。正交試驗(yàn)結(jié)果得知，在蘆丁為對照品時(shí)最佳工藝為A1B1C2D3，而染料木素為對照品時(shí)最佳工藝為A1B2C2D2，以

19、上結(jié)果與單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。對結(jié)果影響最大的因素為甲醇濃度，其次為次數(shù)、倍數(shù)和時(shí)間。取正交試驗(yàn)所有供試品按2.5進(jìn)行測定，圖譜（如圖5）中8個(gè)共有的典型峰來考察總黃酮提取方法，與標(biāo)準(zhǔn)品（均為本實(shí)驗(yàn)室制得）比對后，8個(gè)峰分別鑒定為genistin（1），未知峰（2），orobol（3），genistein（4），5,7,3',4'-tetrahydroxy-6,8 -diprenylisoflavone（5），flemichin D（6），auriculasin（7），flemiphilippinin A（8），以這8個(gè)化合物的峰面積和為考察指標(biāo)，確定最佳工藝為A1B2C1D2，

20、與以染料木素為標(biāo)準(zhǔn)測定的結(jié)果一致，只是影響因素的程度略有改變，即影響程度大?。杭状紳舛润w積時(shí)間次數(shù)。在以染料木素為對照品的試驗(yàn)中，極差結(jié)果顯示，提取時(shí)間20min和40min對總黃酮的提取率影響不大，因此為縮短周期，降低能耗，提取時(shí)間采用20min為宜，而此時(shí)的最佳工藝為A1B2C1D2，與HPLC測定的結(jié)果一致。圖5 正交試驗(yàn)HPLC圖譜Fig. HPLC of orthogonal experiment3.3最佳條件下總黃酮提取率 由以上正交試驗(yàn)得出最佳提取工藝為A1B2C1D2，在此條件下，平行重復(fù)3次，以染料木素為對照品計(jì)算得總黃酮平均提取率為4.98，RSD為2.6 %。3.4 實(shí)驗(yàn)

21、的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)3.1在10分鐘之內(nèi)測定結(jié)果較穩(wěn)定，隨時(shí)間延長吸光度減小，RSD為4.1%；實(shí)驗(yàn)3.2在30min內(nèi)測定結(jié)果基本一致，RSD為0.8%。因此采用染料木素為對照品直接在258nm下測定總黃酮的含量較為準(zhǔn)確。3.5 比較超聲提取與回流提取對總黃酮提取率的影響本實(shí)驗(yàn)采用超聲最佳提取工藝和回流提取方法進(jìn)行了比較，即在A1B2C1D2條件下考察時(shí)間不同對總黃酮提取率的影響，所得提取液在258nm下測吸光值，按2.2.2方程計(jì)算總黃酮含量。表4 超聲提取與回流提取比較Tab. 4 comparison between ultrasonic extraction and reflux時(shí)間（min）204060120180超聲提取率（）4.995.014.77回流提取率（）3.244.655.19由以上結(jié)果表明，在溶劑，料液比，提取次數(shù)都相同的情況下，在20min時(shí)超聲所得總黃酮提取率可達(dá)4.99%，40min時(shí)，提取率提高0.02%，相差無幾。而回流提取在3 h時(shí)的提取率雖然高于超聲提取，但是考慮到時(shí)間較長，操作繁瑣，且回流溫度偏高而導(dǎo)致溶出色素和雜質(zhì)較多等原因，綜合比較得