法醫(yī)物證學(xué)各章知識(shí)整理

1、第二章法醫(yī)物證分析的遺傳學(xué)基礎(chǔ)法醫(yī)物證學(xué)：是以法醫(yī)物證為研究對(duì)象，以提供科學(xué)證據(jù)為目的，研究應(yīng)用生命科學(xué)技術(shù)解決案件中與人體有關(guān)的生物檢材鑒定的一門(mén)學(xué)科。法醫(yī)物證的特點(diǎn)：法醫(yī)物證的穩(wěn)定性受環(huán)境條件的影響；法醫(yī)物證屬于“科學(xué)證據(jù)”。法醫(yī)物證學(xué)-生物檢材-遺傳標(biāo)記-個(gè)人識(shí)別遺傳（heredity ）:生物繁衍過(guò)程中，子代與親代相似的現(xiàn)象。變異（variation ）:生物繁衍過(guò)程中，子代與親代有所不同 的現(xiàn)象。遺傳標(biāo)記（genetic marker , GM :個(gè)體的單位遺傳性狀 作為標(biāo)志用于法醫(yī)物證分析時(shí)， 這種遺傳性狀就稱為遺傳標(biāo)記。遺傳標(biāo)記顯然具有以下特點(diǎn)：？特定性-遺傳多態(tài)性 ？穩(wěn)定性-終

2、身不變、對(duì)環(huán)境的耐受性？反映性-可檢測(cè)性遺傳性狀：生物體表現(xiàn)出來(lái)的形態(tài)特征和生理生化特性稱為性狀。如果性狀的產(chǎn)生是由遺傳因素決定的，稱為遺傳性狀。單位遺傳性狀是指可檢測(cè)的、由遺傳決定的、并能夠以一定的規(guī)律從親代傳給下一代的形 態(tài)學(xué)、生理學(xué)及分子生物學(xué)特征?；颍耗軌虮磉_(dá)特定功能的產(chǎn)物，并決定生物特定性狀的一段DNA序列?；蜃╨ocus）:基因在染色體上的一個(gè)特定位置等位基因：同一個(gè)基因座上的基因可以有不同類(lèi)型，它們之間存在一級(jí)結(jié)構(gòu)的差異，這種有差異的基因稱為等位基因復(fù)等位基因：對(duì)群體而言，一個(gè)基因座上具有3個(gè)或3個(gè) 以上的等位基因，稱為復(fù)等位基因，如ABO血型、TH01基因型：個(gè)體一個(gè)或多

3、個(gè)基因座的等位基因的組合，是生物體可見(jiàn)性狀的實(shí)際基因組成。基因座上的等位基因都是成對(duì)存在的。純合子：成對(duì)的等位基因相同。雜合子：成對(duì)的等位基因不同。表型：是指生物體某特定基因所表現(xiàn)出的性狀。法醫(yī)學(xué)含義：1、表型是基因型決定的 2、表型是個(gè)體基因型檢測(cè)的結(jié)果。3、型檢測(cè)的結(jié)果可以對(duì)未知基因型進(jìn)行推斷。4、DNA水平的檢測(cè)結(jié)果也是表型。5、表型可能和真實(shí)的基因組成之間存在偏差孟德?tīng)柗蛛x律： 指在生殖細(xì)胞通過(guò)減數(shù)分裂形成配子時(shí)，成對(duì)的等位基因彼此分離，并獨(dú) 立地分配到不同配子中自由組合律：在配子形成時(shí)，不同基因座上的非等位基因隨機(jī)地自由組合，形成子代基因 型先決條件：各基因座間沒(méi)有遺傳連鎖關(guān)系。要求

4、：選擇符合自由組合律的遺傳標(biāo)記位于不同染色體上在同一染色體上相距較遠(yuǎn)的位置通過(guò)群體調(diào)查證實(shí)沒(méi)有遺傳連鎖關(guān)系（基因座獨(dú)立性檢驗(yàn)）母系遺傳（線粒體DNA）: （1）遺傳物質(zhì)位于細(xì)胞質(zhì)中，不受核移植的影響（2） 無(wú)有絲分裂和減數(shù)分裂的周期變化（3） 子代只表達(dá)母方的特征應(yīng)用：母系進(jìn)化研究，缺乏父親的親子鑒定，其他男性伴性遺傳（Y染色體DNA）: （1） Y染色體非重組部分的DNA15列（2）連鎖遺傳（以單倍體形式遺傳）（3）只遺傳給男性子代應(yīng)用：父系進(jìn)化研究，缺乏母親的親子鑒定，性犯罪連鎖（linkage）:每個(gè)染色體上必然集合著許多基因，基因的這種集合叫連鎖。完全連鎖（complete linka

5、ge） :同一條染色體上的兩個(gè)非等位基因，在遺傳過(guò)程中完全不分離的遺傳現(xiàn)象群體：包含同一物種所有的個(gè)體。Hardy-Weinberg群體：在一定地域內(nèi)一群隨機(jī)婚配,飛實(shí)現(xiàn)基因世代傳遞并保持穩(wěn)定的許多個(gè)體的集群。gene Pool（基因庫(kù)）：一個(gè)群體內(nèi)所包含的全部基因的總和遺傳多態(tài)性（genetic polymorphism）:對(duì)一個(gè)群體而言，控制遺傳標(biāo)記的基因座上存在有2個(gè)或2個(gè)以上等位基因，并且等位基因的頻率大于?；蝾l率：群體中某等位基因數(shù)目占該基因座上所有等位基因總數(shù)的百分比?；蛐皖l率：群體中某基因座上的基因型在全部基因型中所占百分比表型頻率：就某一性狀而言，某一表型在群體中所占百分比

6、Hardy-Weinberg平衡定律：群體無(wú)限大；隨機(jī)婚配；沒(méi)有突變；沒(méi)有大規(guī)模的遷移和沒(méi)有選擇因素的影響。結(jié)論是群體中的基因頻率和基因型頻率在逐代傳遞中保持不變。Hardy-Weinberg平衡定律的意義：1.反映基因頻率和基因型頻率的關(guān)系2.群體樣本的檢驗(yàn)。連鎖平衡（linkage equilibrium , LE）:位于不同染色體的基因座，或者位于同一染色體 相距較遠(yuǎn)的基因座之間常常是按照隨機(jī)原則進(jìn)行組合的，呈不連鎖遺傳。這種基因座之間沒(méi)有相關(guān)性的狀態(tài)稱為連鎖平衡連鎖不平衡：在遺傳過(guò)程中，如果不同基因座上的等位基因沒(méi)有按照孟德?tīng)栕杂山M合定律 的隨機(jī)原則組合時(shí)，這些基因座的遺傳則處于一種連

7、鎖不平衡狀態(tài)。雜合度（heterozygosity） :群體中某遺傳標(biāo)記所有基因型中雜合子所占的比例。個(gè)人識(shí)別率（probability of discrimination power, DP）:在群體中隨機(jī)抽取兩個(gè)體，兩者的遺傳標(biāo)記表型不相同的概率。非父排除概率（excluding probability of paternity, PE）: 指孩子的非親生父親的男子，能夠被某個(gè)遺傳標(biāo)記系統(tǒng)排除的概率。第三章DNA多態(tài)性的分子基礎(chǔ)DNA勺分子結(jié)構(gòu)：一級(jí)結(jié)構(gòu)是指 DNA分子中核甘酸的排列順序 （3' ,5 '-磷酸二酯鍵，方向: 5'端-3'端）；二級(jí)結(jié)構(gòu)是指兩

8、條 DNA單鏈形成的雙股螺旋結(jié)構(gòu)；三級(jí)結(jié)構(gòu)則是指雙鏈DNA進(jìn)一步扭曲盤(pán)旋形成的超級(jí)螺旋結(jié)構(gòu)。寡核甘酸：是二至幾十個(gè)核甘酸殘基以磷酸二酯鍵連接而成的線性核甘酸片段。寡核甘酸可由儀器自動(dòng)合成，可作為DNA合成的引物（primer ）、基因探針（probe ）等，在分子生物學(xué)研究中具有廣泛用途。探針probe:標(biāo)記有示蹤物的寡核甘酸片段。通過(guò)與靶DNA寺異性結(jié)合（雜交），檢測(cè)靶DNA分子。引物primer:與模板DNA結(jié)合，引發(fā)DNA的合成反應(yīng)中合成鏈的延伸反應(yīng)。DN防子的理化性質(zhì)：（一）核酸的高分子性質(zhì)：？粘性？酸堿性？紫外吸收（二）DNA的變性和復(fù)性：？變性？復(fù)性？降解 雜交DN儂性denatu

9、ration:在一定條件下，堿基間氫鍵被打開(kāi)，互補(bǔ)DNA雙鏈變?yōu)閮蓷l單鏈的過(guò)程（變性因素：加熱、溶液堿性、有機(jī)溶劑）增色效應(yīng)：在熱變性的過(guò)程中，隨變性溫度升高，DNA的紫外吸收增強(qiáng)，A260值升高融鏈溫度(melting temperature , Tnj):融鏈曲線的中點(diǎn)所示溫度。是一半 DNA發(fā)生變性 時(shí)的溫度。Tm的高低反映了 DNA分子的熱穩(wěn)定性程度的高低(C+G含量越高Tm越高，高離子強(qiáng) 度可以增加溶液中 DNA分子的穩(wěn)定性)。降解：DNA分子的共價(jià)鍵斷裂，形成多個(gè)分子量更小的片段的過(guò)程(法醫(yī)學(xué)意義：高度降解 的DNA片段，有可能使待測(cè)遺傳標(biāo)記發(fā)生破壞，而失去檢測(cè)的價(jià)值)。DNAM性

10、：變性因素撤除后，原變性的兩條互補(bǔ)單DNAt通過(guò)堿基配對(duì)重新結(jié)合為雙鏈DNA的過(guò)程退火：加熱后變性的 DNA在溫度降低過(guò)程中的復(fù)性。復(fù)性的影響因素：1、復(fù)性溫度：高：不易形成氫鍵，不易發(fā)生錯(cuò)配，特異性高。低：氫鍵容易形成，易 發(fā)生錯(cuò)配，特異性差。參考溫度：Tm值下25 c2 、離子強(qiáng)度：離子可以中和單鏈DN焰子中所帶的負(fù)電荷，促進(jìn)單鏈DNA分子之間的聚合高：錯(cuò)配率高、特異性差低：錯(cuò)配率低、特異性高3、DNA分子大小DNA分子序列復(fù)雜程度DN防子濃度雜交：在復(fù)性條件下，來(lái)源不同、但具有同源性的DNAB鏈按堿基配對(duì)原則形成雙鏈DNA分子的過(guò)程。雜交條件的選擇：雜交條件溫度離子強(qiáng)度雜交效果高強(qiáng)度高低

11、錯(cuò)配率低，特異性高低強(qiáng)度低高錯(cuò)配率高，特異性差基因組(genome):細(xì)胞中所有DNA的總稱。突變：遺傳物質(zhì)發(fā)生可遺傳的變異。端粒(telomere ):線性形式基因組 DNA的末端都有一種特殊的結(jié)構(gòu)，是一段DNA和蛋白質(zhì)形成的復(fù)合結(jié)構(gòu)，叫做端粒?；蛲蛔兊姆诸?lèi)：生物體的基因組 DNA并不穩(wěn)定，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)各種各樣的可遺傳的改變， 在子代留下變異的遺傳信息。在DNA分子水平，DNA損傷的后果之一就是突變( mutation )。主要分為編碼區(qū)堿基突變 和非編碼區(qū)突變 兩種。編碼區(qū)堿基突變：堿基替代在基因組中是最常 見(jiàn)的突變形式，分轉(zhuǎn)換(transition )和顛換(transversion )

12、兩種。非編碼區(qū)突變：非編碼 區(qū)DNA沒(méi)有表達(dá)產(chǎn)物，DNA復(fù)制中也能夠出現(xiàn)堿基的錯(cuò)配、插入和缺失，但是對(duì)細(xì)胞正常生理過(guò) 程不構(gòu)成實(shí)質(zhì)性影響。無(wú)論在編碼區(qū)或非編碼區(qū)，突變的后果從沒(méi)有效應(yīng)到有害效應(yīng)和有利效應(yīng)， 各種情況都會(huì)出現(xiàn)。堿基替換：堿基轉(zhuǎn)換、堿基顛倒堿基序列改變基因突變、堿基排列改變：倒位、易位 堿基數(shù)目改變：插入、缺失、重復(fù)同義突變(same sense mutation ):是指DNAt1成變了，但密碼子沒(méi)有改變，或密碼子雖 然不同，但編碼產(chǎn)生同一種氨基酸，這種突變又稱中性突變。錯(cuò)義突變(missence mutation ):是指DNA組成改變使編碼一種氨基酸的密碼子改變成編 碼另一種

13、氨基酸的密碼子。無(wú)義突變(nonsense mutation ):是指某一堿基的替換使氨基酸密碼子變?yōu)榻K止密碼，可 過(guò)早地終止轉(zhuǎn)錄，形成無(wú)活性的肽鏈。移碼突變(frameshift mutation ) : DNA鏈上插入或缺失一個(gè)或n個(gè)核甘酸，使下游密碼子閱讀框發(fā)生變化，導(dǎo)致在插入或缺失部位以后的編碼發(fā)生相應(yīng)改變。終止密碼突變：是DN防子中的某一終止密碼突變?yōu)榫幋a氨基酸的密碼子，從而使多肽鏈 的合成至此仍繼續(xù)下去，直至下一個(gè)終止密碼為止，形成超長(zhǎng)的異常多肽鏈。沉默突變（silent mutation ）:僅改變表達(dá)產(chǎn)物的單個(gè)氨基酸，對(duì)蛋白質(zhì)的生理功能沒(méi)有 影響的點(diǎn)突變，是形成蛋白質(zhì)多態(tài)性的主

14、要原因。DNA態(tài)性：基因組中，由不同堿基構(gòu)成的等位基因所形成的多態(tài)性叫做DNA多態(tài)性DNA£度多態(tài)性：同一基因座上各等位基因之間的DNA片段長(zhǎng)度差異構(gòu)成的多態(tài)性可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列VNTR :通常把小衛(wèi)星 DNA中的可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列稱為VNTR短串聯(lián)重復(fù)序列 STR:把微衛(wèi)星的可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列稱為短串聯(lián)重復(fù)序列STRo是目前在法醫(yī)物證學(xué)中應(yīng)用最廣泛的長(zhǎng)度多態(tài)性遺傳標(biāo)記。它的重復(fù)單位短，僅1-6bp ,其長(zhǎng)度多態(tài)性來(lái)源于重復(fù)單位串聯(lián)重復(fù)次數(shù)的個(gè)體差異。4bp重復(fù)的STR基因座最常用。篩選STR基因座的條件： 等位基因長(zhǎng)度在 300bp以下；重復(fù)單位為四核甘酸，不含有插入的非重復(fù)

15、單位堿基；等位基因數(shù)812個(gè)； 基因座雜合度以上，個(gè)體識(shí)別能力大于；基因頻率分別比較平均，沒(méi)有特別高的或特別低的頻率的等位基因；PCRT增溫度，突變率低。單核甘酸多態(tài)性（SNPs）:在人類(lèi)基因組范圍內(nèi)，如果任何單堿基突變使特定核甘酸位置 上出現(xiàn)兩種堿基其中最少的一種在群體中的頻率不少于1 % ,就形成單核甘酸多態(tài)性。第四章DNA長(zhǎng)度多態(tài)性限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（RFLP）RFLP分析是一種傳統(tǒng)的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，廣泛應(yīng)用于突變分析、基因診斷、基因定位等各個(gè)方面。法醫(yī)物證鑒定應(yīng)用RFLP技術(shù)主要是對(duì)人類(lèi)基因組中的VNTRg因座進(jìn)行分型，其技術(shù)核心是 DNA分子雜交，決定RFLP分析圖譜個(gè)體特

16、異性 的因素是限制性核酸內(nèi)切酶的特異性和探針的特異性。檢測(cè)所用的探針多是由人類(lèi)基因組DNA中篩選出的小衛(wèi)星序列，選擇特異性不同的探針，在不同的雜交條件下，可以只檢出單個(gè)VNTR基因座，也可同時(shí)檢出多個(gè)VNTRg因座，前者稱為|DNA紋印后者稱之為|DNA指紋檢測(cè)所用的相應(yīng)探針?lè)謩e被稱為單基因探針（single-locus probe ）禾口多基因探針 （multi-locus probe）?；炯夹g(shù)：DNA提取、純化和定量限制性核酸內(nèi)切酶酶切電泳分離印跡轉(zhuǎn)移探針選擇一單基因座探針（DNAM印），多基因座探（DNA指紋）探針標(biāo)記分子雜交譜帶顯示限制性酶選擇要求：識(shí)別序列位于 VNTR兩側(cè)，盡量靠

17、近VNTR 酶活性、特異性穩(wěn)定， 反應(yīng)條件容易控制；不受基因組DNA是否甲基化的影響。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR :類(lèi)似半保留復(fù)制，在體外以基因組DNA為模板，以一對(duì)寡核甘酸為引物，dNTP為原料，在Taq DNA聚合酶的催化下，經(jīng)過(guò)變性、退火和引物延伸三步循環(huán)使目 標(biāo)片段得到復(fù)制百萬(wàn)倍。PCR反應(yīng)體系：模板DNA寡核甘酸引物， dNTP,反應(yīng)緩沖 液，TaqDN咪合酶。循環(huán)參數(shù)：溫度、時(shí)間PC毗術(shù)特點(diǎn)：靈敏度高 特異性高 適用于降解 DNA僉材種屬特異性好操作簡(jiǎn)單，時(shí)間短儀器自動(dòng)完成 污染 樣本要求影響因素多復(fù)合擴(kuò)增：經(jīng)過(guò)篩選的STR基因座，擴(kuò)增條件基本相同，可以在同一個(gè)PCR體系中擴(kuò)增多個(gè) 靶

18、基因座，叫作復(fù)合擴(kuò)增。應(yīng)用于法醫(yī)的STR應(yīng)滿足條件： PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度在 300bp以下； 宜選擇四核甘酸 STR基因組； 選多個(gè)STRg因座應(yīng)不在同一條染色體上； 每個(gè)STR基因座等位基因數(shù) 8-10個(gè)左右； 基因頻率分布均勻，沒(méi)有高或低頻基因出現(xiàn)； 雜合度高，最好大于； 低突變率<%。不同DNA長(zhǎng)度分析技術(shù)比較：不同DNA長(zhǎng)度分析技術(shù)綜合評(píng)價(jià)：1 一一 一 一* 不同DNA長(zhǎng)度分析技術(shù)綜合評(píng)價(jià)一I一獷噌片 設(shè)長(zhǎng)度要態(tài)性華裊因星探軒萋基因厘振針Amp FLPUNA prot 11 tign科“ f > flgtrjri nt n£VNTR就STRDNR續(xù)守TINA我紋

19、STR分型用于法醫(yī)物證鑒定的主要優(yōu)點(diǎn)：1、高靈敏度：適用于微量降解檢材。2、高鑒別能力：節(jié)約檢材、試劑和提高效率。3、標(biāo)準(zhǔn)化分型：實(shí)現(xiàn)數(shù)字化結(jié)果，利于實(shí)驗(yàn)室間數(shù)據(jù)交換，建立數(shù)據(jù)庫(kù)。miniSTR :通過(guò)重新設(shè)計(jì)引物，使其結(jié)合在更靠近核心重復(fù)區(qū)的側(cè)翼序列，從而降低擴(kuò)增產(chǎn) 物的大小，進(jìn)一步提高靈敏度和分型成功率，這種技術(shù)稱為短片段STR分型或二miniSTR分型。miniSTR的優(yōu)勢(shì)：？STR基因座的擴(kuò)增片段較短，靈敏度更高，尤其適用于極微量或嚴(yán)重 降解生物檢材的 DNA分型；？等位基因片段長(zhǎng)度范圍較窄，不易發(fā)生因小等位基因的優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增而造成的等位基因丟失現(xiàn)象；？可對(duì)多個(gè)STR基因座進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，從

20、而節(jié)約檢材、降低成本，提高單次檢測(cè)的信息量miniSTR分型的局限性：1、因擴(kuò)增片段長(zhǎng)度的限制，構(gòu)建復(fù)合擴(kuò)增體系時(shí)只能同時(shí)擴(kuò)增較少的基因座(通常每種顏 色的熒光標(biāo)記的基因座不超過(guò)2個(gè))。要想達(dá)到與傳統(tǒng)的商品化試劑盒接近的個(gè)人識(shí)別能力，必須增加復(fù)合擴(kuò)增的次數(shù)。2、miniSTR引物與傳統(tǒng)的引物結(jié)合區(qū)之間若存在堿基的插入和缺失，易導(dǎo)致miniSTR與傳統(tǒng)STR分型結(jié)果的不一致。3.若某些STR基因座核心重復(fù)區(qū)上游或下游側(cè)翼序列存在喋吟或嗒咤堿基堆積現(xiàn)象，則不 利于miniSTR引物設(shè)計(jì)。4、當(dāng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物過(guò)小時(shí)，未消耗引物上的染料分子或稱“染料污斑” (dyeblobs )可使產(chǎn)物峰變寬、信號(hào)變

21、弱。這種影響在檢測(cè)降解生物樣本時(shí)更為明顯。Y-STR有何法醫(yī)學(xué)應(yīng)用特點(diǎn)：1、Y染色體為男性特有2、Y-STR呈父系遺傳特征3、單倍體遺傳：在減數(shù)分裂過(guò)程中，Y-特異性區(qū)不發(fā)生重組，所有 Y-STR基因座均呈連鎖遺傳，等位基因頻率不能以相乘方法計(jì)算4、GD=PE5、結(jié)果不具有唯一性，不能認(rèn)定。其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值在于排除Y-STR分型中需要注意的問(wèn)題：因?yàn)閄和Y染色體部分序列具有高度相似性，有些Y-STR分型時(shí)在X染色體上也能檢出擴(kuò)增產(chǎn)物男性個(gè)體可見(jiàn)額外的產(chǎn)物峰，女性個(gè)體 也可有分型結(jié)果。部分 Y-STR基因座，有時(shí)可檢出二個(gè)或三個(gè)等位基因，易被誤認(rèn)為不同男性的混合樣本。第五章STR自動(dòng)分型STR自

22、動(dòng)分型技術(shù)的主要步驟：1、DNA自動(dòng)化提取 2、PCR多色熒光標(biāo)記 STR復(fù)合擴(kuò)增 3、PCR產(chǎn)物電泳前處理4、自動(dòng)毛細(xì)管電泳結(jié)合激光誘導(dǎo)的熒光檢測(cè)5、自動(dòng)數(shù)據(jù)采集并分型off-ladder :在STR分型圖譜中，常會(huì)遇到部分樣本的少量片段峰未被程序化數(shù) 字命名，在分型圖譜中被標(biāo)識(shí)為 off-ladder 。漂移作用和新等位基因都可標(biāo)識(shí)為off-ladder低拷貝 DNA(low copy number , LCN):是指基因組含量小于100Pg的樣本。第六章DNA序列多態(tài)性PCR循環(huán)測(cè)序的基本原理：PC砒術(shù)能夠快速、特異性地?cái)U(kuò)增靶 DNA應(yīng)用PC故術(shù)測(cè)定DNA 序列分為兩個(gè)步驟：先利用PCR

23、擴(kuò)增靶序列片段，制備測(cè)序模板，然后再利用PCR直接測(cè)定序列。 PCR測(cè)序采用了熱循環(huán)高效合成DNA的特性并結(jié)合雙脫氧核甘酸終止法，使引物鏈終止的延伸產(chǎn)物數(shù)量在熱循環(huán)過(guò)程中得到增加，因此稱為循環(huán)測(cè)序。每個(gè)測(cè)序循環(huán)包括：PCR擴(kuò)增制備的模板DNA變性成單鏈形式；標(biāo)記引物與其中的一條鏈上的互補(bǔ)序列退火；退火后的引物在耐熱DN砥合酶催化下發(fā)生鏈延伸終止反應(yīng)。本次循環(huán)產(chǎn)生的模板鏈與延伸終止鏈形成的雙鏈的產(chǎn) 物，在下一輪測(cè)序循環(huán)中，再次被變性，釋放出模板鏈,作為又一輪引發(fā)反應(yīng)的模板，同時(shí)積累 下一輪循環(huán)產(chǎn)生的鏈終止產(chǎn)物。上述循環(huán)步驟重復(fù) 2040次，使鏈終止產(chǎn)物以線性方式獲得擴(kuò)增。DNA自動(dòng)測(cè)序技術(shù)：DN

24、A自動(dòng)測(cè)序技術(shù)是以 4種熒光染料基團(tuán)分別作為4種ddNTP終止鏈的標(biāo)記物，于20世紀(jì)80年代末期建立的一種高效、快速、自動(dòng)化的序列測(cè)定技術(shù)。4種熒光染料分別作為測(cè)序反應(yīng)中 4種ddNTP終止鏈的標(biāo)記物，即4種被雙脫氧核甘酸終止的DNA片段分別帶上4種不同的顏色。這些DNA片段的混合物同時(shí)加在一個(gè)樣品槽中電泳展開(kāi)，相互間僅差1個(gè)堿基的DNA片段形成一條具有 4種顏色的階梯分布圖像。階梯中的每-DNA片段由標(biāo)記在該片段上的特征性熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光所指示。熒光染料基團(tuán)作為標(biāo)記物的基本要求是經(jīng)過(guò)激光誘發(fā)的吸收光譜波長(zhǎng)在可見(jiàn)光波長(zhǎng)范圍內(nèi)， 不影響延伸反應(yīng)，不影響標(biāo)記后 DNA片段的電泳性質(zhì)。其次要求4種

25、熒光的吸收和激發(fā)光波長(zhǎng)要 有足夠的差異，便于檢測(cè)。熒光染料的摻入的方式有兩種：一種是將熒光染料預(yù)先標(biāo)記在測(cè)序反應(yīng)通用引物的5'端。4種熒光標(biāo)記形成 4種標(biāo)記引物，測(cè)序反應(yīng)分4個(gè)反應(yīng)管進(jìn)行，特定的熒光染料與相應(yīng)的 ddNTP是對(duì)應(yīng)關(guān)系，例如熒光示蹤染料 JOE標(biāo)記的通用引物總是與 ddATP加在同 一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)，因此由ddATP終止的所有延伸鏈都帶有JOE這種方式被稱為 Dye-Primers。另一種是將熒光染料基團(tuán)連在ddNTP上，4種熒光染料分別與 4種ddNTP底物連接，反應(yīng)產(chǎn)生的4組DNA片段分別由特定 ddNTP所終止，并且標(biāo)記有 4種不同的熒光發(fā)色基團(tuán)，A、C G和T分別攜帶

26、有綠、紅、藍(lán)、黃 4種熒光。這種方式被稱為Dye-Terminators 。兩種方式各有特點(diǎn)，不過(guò)前者要求A, G C, T分4個(gè)反應(yīng)進(jìn)行，而后者的4組反應(yīng)可以在同一管中完成。上述兩種方法都能確定4種熒光與4種ddNTP所終止的DNA片段之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，這是后來(lái)從電泳中檢測(cè)標(biāo)記 物信號(hào)以及最終讀序的基礎(chǔ)。自動(dòng)測(cè)序儀器無(wú)論是變性PAG平板凝膠電泳還是毛細(xì)管電泳，都配置有激光束激發(fā)系統(tǒng)和熒光信號(hào)收集檢測(cè)系統(tǒng)。當(dāng)DNA片段電泳通過(guò)檢測(cè)窗口時(shí)，在激光束的激發(fā)下， 片段的電泳時(shí)間和被激發(fā)熒光的波長(zhǎng)、 強(qiáng)度等信號(hào)都被記錄，由計(jì)算機(jī)自動(dòng)作數(shù)據(jù)處理，最后在屏幕上顯示每一樣品的各終止片段電泳分離的模擬圖像。不同

27、顏色的峰標(biāo)示各自標(biāo)記的堿基及其排列順序（如圖所示）：MVP （ minisatellite variant repeat）序列：稱為具有變異核心序列的小衛(wèi)星DNA是一類(lèi)既有長(zhǎng)度多態(tài)性又有序列差異的DNA重復(fù)序列。線粒體DNA勺特點(diǎn)：人類(lèi)線粒體的基因排列得非常緊湊，除與mtDNAM制及轉(zhuǎn)錄有關(guān)的一小段區(qū)域外，無(wú)內(nèi)含子序列。mtDNA為高效利用DNA有5個(gè)閱讀框架，缺少終止密碼子，僅以U或UA結(jié)尾。mtDNA的突變率高于核中 DNA并且缺乏修復(fù)能力。 mtDNA為母系遺傳。部 分mtDNA的密碼子不同于核內(nèi) DNA的密碼子。血型（blood group）：是人類(lèi)血液由遺傳控制的個(gè)體性狀之一，是血液

28、的遺傳標(biāo)記 （geneticmarker ）。紅細(xì)胞血型是指紅細(xì)胞表面抗原由遺傳決定的個(gè)體差異化學(xué)結(jié)構(gòu)抗原分布紅細(xì)胞膜上分泌液中血漿中糖脂質(zhì)HAB PILea、 Leb莫內(nèi)蛋白R(shí)h、Kell糖蛋白（寡糖+多肽）MN HLAHAB Lea、Leb蛋白質(zhì)Gm KmABO血型（重點(diǎn)）：ABO血型系統(tǒng)是最早發(fā)現(xiàn)，最重要的血型系統(tǒng)。人類(lèi)學(xué)與遺傳學(xué)研究、器官移植，以及法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中的個(gè)人識(shí)別與親子鑒定均需應(yīng)用這個(gè)系統(tǒng)。一、ABO血型.4種普通血型的劃分及存在相應(yīng)的抗體1 .紅細(xì)胞ABO血型系統(tǒng)的分型。 ABO血型系統(tǒng)分四種型：即 O型、A型、B型與AB型2 .四種血型個(gè)體血清中存在的相應(yīng)抗體：血清中有天然抗

29、體，B型血清中有抗A抗體；A型血清中有抗B抗體；O型血清中有抗A、抗 B及抗 A, B等抗體；AB型血清中沒(méi)有抗體ABO血型抗體恒定地存在于正常人的血清中，可以預(yù)測(cè)其存在，故稱為規(guī)則抗體。3 .正常的A、B、AB、O型的檢測(cè)。利用抗 A與抗B血清，以及A與B型紅細(xì)胞，可以測(cè)定未 知血液的ABO血型。.二、ABO血型抗體.正常情況下，凡紅細(xì)胞沒(méi)有某一種或某兩種ABO抗原，又無(wú)明顯的外來(lái)A或B抗原的刺激，其血清中含有與紅細(xì)胞上缺失抗原相對(duì)應(yīng)的天然抗A、抗 A 1或抗B抗體。.（一）抗A、抗B抗體的生成.新生兒血中的IgG抗 A與抗 B抗體多來(lái)自母體， 故一般不對(duì)新生兒進(jìn)行血型測(cè)定。36個(gè)月以內(nèi)的嬰

30、兒，多數(shù)尚未產(chǎn)生抗A與抗 B抗體；6個(gè)月以后，抗體逐漸產(chǎn)生；510歲抗體效價(jià)達(dá)最高峰；隨著年齡的增長(zhǎng)，抗體效價(jià)逐漸降低，老年人抗體水平明顯地低于年輕的成年 人。.（二）抗A、抗B抗體的特性.1、抗A與抗B抗體最顯著的血清效應(yīng)是凝集反應(yīng)，在適當(dāng)?shù)臈l件下也可以發(fā)生溶血反應(yīng)；.2、ABO血型測(cè)定都在室溫中（2225C）進(jìn)行，偶爾在 4 c下進(jìn)行；.3、抗A和抗B抗體可以是天然的，也可以是免疫抗體；4、B型與A型血液中的天然抗 A與抗B抗體大多數(shù)是IgM；.5、天然IgM與IgG抗 A與抗 B抗體均能在鹽水介質(zhì)中使紅細(xì)胞發(fā)生凝集反應(yīng)，在室溫 中具有抗體活性。.（三）抗H抗體.由于Q A、B或AB型紅細(xì)

31、胞結(jié)構(gòu)上含有 H成分，故其血清中很少有抗H抗體。.三、ABO血型的遺傳.（一）各種不同表型的雙親所生子女的血型。ABO血型系統(tǒng)按孟德?tīng)柖蛇z傳，人類(lèi)染色體上的一個(gè)座位為 所占，每一個(gè)體有一對(duì)染色體，一條來(lái)自父親，另一條來(lái)自母親， 定。ABO血型有4種普通型，由復(fù)等位基因.A、B及O.所控制, 四種表現(xiàn)型、六種基因型，一個(gè)基因座位，三個(gè)等位基因。（二）ABO血型按孟德?tīng)栆?guī)律遺傳 .A、B、O.三個(gè)等位基因之一紅細(xì)胞ABO型的表達(dá)由基因決有6種基因型，決定4種表現(xiàn)型。何謂ABO血型的正反定型？正定性試驗(yàn)：根據(jù) RBCW特異性抗體的反應(yīng)來(lái)分型，即用抗A抗體判定A抗原，用抗B抗體判定B抗原。反定型試驗(yàn)

32、：依據(jù)血?t中的凝集素與標(biāo)準(zhǔn)型RBC膜上的凝集原反應(yīng)的性質(zhì)，即用標(biāo)準(zhǔn)的A型RBC判定抗A抗體，用標(biāo)準(zhǔn)的B型RBC判定抗B抗體，同時(shí)也應(yīng)用抗 H抗體判定 H抗原。試述ABO血型的DNA分型方法 PCR-SSP序列特異性引物 PCR技術(shù)：特異性強(qiáng)、重復(fù)性好； PCR-RFLPRh血型凡是人體血液紅細(xì)胞上有Rh凝集原者，為 Rh陽(yáng)性。反之為陰性。這樣就使已發(fā)現(xiàn)的紅細(xì)胞 A、B O及AB四種主要血型的人，又都分別一分為二地被劃分為Rh陽(yáng)性和陰性兩種。在中國(guó)，Rh陰性血型只占千分之三到四。RH陰性A型、B型、O型、AB型的比例是3: 3: 3: 1。Rh血型鑒定：RhD抗原分布：Rh血型鑒定一般指 Rh

33、系統(tǒng)中D抗原的檢測(cè)， 根據(jù)病人紅細(xì)胞是否帶有D抗原分為Rh陽(yáng)性和Rh陰性。Rh血型鑒定正常值： Rh+,稱作“ Rh陽(yáng)性”、“ Rh顯性”，表示人類(lèi)紅細(xì)胞有“ Rh因子”；Rh-,稱作“ Rh陰性”，“ Rh 隱性”，表示人類(lèi)紅細(xì)胞沒(méi)有“Rh因子”。HLA （human leukocyte antigen ）抗原：即人類(lèi)白細(xì)胞抗原，是人類(lèi)最復(fù)雜的顯性遺傳多 態(tài)性系統(tǒng)，也是迄今為止人類(lèi)基因組中密度最高的區(qū)域。HLA系統(tǒng)具有極其重要的功能，如抗原的加工、呈遞，控制免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞間相互作用，對(duì)異體移植物的排斥，腫瘤監(jiān)視，參 與大量的自身免疫性疾病的發(fā)生。人類(lèi)白細(xì)胞膜上的抗原分為三類(lèi)：是紅細(xì)胞

34、血型抗原，如ABH Lea、Leb、Jka、K、k、Dib等；是白細(xì)胞本身特有的抗原，如 CD4 CD8 Leu8等； 是與其他組織共有的，也是最強(qiáng)的同種抗原，即人類(lèi)白細(xì)胞抗原。HLA抗原的結(jié)構(gòu)和分布：HLA-I類(lèi)和HLA-II類(lèi)抗原存在于細(xì)胞表面，為跨膜蛋白質(zhì)，均為異二聚體蛋白。HLA-I類(lèi)抗原分布廣泛，幾乎存在于所有的有核細(xì)胞表面，以淋巴細(xì)胞上的密度最 高；含有HLA-II類(lèi)抗原的組織比I類(lèi)抗原少得多，密度最高者為樹(shù)突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞，一些 吞噬細(xì)胞亞群及 B細(xì)胞。結(jié)構(gòu)：HLA-I類(lèi)基因產(chǎn)物為 HLA-A、B和C抗原，由重鏈和輕鏈兩條多 肽鏈構(gòu)成；HLA-II類(lèi)基因產(chǎn)物為 HLA-DR D

35、Q DP抗原，均為跨膜糖蛋白，由a和0兩條鏈構(gòu)成。HLA遺傳：HLA基因定位于6號(hào)染色體，占整個(gè)人類(lèi)基因組全部堿基序列的 HLA區(qū)主要有HLA-I、II、III類(lèi)基因座。表現(xiàn)為：共顯性遺傳、單倍型遺傳、連鎖不平衡。HLA遺傳特征：共顯性遺傳：每個(gè) HLA基因座表達(dá)一對(duì)抗原，人類(lèi)HLA每個(gè)基因座上有眾多等位基因。故如果血清學(xué)方法分型時(shí),個(gè)體只檢測(cè)出了一個(gè)抗原則有三種可能：該抗原的純合子、HLA血清板不完全、存在一種至今尚未發(fā)現(xiàn)的抗原。單倍型遺傳：?jiǎn)伪扼w是指一條染色體 上HLA各基因座的基因緊密連鎖組成的基因遺傳單位。連鎖不平衡：HLA在實(shí)際群體調(diào)查發(fā)現(xiàn)，各基因座的基因并非完全隨機(jī)組成單倍型，有些

36、單倍型觀察頻率高于期望頻率或低于期望頻率， 這種現(xiàn)象稱為連鎖不平衡。處于連鎖部平衡狀態(tài)說(shuō)明HLA不同基因座的基因之間存在關(guān)聯(lián)，具有一同遺傳的趨向。 HLA高多態(tài)性。HLA抗原的分布：HLA-I類(lèi)抗原：分布廣發(fā)，幾乎存在于所有的有核細(xì)胞表面，以淋巴細(xì) 胞上的密度最高；成熟RBC上沒(méi)有HLA-A、B、和DR抗原，幼稚 RBC去口有；HLA-II類(lèi)抗原：密度最高者為 DC單核細(xì)胞，一些吞噬細(xì)胞亞群及B細(xì)胞；II類(lèi)抗原作為一種分化抗原在不同細(xì)胞上表達(dá)，大多數(shù)骨髓分化細(xì)胞具有HLA-II類(lèi)抗原。HLA命名原則：以大寫(xiě)字母 A、D、C. 表示HLA遺傳區(qū)域中的座位； HLA抗原特異性 用數(shù)字表示；為防止與補(bǔ)體組分命名相混淆，HLA-C抗原特異性以Cw為字首命名；HLA基因命名一般以4位數(shù)字表示，其中前2位數(shù)字表示對(duì)應(yīng)最相近的HLA抗原特異性，后2位數(shù)字則用于表示亞型的等位基因，如 A*0101 ;如果出現(xiàn)第五位數(shù)字，則代表“沉默取代”，即該基