淀粉酶活性測定

1、淀粉酶活力測定及性質研究佟玥姍（東北農業(yè)大學，生命科學學院，生物科學，黑龍江省，哈爾濱市，150030） 摘要：本文以小麥為原料進行試驗，分別采用凝膠擴散法，3,5二硝基水楊酸比色法測定小麥淀粉酶活性和總酶活性。首先，制作麥芽糖標準曲線，提取淀粉酶粗酶液，從溫度、PH、激活劑及抑制劑對淀粉酶活性的影響。然后，通過剩余淀粉的含量判斷淀粉酶水解效果，淀粉遇碘變藍，顏色越深，淀粉含量高，淀粉酶活性越低。結果表明，40時酶活性最佳，PH=5.6是淀粉酶最適溫度，氯離子是淀粉酶的激活劑，銅離子是淀粉酶的抑制劑。Taking wheat as raw material to test and gel di

2、ffusion method were used respectively, 3, 5-2 nitro salicylic acid colorimetric method to determine the wheat a - amylase activity and total enzyme activity. First, the production of maltose standard curve, extracting amylase thick enzyme fluid, from temperature, PH, the influence of activator and i

3、nhibitor on the amylase activity. Then, by the content of residual starch amylase hydrolysis effect, starch iodine blue in color, high starch content, the lower the amylase activity. The results showed that the activity of 40 best, PH = 5.6 is the optimum temperature for amylase, chloride ion is the

4、 activator of amylase, copper ion is amylase inhibitors. 關鍵詞：淀粉酶活性；最適PH，最適溫度；激活劑及抑制劑引言： 小麥是我國乃至全世界的主要糧食作物之一,其種植歷史長、范圍廣,因而對于小麥品質的研究具有廣泛的意義。在小麥的收獲季節(jié),遇到連綿陰雨天,就會出現(xiàn)大量的穗上發(fā)芽的現(xiàn)象,使小麥的品質嚴重下降,明顯降低小麥的食用品質和工藝品質. 據(jù)報道,加拿大年產小麥約2500 萬t.。芽麥率嚴重時可達15%,澳大利亞也有相似的芽麥率,歐洲幾乎每年的芽麥率都相當高。 在我國也經常出現(xiàn)這種情況a -淀粉酶只有在小麥發(fā)芽時才能大量產生。正常情況下,

5、小麥籽粒中缺少a-淀粉酶,a-淀粉酶的活性與發(fā)芽時的溫度、發(fā)芽時間存在著密切的關系。 同時發(fā)芽小麥中由于a-淀粉酶活性很高,淀粉便會在a-淀粉酶的作用下分解成小分子,再進一步水解成糖類,所以低分子糖類含量也相應較高。本課題研究淀粉酶活性受溫度，PH值，激活劑及抑制劑的影響?！?】1 實驗材料與方法11材料 小麥（Triticum aestivum L.）、電子天平、研缽、容量瓶、量筒、刻度試管、試管、移液管、離心機、離心管、恒溫水浴鍋（40度、100度）、分光光度計、1淀粉溶液、0.4mol/L NaOH、pH=3.0、5.6、8.0的檸檬酸緩沖液1. 2方法1.2.1麥芽糖標準曲線的制作取7

6、支干凈的具塞刻度試管，分別編號1、2、3、4、5、6、7。依次分別加入麥芽糖標準液0mL、0.2mL、0.6mL、1.0mL、1.4mL、1.8mL、2.0mL，蒸餾水2.0mL、1.8mL、1.4mL、1.0mL、0.6mL、0.2mL、0mL，3,5-二硝基水楊酸各2.0mL。（麥芽糖含量依次為0mg、0.2mg、0.6mg、1.0mg、1.4mg、1.8mg、2.0mg）藥品加好后搖勻，置于水浴中煮沸5min，取出后流水冷卻，加蒸餾水定容至25mL，以1號管作空白調零點在520nm波長下比色測定光密度，以麥芽糖含量為橫坐標，光密度為縱坐標，繪制標準曲線。1.2.2淀粉酶粗酶液的提取稱取0

7、.5克萌發(fā)的小麥種子（芽長1cm左右）至研缽中加1g石英砂，研磨成勻漿，倒入25ml具塞刻度的試管中，用蒸餾水稀釋至刻度線處，混勻后在室溫（20）下靜置，每隔數(shù)分鐘震蕩一次，放置5分鐘后，開始離心（4000r/min）10分鐘，取上清液備用。溫度對酶活性影響 準備8支試管分別編號A、a、B、b、C、c、D、d，分別在A、B、C、D管中加入PH=5.6的緩沖液檸檬酸1ml，淀粉溶液2.5ml;在a、b、c、d管中加入淀粉酶提取液1ml，分別把A、a管放在4冷凍箱中,把B、b管放在室溫下,把C、c管放在40水浴中,把D、d管放在沸水浴中,10min鐘后把A管中的溶液倒入a管, 把B管中的溶液倒入b

8、管, 把C管中的溶液倒入c管, 把D管中的溶液倒入d管,再把a管放在4冷凍箱中,把b管放在室溫下,把c管放在40水浴中,把d管放在沸水浴中,進行酶促反應10min;最后在a、b、c、d管中加入碘液各3滴,并觀察顏色變化情況。溫度對酶活性的影響管號AaBbCcDd緩沖液（pH5.6）（mL）1.01.01.01.0淀粉溶液（mL）2.52.52.52.5淀粉酶提取液（mL）1.01.01.01.0預保溫（10min）4 Aa4室溫Bb室溫40Cc40沸水浴Dd沸水浴混合酶促反應KI溶液各1-2滴（滴管先冷卻至室溫）顯色藍色藍色無色深藍色 PH值對酶活性影響 準備三支試管分別編號、,在、管中分別加

9、入PH=3.0、PH=5.6、PH=8.0的緩沖液檸檬酸2ml,淀粉溶液2.5ml,淀粉酶提取液1ml;最后各管混勻，放在40水浴中進行酶促反應10min,各加入碘液3滴，并觀察顏色變化情況。pH對淀粉酶活性的影響操作管號緩沖液（pH5.6）（mL）2.0/（pH3.0）2.0/（pH5.6）2.0/（pH8.0）淀粉溶液（mL）各2.5mL淀粉酶提取液（mL）各1.0mL酶促反應搖勻，40水浴10min碘液各三滴顯色藍色無色藍色 激活劑或抑制劑對酶活性影響 準備4支試管分別編號1、2、3、4, 第一步在1、2、3、4管中分別加入PH=5.6的緩沖液檸檬酸2ml;在1管中加入NaCl溶液1ml

10、，在2管中加入CuSO4溶液1ml，在3中加入NaSO41ml，在4管中加入蒸餾水1ml，分別中加入0.1%的淀粉溶液2.5ml;分別在4只管中加入淀粉酶提取液1ml;最后各管混勻，放在40水浴中進行酶促反應10min,各加入碘液3滴，并觀察顏色變化情況。 激活劑和抑制劑對淀粉酶活性的影響管號123 44緩沖液（mL）各2.0mLNacl溶液（mL）1.0CuSO4溶液（mL）1.0NaSO4溶液（mL）1.0蒸餾水1.0淀粉溶液（mL）各2.5mL淀粉酶提取液（mL）各1.0mL酶促反應搖勻，40水浴10min碘液各3滴顯色透明淡藍蘭較渾較透明小麥種子淀粉酶比活力的測定 取6支試管，編號，按

11、下表操作酶活力的測定操作項目-淀粉酶活力測定總淀粉酶活力測定-1-2-3-4-5-6淀粉酶原液/mL1.01.01.0000鈍化-淀粉酶置70水浴15min，冷卻淀粉酶稀釋液/mL0001.01.01.0預保溫將各試管和淀粉酶置于40恒溫水浴中保溫10minpH5.6緩沖溶液/mL1.01.01.01.01.01.0NaOH溶液/mL4.0004.0001%淀粉溶液/mL2.02.02.02.02.02.0保溫在40恒溫水浴中準確保溫5minNaOH溶液/mL04.04.004.04.0 將各試管搖勻，分別取2mL，放入25mL刻度試管中，再加入2mLDNS試劑搖勻，置沸水浴中煮沸5min，取

12、出冷卻，用蒸餾水稀釋至25mL混勻，在分光光度計上520nm處進行比色，測定光密度，記錄測定結果。2. 結果2.1麥芽糖標準曲線的制作原始數(shù)據(jù)試管00.20.611.41.82吸光值00.0330.1940.3460.5390.6580.7382.2溫度對淀粉酶的活性的影響1）4：酶的活性幾乎完全被抑制，淀粉未被水解，加入碘液后呈藍色；2）室溫：酶的活性受到一定的抑制，淀粉被部分水解，加入碘液后呈藍色；3）40：酶的活性達到相對最大，淀粉完全被水解，加入碘液后接近無色；4）沸水?。好竿耆Щ?，淀粉未被水解，加入碘液后呈深藍色；由此可以看出40是小麥淀粉酶的最適溫度。（從右向左）2.3 pH對淀

13、粉酶的活性的影響1）PH=3.0：淀粉酶完全失活，淀粉未被水解，加入碘液后呈深藍色2）PH=5.6：淀粉酶活性達到相對最大，淀粉被完全水解，加入碘液后呈淡藍色3）PH=8.0：酶活性受抑制，淀粉被少量水解，加入碘液后呈藍黑色由此可以看出pH=5.6是小麥淀粉酶的最適PH（從左向右）2.4激活劑與抑制劑對淀粉酶的活性的影響1）空白對照組：加入碘液后呈藍紫色2）加CuSO4的溶液：淀粉酶活性降低，淀粉被部分水解，加入碘液后呈深藍色3）加NaCl的溶液：淀粉酶活性增加，使淀粉完全水解，加入碘液后呈無色由此可以看出NaCl是小麥淀粉酶的激活劑；CuSO4小麥淀粉酶的抑制劑（從右向左）2.5 淀粉酶活力

14、的測定淀粉酶活性= A樣品稀釋倍數(shù)X定容體積 樣品重*CA:2、3管淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖量平均值 4、5管淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖量平均值C：比色所用樣品的毫升數(shù)總淀粉酶含量：218.75 mg/FW(g)5min3.實驗討論3.1結果總結與分析 1、由上述圖片和數(shù)據(jù)可知，淀粉酶活性受溫度的影響很明顯，在一定的范圍內，溫度升高，淀粉酶活性增強，二者呈現(xiàn)線性關系。當溫度達到40后，溫度和淀粉酶活性的關系呈曲線，隨著溫度的上升，淀粉酶的活性增強不明顯，甚至出現(xiàn)減弱的現(xiàn)象。淀粉酶的最適PH值為5.6，在PH值為3.0和8.0時，淀粉酶的活性均小于PH為5.6。淀粉酶活性的抑制劑是銅離子，激活

15、劑是氯離子，兩種離子的激活和抑制作用很明顯 2、研究淀粉酶活性的影響因素是要用控制變量的方法，對單一變量進行研究，現(xiàn)代酶學正向著兩個方向發(fā)展：酶的分子生物學和酶工程學，它們是現(xiàn)代生物技術的重要組成部分，應用范圍包括醫(yī)藥，食品，化學工業(yè)，診斷分析和生物傳感器，涉及的品種不少，如淀粉酶，其市場需求生產規(guī)模和產值均很樂觀，并已產生巨大經濟效益【4】。 3、在研究-淀粉酶和總酶活性時，用高溫時，-淀粉酶失活的性質，先處理酶粗液。-淀粉酶單一活性較強，總酶活性比-淀粉酶和-淀粉酶總活性強，說明兩種淀粉酶有促進作用。 4、對于酶活力測定的方法有很多,比如測定酶活性的凝膠擴散法和組織印漬法【3】,該法建立了改良凝膠擴散法和組織印漬法檢測-淀粉酶活性的方法,此法的實驗條件容易控制,重復性好。組織印漬法在玉米種子吸水約5h后即可檢測到-淀粉酶活性;再如2-氯-4-硝基苯-半乳糖-麥芽糖苷作底物直接測定-淀粉酶法,該法用新底物2氯4硝基苯半乳糖麥芽糖苷（GalG2CNP）直接測定淀粉酶，不需要輔助酶，延滯時間短（15s），線性范圍寬（可達2200UL），試劑穩(wěn)定性好，不使用KSCN、NaN3等激活劑，