中性甲醛固定液的配置

1、中性甲醛固定液的配置 免疫組化技術(shù)的關(guān)鍵問題1.組織處理恰當(dāng)?shù)慕M織處理是做好免疫組化染色的先決條件，也是決定染色成敗的內(nèi)部因素，在組織細(xì)胞材料準(zhǔn)備的過程中，不僅要求保持組織細(xì)胞形態(tài)完整，更要保持組織細(xì)胞的抗原性不受損或彌漫，防止組織自溶。如果出現(xiàn)自溶壞死的組織，抗原已經(jīng)喪失，即使用很靈敏的檢測(cè)抗體和高超的技術(shù)，也很難檢出所需的抗原，反而往往由于組織的壞死或制片時(shí)的刀痕擠壓，在上述區(qū)域易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。組織及時(shí)取材 組織標(biāo)本及時(shí)的取材和固定是做好免疫組化染色的關(guān)鍵第一步，是有效防止組織自溶壞死，抗原喪失的開始，離體組織應(yīng)盡快的進(jìn)行取材，最好2h內(nèi)，取材時(shí)所用的刀應(yīng)銳利，要一刀下去切開組織，不可反

2、復(fù)切拉組織，造成組織的擠壓，組織塊大小要適中，一般在2.5cm×2.5cm×0.2cm，切記取材時(shí)組織塊寧可面積大，千萬不能厚的原則，(也就是說組織塊的面積可以大到3cm×5cm，但組織塊的厚度千萬不能超過0.2cm，否則將不利于組織的均勻固定)。固定液快速滲透到組織內(nèi)部使組織蛋白能在一定時(shí)間內(nèi)迅速凝固。從而完好的保存抗原和組織細(xì)胞形態(tài)。) x! R; " s) 2、固定固定是技術(shù)室工作的第一步，也是在整個(gè)制片過程中無法補(bǔ)救的一步。所謂“固定”，就是組織離體后，用各種方法使其細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)盡量接近其生活狀態(tài)時(shí)的形態(tài)結(jié)構(gòu)和位置的過程。固定的目的是為了

3、防止組織細(xì)胞自溶與腐敗，防止了細(xì)胞內(nèi)的酶對(duì)蛋白質(zhì)的分解作用，使細(xì)胞內(nèi)的各種成分如蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物或酶類轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄晕镔|(zhì)，以保持原有的結(jié)構(gòu)與生活時(shí)相仿。另外，組織固定后，均呈一定的硬化狀態(tài)，增加組織韌性，而且不易變形，有利于以后的組織處理。所以組織一旦離體必需及時(shí)固定，固定液的量應(yīng)為組織的4倍。固定的關(guān)鍵主要與固定的及時(shí)性、固定液的選擇、固定液的濃度、固定的溫度和時(shí)間有關(guān)。對(duì)于固定液的選擇，原則上講，應(yīng)根據(jù)抗原的耐受性來選擇相應(yīng)的固定液，但除非是專項(xiàng)科研項(xiàng)目，在病理常規(guī)工作很難做到這一點(diǎn)，因?yàn)椴±淼脑\斷和鑒別診斷都是在常規(guī)HE病理診斷的基礎(chǔ)上決定是否進(jìn)行免疫組化的染色，而HE染色的常規(guī)組

4、織處理是采用10%的中性緩沖福爾馬林或4%緩沖多聚甲醛4倍于組織體積進(jìn)行組織固定，利用其滲透性強(qiáng)，對(duì)組織的作用均勻進(jìn)行固定，但組織固定時(shí)間最好在l2h內(nèi)，一般固定時(shí)間不應(yīng)超過24小時(shí)。隨著固定時(shí)間的延長對(duì)組織抗原的檢出強(qiáng)度將逐漸降低。14%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸緩沖液pH7.3：該固定液適用于免疫組織化學(xué)方法。動(dòng)物先用此液進(jìn)行灌注固定，取材后，再 用該液浸泡固定2-24h。固定液配方1：40g多聚甲醛，溶于1000ml，0.1mol/L的PB液，不容易溶解，放于密封瓶中，60溫箱過夜即可溶解，也可以加溫至60，攪拌溶解。固定液配方2：多聚甲醛 40g，PBS0.1 mol/L PH 7

5、.4 500 ml ，混合后加熱至60，攪拌并滴加1N NaOH 至清亮為止，冷卻后加PBS 至總量1000 ml。注固定時(shí)間24小時(shí)。24%多聚甲醛-磷酸二鈉/氫氧化鈉液：該固定液適用于光鏡和電鏡免疫組織化學(xué)方法。用于免疫電鏡標(biāo)本時(shí)，應(yīng)加入新鮮配制的戊二醛，使其終濃度為0.5-1%。此固定液性質(zhì)溫和，可長期保存組織。固定液配方：甲液-多聚甲醛40g，蒸餾水400ml；乙液-NaH2PO4?2H2O 16.88g，蒸餾水300ml；丙液-NaOH3.86g，蒸餾水200ml。先將甲液中多聚甲完全溶解，乙液倒入丙液混合后倒入甲液，用1mol/LNaOH或1mol/L HCL將pH調(diào)至7.2-7.

6、4。補(bǔ)充蒸餾水至1000ml，充分混合后，4保存。3中性緩沖甲醛液：對(duì)大多數(shù)抗原保存較好，是免疫組織化學(xué)最常用的固定液，組織穿透性好，組織收縮小。最常用的固定液，能滿足常規(guī)HE及免疫組化、PCR等工作。一般無特殊要求的病理標(biāo)本均適用。尤其值得注意的是，中性甲醛是以pH 7274的磷酸緩沖液為溶劑配制的，其固定效果及對(duì)組織抗原性的保存均優(yōu)于一般的4甲醛固定液。此固定液配制后應(yīng)密封并保存在陰涼處，保存時(shí)間固定時(shí)間以24h以內(nèi)為宜，不要超過一個(gè)月。固定液配方1：40%甲醛10ml，0.01mol/L pH7.4的PBS90ml。固定液配方2：40%甲醛120ml，蒸餾水880ml，磷酸二氫鈉NaH2

7、PO4?H2O4g，磷酸氫二鈉Na2HPO413g。固定液配方3：甲醛(40%) 100 ml，無水磷酸氫二鈉 6.5 g，磷酸二氫鈉 4.0g，蒸餾水 900 ml。固定液配方3：10%中性福爾馬林固定液1000ml，Na2HPO4?12H2O 16.3g，NaH2PO4?2H2O 4.5g，福爾馬林100ml。3、樣品的：組織標(biāo)本固定于4%多聚甲醛中，4過夜后，移入PH7.4 ，0.O1MPBS,4 過夜，換液1次，置低溫冰箱-40冷藏保存待測(cè)。4、樣品的滲透和包埋：注入30%蔗糖4滲透至組織沉底，用包埋劑包埋，切片。5、切片的保存：可放在-20冷藏保存待測(cè)。二、免疫組化：1抗原修復(fù)6 p

8、# 1)抗原熱修復(fù)% ?& g! r5 N& D- T' b在沸水中加入EDTApH8.0或0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液pH6.0。蓋上不銹鋼高壓鍋的蓋子，但不進(jìn)行鎖定。將玻片置于金屬染色架上，緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡5分鐘，然后將蓋子鎖定，小閥門將會(huì)升起來。10分鐘后，去除熱源，置入涼水中，當(dāng)小閥門沉下去后打開蓋子。本方法適用于較難檢測(cè)或核抗原的抗原修復(fù)。2)煮沸熱修復(fù) , b- v# B$ # J* v電爐或者水浴鍋加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液pH6.0至95左右，放入組織芯片 加熱1015分鐘。3)微波熱修復(fù) 9 U2 x&q

9、uot; K. i& y; O* J1 z2 E在微波爐里加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液pH6.0至沸騰后將組織芯片放入，斷電，間隔510分鐘，反復(fù)1-2次。適用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，Topoismerase等。4)酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用

10、前預(yù)熱至37，切片也預(yù)熱至37，消化時(shí)間約為530分鐘；胃蛋白酶消化37時(shí)間為30分鐘。適用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。2免疫組織化學(xué)染色 3 Z. C/ S4 . ! g9 ISP法1)水化；2) PBS洗23次各5分鐘；7 E4 G& Y9 K% a A! S+ 3)3%H2O280%甲醇滴加在TMA上，室溫靜置10分鐘* l9 M( A; d' g- q3 2 p7 W4)PBS洗23次各5分鐘； : i2 u) W+ ?6 U1 i8 Y2 g5)抗

11、原修復(fù)；; V3 j7 N5 l! F6)PBS洗23次各5分鐘；& 4 ' G/ Q2 a" C" N* 9 P7)滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鐘。甩去多余液體。8)滴加抗50l，室溫靜置1小時(shí)或者4過夜或者371小時(shí)。9)4過夜后需在37復(fù)溫45分鐘。0 I. C, V/ X6 y# 10)PBS洗3次各5分鐘；11)滴加抗4050l，室溫靜置，或371小時(shí)；12)抗中可加入0.05%的tween-20。3 $ $ P& f6 C/ u: c1 R13)BS洗3次各5分鐘；0 g# 7 u6 x8 E

12、# W" P14)DAB顯色510分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度；15)PBS或自來水沖洗10分鐘；16)蘇木精復(fù)染2分鐘，鹽酸酒精分化；17)自來水沖洗1015分鐘；& T 4 I7 P' r( B$ X18)脫水、透明、封片、鏡檢。 SABC法 * 1 x$ v- r+ A2 A! 1)脫蠟、水化。5 R8 K/ ! S4 ; h2 B3 S2)PBS洗兩次各5分鐘。6 Y- C" ; E F( i+ E8 X3)用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2，室溫封閉510分鐘，蒸餾水洗3次。+ s8 o, P8 k$ g2 t,

13、 w4) 抗原修復(fù)。5) PBS洗5分鐘。* : y2 Z6 D! K4 p( 6) 滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘。甩去多余液體。 l8 n; Z8 v) Z- Q7) 滴加抗,室溫1小時(shí)或者4過夜或者371小時(shí)4過夜后在37復(fù)溫45分鐘。9 T" n* |$ R% C1 P6 _! q8) PBS洗三次每次2分鐘。9) 滴加生物素化二抗,203720分鐘。10)PBC洗3次每次2分鐘。# m% h; X/ M% g" a11)滴加試劑SABC，203720分鐘。" S3 I/ |6 u% i; k0 g12)PBS洗4次每次5分鐘

14、。13)DAB顯色：DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色鏡下掌握顯色程度。14)蒸餾水洗。蘇木素復(fù)染2分鐘、鹽酸酒精分化。 $ R" g! 1 Q- u15)脫水、透明、封片、鏡檢。三、組織固定的注意事項(xiàng)1及時(shí)取材：由于甲醛對(duì)組織的平均穿透速度只有0.8 mm/h，因此手術(shù)切除的送檢標(biāo)本應(yīng)及時(shí)切開進(jìn)行取材，以便保證重 要的鏡檢部位能及時(shí)地得到固定。2及時(shí)固定：完成取材的組織塊應(yīng)立即投入固定液以便盡可能地保存組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和抗原性。3液量充分：一般情況下要求固定液的量應(yīng)為組織體積的610倍。4適度固定：現(xiàn)代固定的要求是，在良好保存組織細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的同時(shí)盡可能較好地保存組織細(xì)胞的抗原性。長時(shí)間的固定會(huì)導(dǎo)致某些組織抗原性的逐漸喪失，因此，適時(shí)固定可以在保存細(xì)胞結(jié)構(gòu)和抗原性之間取得必要的平衡。對(duì)于較大的送檢標(biāo)本而言，在及時(shí)切開固定的基礎(chǔ)上，應(yīng)盡可能在24 h以內(nèi)取材進(jìn)入組織脫水程序。5適宜