細(xì)胞沉默調(diào)節(jié)蛋白1SIRT1活性熒光定量檢測試劑盒中文版

1、細(xì)胞沉默調(diào)節(jié)蛋白 1 (SIRT1 )活性熒光定量檢測試劑盒(中文版)主要用途細(xì)胞沉默調(diào)節(jié)蛋白 1 (SIRT1)活性熒光定量檢測試劑是一種旨在通過熒光探針氨甲基香豆素標(biāo)記人工 合成的乙酰化 p53 多肽底物， 經(jīng)過 SIRT1 脫乙酰基后， 被位點(diǎn)特異性氨基肽酶水解， 釋放黃色對硝基苯胺， 即采用熒光法來測定細(xì)胞裂解萃取樣品中酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí) 驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解萃取液樣品 (動(dòng)物、人體)、核蛋白樣品、 部分或完全純化酶樣品中 SIRT1 的活性定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。技術(shù)背景人體組蛋白

2、脫乙?；? histone deacetylase； HDAC )家屬分成三類共 20多個(gè)蛋白：種類 I(class I)與酵母 Rpd3蛋白同源，包括 HDAC1 、2、3、8，存在于細(xì)胞核中；種類 II (class II)與酵母 Hda1蛋白同源，包括 HDAC4 、5、6、7、 9a、 9b、10和HDRP/MITR ，存在于細(xì)胞核和細(xì)胞漿里；上述兩大種類的蛋白分子催化 結(jié)構(gòu)域含有鋅，且曲古菌素 A ( trichostatin A ； TSA )敏感。種類 III (class III )為NAD +輔助因子必需，又 稱為 sirtuins ，與酵母 Sir2( Silent In

3、formation Regulator 2 )同源，包括 SIRT1至7等，為曲古菌素 A( trichostatin A；TSA)不敏感型賴氨酸脫乙?；? lysyl-deacetylase)。催化賴氨酸脫乙酰基反應(yīng)，以及由 NAD +和乙酰 (acetyl)基團(tuán)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的煙酰胺( nicotinamide )和O-乙酰ADP核糖( O-acetyl-ADP-ribose )。SIRT1位于細(xì) 胞核內(nèi)， 與酵母 Sir2同源性最高。 其功能在于調(diào)節(jié) p53活性和抑制細(xì)胞凋亡。 基于人工合成的乙?；?p53( 379 至382氨基酸位點(diǎn))多肽底物 Ac-Arg His-Lys-Lys (Ac

4、 )具有抗氨基肽酶切離的功能，首先使用熒光染料 氨甲基香豆素( aminomethylcoumarin ； AMC )來標(biāo)記乙酰化 p53多肽底物，其次進(jìn)行脫乙?；?，最后底物 進(jìn)一步在氨基肽酶的催化酶解， 釋放出具有強(qiáng)烈熒光的 7-氨 -4甲基香豆素( 7-amino-4-methylcoumarin ；AMC ) (激發(fā)波長 350-360nm ；散發(fā)波長 450-465nm)，由此來定量測定沉默調(diào)節(jié)蛋白 1的活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：產(chǎn)品內(nèi)容裂解液( Reagent A) 分離液( Reagent B) 清理液( Reagent C) 萃取液( Reagent D) 緩沖液( Reagent E

5、) 底物液( Reagent F) 終止液( Reagent G) 酶解液( Reagent H) 補(bǔ)充液( Reagent I) 標(biāo)準(zhǔn)液( Reagent J) 產(chǎn)品說明書毫升 毫升 毫升毫升毫升微升 微升 微升微升微升1份保存方式保存 緩沖液(Reagent E)、 底物液(Reagent F)、 終止液( Reagent G)、 酶解液(Reagent H)和 標(biāo) 準(zhǔn)液( Reagent J)在 20冰箱里，避免反復(fù)凍融； 其余的保存在 4冰箱里； 底物液( Reagent D)和 標(biāo) 準(zhǔn)液( Reagent J)避免光照，有效保證 6 月用戶自備磷酸鹽緩沖溶液( PBS)：用于清洗細(xì)胞

6、樣品15 毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器1.5 毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器 (微型)臺式離心機(jī)：用于細(xì)胞預(yù)處理 培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)物孵育酶標(biāo)板或比色皿：用于反應(yīng)和熒光分析的容器 熒光酶標(biāo)儀或熒光分光光度儀：用于熒光分析實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)開始前，將 20冰箱里的試劑置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。一、樣品準(zhǔn)備1 準(zhǔn)備好 75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶或 100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細(xì)胞( 1至 5 X 10 7細(xì)胞)2 小心抽去培養(yǎng)液3 小心加入 10 毫升用戶自備的磷酸鹽緩沖溶液( PBS)，覆蓋生長表面4 小心抽去清理液5 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞(注意： 避免使用胰酶消化 )6 加入 x

7、x 毫升 裂解液( Reagent A)，混勻細(xì)胞7 移入到預(yù)冷的 15 毫升錐形離心管8 強(qiáng)力渦旋震蕩 10 秒9 置于冰槽里孵育 15 分鐘10加入 xx 毫升預(yù)冷的 分離液( Reagent B)，混勻11放進(jìn) 4臺式離心機(jī)離心 10 分鐘，速度為 1300g12小心抽去上清液13加入 xx 毫升預(yù)冷的 清理液( Reagent C)14放進(jìn) 4臺式離心機(jī)離心 10 分鐘，速度為 1300g 15小心抽去上清液16小心加入 xx 微升預(yù)冷的 萃取液( Reagent D)，混勻17轉(zhuǎn)移到新的預(yù)冷的 1.5 毫升離心管18超聲處理 30 秒19置于冰槽里孵育 30 分鐘20放進(jìn) 4微型臺式

8、離心機(jī)離心 10 分鐘，速度為 16000g(或 13000RPM ，例如 EPPENDORF 5415) 21小心移取上清液到新的預(yù)冷的 1.5 毫升離心管22移取 10 微升進(jìn)行蛋白定量檢測(注意： 建議使用 Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒 HL30030.1 ) 23即刻放進(jìn) 70保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作測定準(zhǔn)備1 準(zhǔn)備好待測樣品(例如核蛋白或純化酶樣品等) ，置于冰槽里2 設(shè)定好熒光酶標(biāo)儀或熒光分光光度儀(溫度為30)：激發(fā)波長 350-360nm；散發(fā)波長 450-465nm3 緩沖液( Reagent E) 置于室溫下均衡溫度4 準(zhǔn)備好 5 個(gè)1.5 毫升離心管，標(biāo)記為

9、 1至 5號管5 分別加入 xx 微升 緩沖液( Reagent E) 到 1 至 5 號管6 移取 xx 微升 標(biāo)準(zhǔn)液( Reagent J) 到 1 號管，混勻7 小心移取 xx 微升 1 號管稀釋的 標(biāo)準(zhǔn)液( Reagent J) 到 2 號管，混勻8 小心移取 xx 微升 2 號管稀釋的 標(biāo)準(zhǔn)液( Reagent J) 到 3 號管，混勻9 小心移取 xx 微升 3 號管稀釋的 標(biāo)準(zhǔn)液( Reagent J) 到 4 號管，混勻10將 1 至 5 號管放進(jìn)冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表管號緩沖液( Reagent E )標(biāo)準(zhǔn)液( Reagent J)標(biāo)準(zhǔn)氨甲基香豆素濃度1xx

10、微升xx 微升xx 微摩爾 /升2xx 微升xx 微升 1 號管xx 微摩爾 /升3xx 微升xx 微升 2 號管xx 微摩爾 /升4xx 微升xx 微升 3 號管xx 微摩爾 /升5xx 微升00三、活性測定1在 96 孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：標(biāo)準(zhǔn)樣品 1 至 5 管2分別移取 xx 微升 緩沖液( Reagent E) 到相應(yīng)孔中3分別加入 xx 微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液( Reagent J )4輕輕搖動(dòng) 96 孔酶標(biāo)板 30 秒5即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀或轉(zhuǎn)移到100 微升比色皿， 在熒光分光光度儀里檢測：獲得相對熒光單位 ( RelativeFluorescence Unit； RFU）讀數(shù)6

11、構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線： 縱座標(biāo)( Y 軸)為相對熒光單位 (RFU)；橫座標(biāo)(X 軸)為標(biāo)準(zhǔn)氨甲基香豆素濃度 (微摩爾 /升)四、活性測定1 在 96 孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景空對照和待測樣品2 分別移取 xx 微升 緩沖液( Reagent E) 到相應(yīng)孔中3 分別加入 xx 微升 底物液( Reagent F)4 分別加入 xx 微升 補(bǔ)充液( Reagent I )或待測樣品( 50 微克核蛋白或 200微克細(xì)胞裂解萃取液總蛋 白)(注意： 樣品須清澈 )5 輕輕搖動(dòng) 96 孔酶標(biāo)板 30 秒6 放進(jìn) 30培養(yǎng)箱里，孵育 60 分鐘，避免光照7 分別加入 xx 微升 終止液( Reagent

12、 G)8 分別加入 xx 微升 酶解液( Reagent H)9 輕輕搖動(dòng) 96 孔酶標(biāo)板 30 秒10在 30培養(yǎng)箱里，孵育 30 分鐘11即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀或轉(zhuǎn)移到 100 微升比色皿， 在熒光分光光度儀里檢測： 獲得相對熒光單位 ( RelativeFluorescence Unit；RFU ）讀數(shù)12根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對應(yīng)氨甲基香豆素濃度（微摩爾/升）四、 計(jì)算樣品活性方法一： RFU 直接法方法二：標(biāo)準(zhǔn)氨甲基香豆素濃度測算法注意事項(xiàng)1 本產(chǎn)品為 20 次操作2 操作時(shí)，須戴手套3 系統(tǒng)操作過程中，標(biāo)準(zhǔn)測定只需 1 次4 樣品須澄清，至關(guān)重要5 樣品處理時(shí)，避免使用蛋白酶抑制劑、 PMSF、烷基胺（ alkyl amine ）等6 孵育反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行熒光測定7 測定值由低到高變化；測定持續(xù) 60 分鐘8 測定值熒光讀數(shù)越高，表明酶活性越高9 熒光測定后，比色皿須清洗徹底10待測樣本為核蛋白樣品， 其蛋白濃度為 50微克/20 微升；待測樣本為細(xì)胞裂解懸液， 其蛋白濃度為 200 微克/20 微升（本公司提供Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒