生物等效性試驗(yàn)生物樣品處理注意事項(xiàng)嚴(yán)

1、生物等效性實(shí)驗(yàn)生物樣品處理注意事項(xiàng)一、樣品采集后的的處理和貯存鑒于生物樣本的特點(diǎn)，為了避免樣品中被測(cè)藥物發(fā)生分解或產(chǎn)生其他化學(xué)變化，取樣 后最好立即進(jìn)行分析測(cè)定，但實(shí)際工作中幾乎無(wú)法做到，常需將收集到的樣品冷藏、冰凍， 臨用前再融化并放至室溫后使用。在樣本冷凍貯藏前，需及時(shí)進(jìn)行處理。1.1 血液樣本處理注意事項(xiàng)1.1.1 .在肌肉注射或靜脈輸含有葡萄糖或電解質(zhì)（含鉀、鈉、氯離子）的液體時(shí)，建議 3小時(shí)以后采集靜脈血樣本進(jìn)行這些項(xiàng)目的檢驗(yàn)，以防止上述檢驗(yàn)項(xiàng)目因輸液引起的假性升1.1.2 保定非麻醉狀態(tài)的動(dòng)物時(shí)應(yīng)盡量避免用力擠壓動(dòng)物頭頸和胸腹，以免引起血液淤 滯，局部組織缺氧，造成血液某些成分的改

2、變，特別是測(cè)定乳酸，血液含氧量等指標(biāo)時(shí)。1.1.3 血液中紅細(xì)胞內(nèi)外成分有很大差異，溶血可造成紅細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)向細(xì)胞外轉(zhuǎn)移， 如K+、Mg2+和某些酶類(lèi)（LD、AST ALT、ACP）;另外，溶血還可干擾某些化學(xué)項(xiàng)目（TBil、DBil、TC等）的測(cè)定，嚴(yán)重影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，血樣本應(yīng)防止溶血。引起溶血的原因有：注射器采血時(shí)抽吸力太大；血液與抗凝劑比例失調(diào)；混勻樣本時(shí)過(guò)度振蕩；注射器或采血容 器帶水或容器污染；全血放置時(shí)間長(zhǎng)或突然受冷或受熱；注射器中的血沫注入采血容器； 真空采血時(shí)如未采滿(mǎn)至相應(yīng)刻度，殘存負(fù)壓造成紅細(xì)胞破裂；不拔針頭直接注入采血容器； 樣本離心時(shí)離心力過(guò)大等。為避免溶血，取血時(shí)應(yīng)注

3、意：、抽拉注射器時(shí)應(yīng)盡量避免注射器內(nèi)產(chǎn)生大量真空；、添加抗凝劑后的容器在除必要干燥流程后應(yīng)及時(shí)密封；、混勻樣本時(shí)避免用力過(guò)度，切勿產(chǎn)生泡沫；、避免重復(fù)使用注射器、針頭、采血管、毛細(xì)玻璃管等一次性用品，手術(shù)刀片和剪 刀等器材取材時(shí)盡量洗去殘留血液；、采血時(shí)的室溫應(yīng)控制在22c至25 C,采取的血液容器在需要放入冰盒時(shí)，切勿緊貼冰袋，冰水；、當(dāng)注射器內(nèi)因吸入空氣產(chǎn)生血沫時(shí)，注意棄掉血沫，在將血液注入采血容器時(shí)勿將血沫一并注入；、使用真空采血管需抽取負(fù)壓時(shí)切勿過(guò)量；、將血液注入采血容器時(shí)要除去針頭，輕柔推入；、離心帶有血細(xì)胞的血樣時(shí)，按照規(guī)格設(shè)定離心參數(shù)；1.1.4 .正確選擇采集管。通常情況下多采

4、用血清為樣本（不抗凝），部分檢測(cè)項(xiàng)目需注意樣本屬性為血清或血漿，兩者不可替代。一些特殊檢驗(yàn)項(xiàng)目需要使用抗凝劑時(shí)，應(yīng)注意選擇合適的抗凝劑并注意抗凝劑與血液的比例，以防止樣本凝血或紅細(xì)胞形態(tài)的改變；抗凝血樣本采集后立即 輕輕搖勻至少上下顛倒 8次，以防凝血發(fā)生。1.1.5 .多項(xiàng)化驗(yàn)采血順序：血培養(yǎng)瓶（厭氧瓶?jī)?yōu)先）-藍(lán)帽管-黑帽管-紅/黃帽管-綠帽 管-紫帽管-灰帽管-其他。1.1.6 需要凍存的全血按要求分裝到統(tǒng)一規(guī)格的無(wú)菌凍存管中，加入DMSO混合均勻后將凍存管放入4c冰箱中半小時(shí)，再放入-20C冷凍冰箱中，至少4小時(shí)候后，才能轉(zhuǎn)移到-80 C 或更低溫條件下儲(chǔ)存。1.1.7 抗凝收集的血漿冷

5、凍保存后，解凍時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀渾濁，如有則需要離心去除雜質(zhì)再進(jìn)行檢測(cè)。1.2 尿液、糞便樣本處理注意事項(xiàng)1.2.1 尿液主要是水、尿素、鹽類(lèi)及少量小分子蛋白，是理想的細(xì)菌生長(zhǎng)液，因此應(yīng)在 取樣后立即測(cè)定。不能立即測(cè)定時(shí)，應(yīng)于 4 c冷藏，如在室溫保存，則應(yīng)在采樣后的尿液中 加入少量防腐劑甲苯（1%）或氯仿（飽和）。樣本留取過(guò)程中應(yīng)避免混有血、膿或陰道分泌物、糞便等可引起“假性蛋白尿”的成分。檢測(cè)非蛋白類(lèi)待測(cè)物時(shí)，可根據(jù)試劑盒需求進(jìn)行蛋白沉降操作（離心/化學(xué)沉淀）。用于一些血液病的樣本應(yīng)注意在留尿前勿對(duì)動(dòng)物進(jìn)行酒精涂抹、吸入，注射巴比妥類(lèi)、 磺胺類(lèi)、利眠寧、眠爾通、苯妥英鈉等藥物，樣本應(yīng)避光保存

6、。1.2.2 糞便樣本應(yīng)盡量使用新鮮樣本，采集后立即送檢。 若樣本久置，則會(huì)因pH及消化酶等因素而使糞便中生物成分分解破壞。樣本中不可混有尿液，更不可采取浸泡于尿液中的糞便樣本。樣本中不可混入墊料、污水等，減少微生物和顆粒造成的影響。糞便樣本不應(yīng)用衛(wèi)生紙包裹、手指抓取，應(yīng)使用棉簽，干凈的鐐子等夾取，直接裝入蠟紙盒或EP管并密封，以防水分丟失。1.3 骨髓樣本處理及注意事項(xiàng)骨髓樣本一般通過(guò)脊柱穿刺、股骨采取。采集的骨髓液收集于無(wú)菌肝素抗凝管內(nèi)，取材環(huán)境應(yīng)保持潔凈（至少為SPF環(huán)境）。若骨髓標(biāo)本含有紅細(xì)胞，在冷凍前應(yīng)先將其離心去除。骨髓標(biāo)本采集后應(yīng)盡快根據(jù)凍存 程序并儲(chǔ)存在-80 C環(huán)境下。1.4

7、 胃腸液樣本處理及注意事項(xiàng)取材前應(yīng)禁食12小時(shí)，在空腹?fàn)顟B(tài)下取材。取出胃腸組織時(shí)，應(yīng)夾閉賁門(mén)和幽門(mén)，及 腸道切口兩端，避免腸液胃液流失/混入血液。需要灌洗腸胃時(shí)應(yīng)注意灌洗液體積、回收率。肺泡灌洗液樣本同上處理。1.5 臟器樣本處理及注意事項(xiàng)取材后應(yīng)迅速將臟器稱(chēng)重，以免水分蒸發(fā)造成差異，特別是腎上腺等小器官的稱(chēng)重。臟器稱(chēng)重前應(yīng)盡量將周?chē)窘M織和結(jié)締組織剔除，并用濾紙吸去臟器表面血液及體液，特別是腎上腺、甲狀腺、前列腺等較小的器官，更要新鮮稱(chēng)重，防止器官干燥失水而重量減輕?？涨黄鞴俜Q(chēng)重前，應(yīng)清除其腔內(nèi)液體，如心臟應(yīng)除去血塊。1.6 組織勻漿樣本處理及注意事項(xiàng)勻漿介質(zhì)的制備一般采用pH 7.4,

8、0.01mol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA-2Na, 0.01mol/L 蔗糖,0.8%氯化鈉溶液或直接用 0.86%的生理鹽水作為勻漿介質(zhì)。ELISA檢測(cè)的勻漿介質(zhì)可使用PH=7.2-7.4,濃度為0.01mol的PBS酶活性類(lèi)檢測(cè)則必須使用生理鹽水。剪取組織塊后應(yīng)在 4c的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，準(zhǔn)確稱(chēng)重，放入適合 的勻漿管中。按重量（g）：體積（ml）比例（1g/ml=100%）加入勻漿介質(zhì)（pH7.4 ,0.01mol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA-2Na ,0.01mol/L蔗糖,0.8%的氯化鈉溶液）或者 0.86%的生理鹽水于勻

9、漿管中， 冰水浴條件下，用眼科小剪盡快剪碎組織塊后勻漿：包括手工勻漿，機(jī)器勻漿，超聲粉碎。手工勻漿：左手持勻漿管將下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手將搗桿垂直插入套管中，上下轉(zhuǎn)動(dòng)研磨數(shù)十次（68分鐘），充分研碎，制成10%的勻漿液；機(jī)器勻漿：用組織搗碎機(jī)1000015000轉(zhuǎn)/分 上下研磨制成10%組織勻漿，也可用內(nèi)切式組織勻漿機(jī)制 備（勻漿時(shí)間10秒/次，間隙30秒，連續(xù)35次，在冰水中進(jìn)行），皮膚、肌肉組織等可 延長(zhǎng)勻漿時(shí)間；超聲粉碎：用超聲粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎處理。根據(jù)各型號(hào)儀器操作規(guī)程操作。勻漿制作完成后可使用鏡檢觀察：取少量組織勻漿作涂片（直接涂片、染色均可以）， 顯微鏡下觀察細(xì)胞是否破

10、碎，根據(jù)結(jié)果可延長(zhǎng)勻漿時(shí)間。勻漿液測(cè)定前用普通離心機(jī)或低溫低速離心機(jī)2500轉(zhuǎn)/分左右，離心1015分鐘，取上清液進(jìn)行測(cè)定。勻漿的保存：動(dòng)物組織樣本暫時(shí)不測(cè)定，可立即低溫凍存，溫度越低越好，中間如不反復(fù)凍融，-20C以下可保存三個(gè)月，-70C以下可保存六個(gè)月。非必須凍存的樣本應(yīng)于制作當(dāng)天進(jìn)行測(cè)定，如放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)相關(guān)酶活會(huì)有所下降，部分指標(biāo) 4 c可存放35天（如SOD要 存放23天，MDA可存放35,總蛋白測(cè)定可存 57天等）。1.7 用于基因擴(kuò)增檢測(cè)的樣本包括 NG-DNA、CT-DNA UU-DNA、HSV-II -DNA、tRNA、mRNA 等項(xiàng)目。1.7.1 血液一般采用紅色非抗凝血清

11、管。如需要抗凝處理，首選的抗凝劑為EDTA和枸檬酸鈉，不能使用肝素抗凝，肝素是Taq酶的強(qiáng)抑制劑。RNA檢測(cè)的樣本應(yīng)在4小時(shí)內(nèi)開(kāi)始擴(kuò)增程序處 理；DNA檢測(cè)的樣本應(yīng)在12小時(shí)內(nèi)處理。如不能及時(shí)送檢，可將樣本放在 -20C冷凍保存。1.7.2 尿液用無(wú)菌生理鹽水清洗尿口，并用高壓蒸汽滅菌處理過(guò)的無(wú)菌器皿收集，不做防腐處理。RNA檢測(cè)的樣本應(yīng)在 4小時(shí)內(nèi)開(kāi)始擴(kuò)增程序處理；DNA檢測(cè)的樣本應(yīng)在12小時(shí)內(nèi)處理。如不能及時(shí)送檢，可將樣本放在-20 C冷凍保存。1.7.3 腦脊液、胸腹水、穿刺液、肺泡灌洗液嚴(yán)格遵照無(wú)菌操作規(guī)范取材，收集至經(jīng)高壓蒸汽滅菌處理的無(wú)菌容器。RNA檢測(cè)的樣本應(yīng)在4小時(shí)內(nèi)開(kāi)始擴(kuò)增程

12、序處理；DNA檢測(cè)的樣本應(yīng)在12小時(shí)內(nèi)處理。如不能及時(shí)送檢，可將樣本放在-20 C冷凍保存。二、生物樣本貯存期間的穩(wěn)定性考察由于生物等效性試驗(yàn)樣本從采樣到檢測(cè)的周期通常需要幾周至幾個(gè)月，在其貯存期間目標(biāo)藥物的穩(wěn)定性需經(jīng)考察驗(yàn)證。含藥樣本穩(wěn)定性是指樣品中的藥物從采樣至測(cè)定時(shí)性質(zhì)和含量的穩(wěn)定程度，它是貯存條件、藥物的化學(xué)性質(zhì)、空白生物樣品和容器系統(tǒng)的函數(shù)，在特定的容器和生物樣品中待測(cè)物的穩(wěn)定性不能外推至其他系統(tǒng)。生物樣本穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)應(yīng)考 察：1、短期室溫穩(wěn)定性：要求高、低濃度樣本在424 h內(nèi)穩(wěn)定。考察溫度、光照、空氣、酶解等因素。2、長(zhǎng)期低溫條件下的穩(wěn)定性：從第一個(gè)樣本采集至最后一個(gè)樣本的分析為

13、一個(gè)考察時(shí)間周期，貯存溫度一般為 -20 C ,如果需要也可在-70C貯存。要求高、低濃度至少分別測(cè) 定3次，測(cè)得結(jié)果與第一天測(cè)得的相應(yīng)濃度比較應(yīng)保持穩(wěn)定。3、凍融試驗(yàn)：取高、低濃度各3份于-20C貯存24小時(shí)，取出后在室溫自然解凍，取樣測(cè)定，然后再將樣品放回冷凍 1224小時(shí)，如此重復(fù)循環(huán)二次以上，分別比較各次測(cè)定結(jié)果。4、對(duì)照液和內(nèi)標(biāo)液的穩(wěn)定性：室溫考察6小時(shí)穩(wěn)定性，然后冷藏 714天或恰當(dāng)?shù)闹芷诤筮M(jìn)行測(cè)定，與新配溶液的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。三、各類(lèi)檢測(cè)項(xiàng)目注意事項(xiàng)激素類(lèi)：包括類(lèi)固醇（腎上腺皮質(zhì)素、性激素）、蛋白質(zhì)和多肽類(lèi)（垂體、下丘腦、胰 腺）、脂肪酸衍生物（白細(xì)胞三烯、前列腺素）、氨基酸衍

14、生物（腎上腺素、甲狀腺素）。 在室溫條件下大致穩(wěn)定性從高到低為：固醇類(lèi)（數(shù)周至數(shù)天）f蛋白質(zhì)和多肽（數(shù)周至數(shù)分鐘）f氨基酸衍生物（數(shù)天至數(shù)分鐘）f脂肪酸衍生物（數(shù)天至數(shù)秒）。檢驗(yàn)按照檢驗(yàn)項(xiàng)目 的特性取材即刻檢測(cè)，或是選擇-70C凍存，避免反復(fù)凍融，且避免水浴時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，建議凍融即開(kāi)始檢測(cè)（注意吹打混勻）。蛋白類(lèi)：包括酶、抗體、表面標(biāo)示蛋白、總蛋白組織液、泛素、部分激素類(lèi)等。在 -70 C 中相對(duì)保存時(shí)間較長(zhǎng)，但反復(fù)凍融極易破壞穩(wěn)定性，水浴更容易被細(xì)菌或樣本內(nèi)自身的酶降 解。其中抗體類(lèi)蛋白最為穩(wěn)定，IgG甚至能在血清中4c穩(wěn)定保存23天。而酶類(lèi)在血清中4 C 放置8小時(shí)即會(huì)造成活性下降。血清蛋白則

15、能在24小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定。多肽類(lèi)：根據(jù)分子量大小，較長(zhǎng)的肽鏈穩(wěn)定性能與蛋白相當(dāng)，分子量越小則穩(wěn)定性越差，血清樣本建議24小時(shí)內(nèi)檢測(cè)處理，-70 C凍存時(shí)應(yīng)避免反復(fù)凍融。氨基酸：在中性條件下可在 -70 C至-20 C凍存數(shù)月，但 4c以上開(kāi)始，血清樣本中氨基 酸會(huì)緩慢被酶代謝，在酶類(lèi)豐富的組織液和細(xì)胞裂解液中更容易代謝。建議加快凍融復(fù)溫后的檢驗(yàn)進(jìn)程。生化類(lèi)檢測(cè)項(xiàng)目：這些檢驗(yàn)項(xiàng)目較為復(fù)雜，除了部分有機(jī)鹽類(lèi)之外，大部分易受氧化、 光照分解、生物降解?？紤]到實(shí)驗(yàn)室方法學(xué)允許誤差，參考檢驗(yàn)科對(duì)具體項(xiàng)目的測(cè)定要求： GLU應(yīng)在4 h內(nèi)測(cè)定，BUN （尿素氮）、TBIL （總膽紅素）應(yīng)在 8 h內(nèi)完成，TP （總蛋白）、 ALB （白蛋白）、ALT（丙谷氨酸車(chē)t移酶）、 AST （天門(mén)冬氨酸轉(zhuǎn)移酶）、 ALP （堿性磷酸酶）、 GGT （GGT谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶）、Ca2+、PT應(yīng)在24 h內(nèi)測(cè)定完。血液標(biāo)本長(zhǎng)時(shí)間放置后，其結(jié)果偏高的是：TP、ALBALTAS不ALP、GGTCa2+;其結(jié)果偏低的是：BUN、TBIL;對(duì)結(jié)果影響差異無(wú)顯著性的是：TG （甘油三酯）、DBIL （直接膽紅素）。這提示，要得到血脂等指標(biāo)的可靠準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果，標(biāo)本也不適宜在低溫下長(zhǎng)時(shí)間保