石墨烯加速神經(jīng)干細(xì)胞成熟和分化

1、啟示神經(jīng)與基于 BSC療法的導(dǎo)電材料的接口： 通過(guò)偶合石墨烯加速神經(jīng)干細(xì)胞的生物電功能 開(kāi)發(fā)為了管理在組織工程細(xì)胞特異性行為神經(jīng)修復(fù)和再生，更好地理解材料-細(xì)胞相互作用，尤其是生物電功能的，極其important.Graphene已報(bào)道是用作支架的潛在候選和神經(jīng)interfacingmaterial.However ,石墨烯這些導(dǎo)電性基板細(xì)胞膜的生物電演變?cè)诤艽蟪潭壬先匀?沒(méi)有進(jìn)行過(guò)。在這項(xiàng)研究中，我們使用了神經(jīng)干細(xì)胞（NSQ模型，探討膜生物電屬性 E包括增殖和分化conditions.We下休息膜電位和動(dòng)作電位E和細(xì)胞行為上的石墨烯薄膜中使用的組合可能發(fā)生的變化單細(xì)胞電生理記錄和傳統(tǒng)的細(xì)胞生

2、物學(xué)技術(shù)。石墨烯不影響基本膜電參數(shù)（電容和輸入電阻），但擱在石墨烯襯底細(xì)胞膜電位分別更強(qiáng)烈增殖和分化的條件下為負(fù)。此外，神經(jīng)干細(xì)胞及其對(duì)石墨烯基片表現(xiàn)出的后代與對(duì)照相比，在開(kāi)發(fā)過(guò)程中增加的動(dòng)作電位的射擊。但是，石墨烯只有輕微影響電動(dòng)刻畫(huà)ofmature NSC后代。石墨烯基片上的被動(dòng)和主動(dòng)的生物電特性Themodulation伴隨著增強(qiáng)NSC分化。此外，棘密度，突觸突觸蛋白表達(dá)和在.Modeling石墨組所有activitywere增加上導(dǎo)電的石墨烯襯底電場(chǎng)表明由該 負(fù)電的細(xì)胞膜產(chǎn)生的電場(chǎng)大于上即控制它的石墨烯襯底高得多，這可以解釋觀察到的 通過(guò)耦合石墨烯的生物電的發(fā)展變化。我們的研究結(jié)果表明

3、石墨烯是能夠加速在開(kāi)發(fā)過(guò)程中的NSC成熟，特別是在生物電發(fā)展方面。我們的發(fā)現(xiàn)提供對(duì)導(dǎo)電材料在調(diào)諧膜中的作用的基本理解石墨烯模型中的生物電性能，為未來(lái)的發(fā)展研究鋪平道路方法和材料形成在基于 NSC的治療的可控通道中的膜性質(zhì)。石墨烯，碳原子的2維單層，由于材料的獨(dú)特的電，機(jī)械和熱特性，一直在納米技術(shù)的最 前沿。它最近被認(rèn)為是一個(gè)有前途的候選人制造超快納米電子器件，透明電極，納米復(fù)合材料和生物醫(yī)學(xué)材料3。它已經(jīng)用于多種生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，包括細(xì)胞成像和藥物遞送4,生物分析5,干細(xì)胞研究6,7,甚至光熱療法治療腫瘤8。最近，我們和其他團(tuán)體發(fā)現(xiàn)使用石墨烯作為神經(jīng)接口材料的可能性，因?yàn)樗梢源龠M(jìn)人類(lèi)成神經(jīng)細(xì)胞瘤

4、（SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)9, PC-12細(xì)胞10,海馬原代培養(yǎng)神經(jīng)元11和直 接NSC分化神經(jīng)元12,13,促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化成石墨烯納米網(wǎng)半導(dǎo)體神經(jīng)元和形成神經(jīng)元纖維14,15。此外，越來(lái)越多的研究表明石墨烯表現(xiàn)出操縱莖的命運(yùn)的潛在能力細(xì)胞。例如，石墨烯基材料能夠誘導(dǎo)NSC分化成神經(jīng)元譜系7,16,控制甚至加速間充質(zhì)細(xì)胞的分化干細(xì)胞6,17e22,并調(diào)節(jié)其他類(lèi)型的行為干細(xì)胞，包括多能干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞23e25。這些開(kāi)創(chuàng)性的研究清楚地證明了在細(xì)胞治療中基于石墨烯的材料的巨大潛力。然而，改變細(xì)胞行為背后的基礎(chǔ)機(jī)制，例如增強(qiáng)的分化和促進(jìn)的細(xì)胞增長(zhǎng)，仍然很大程度上未知。細(xì)胞功能和細(xì)胞之間的強(qiáng)連接膜

5、的生物電性質(zhì)啟發(fā)我們調(diào)查石墨烯是否可以調(diào)節(jié)NSC發(fā)育和成熟的子代通過(guò)影響其生物電特性細(xì)胞。在這項(xiàng)工作中，我們研究了石墨烯的影響在 NSC發(fā)育期間電生理狀態(tài)的成熟，包括被動(dòng)和主動(dòng)生物電特性和隨后的NSC命運(yùn)的選擇。2。材料和方法2.1。石墨烯膜制備根據(jù)先前公布的 CVD方法26合成石墨烯樣品。簡(jiǎn)言之，將薄銅箔（5cmx 5cm）加熱至1000c 并在H 2和Ar氣體下退火20分鐘，隨后暴露于 H 2和CH 4下5分鐘。然后在 H 2和Ar氣 下將膜從1000 c冷卻至室溫。通過(guò)在硝酸鐵水溶液中蝕刻從銅箔上除去石墨烯膜。在銅膜溶解之后，使TCP*板與石墨烯膜接觸，并將其從溶液中拉出以制造石墨烯/

6、TCPSg板。石墨烯/ TCPS基底用室安裝，并浸沒(méi)在 milli-Q水中過(guò)夜以除去任何殘留的可溶性有毒組分。在用75 %的醇滅菌后，石墨烯/ TCPSg板連續(xù)浸在無(wú)菌 PBS緩沖液中并用PBS中的層粘 連蛋白溶液(20mg / ml, 37c過(guò)夜，Sigma, USA)包被。在細(xì)胞接種之前，將石墨烯膜在 增殖培養(yǎng)基中浸泡過(guò)夜。2.2。 石墨烯基板的表征石墨烯的透射率用 UV / Vis測(cè)量光譜儀(LAMBDA 25, PerkinElmer, Singapore)。 玻璃顯微 鏡將載玻片切成0.9cm 2的矩形。2.6厘米以適應(yīng)樣品架。使用空白載玻片作為參考每次測(cè)量。結(jié)晶度和層數(shù)存在于石墨烯

7、內(nèi)通過(guò)拉曼光譜法檢查(lamRAM HR800, HORIBA France)和 TEM (Tecnai G2 F20 STwin FEI USA)。 石墨烯的表面形態(tài) TCPS通過(guò) AFM (Dimension 3100 , Veeco, USA)使用測(cè)定在室溫下操作的輕敲模式。表面化學(xué)的石墨烯膜通過(guò) XPS( AxisUltra DLD, Kratos, UK)與在40eV操作的AlKaX射線源。的通過(guò)掃描檢查石墨烯膜的形態(tài)電子顯微鏡(SEM) ( Quanta 400FEG, FEI, USA)。2.3。 NSC培養(yǎng)在增殖和分化條件下NSCs來(lái)源于海馬的兩個(gè)半球的出生后第1天ICR大鼠(

8、SooChow大學(xué)動(dòng)物中心)。將海馬與血管和腦膜分離并在 Falcon管中在Hank平衡鹽溶液中收集(HBSS在4C,然后用HBSS 漂洗兩次。離心后(1000rpm , 5 分鐘)，將組織在 TryplE (LifeTechnologies, USA)在 37 c下孵育15分鐘，然后機(jī)械地輕輕研磨通過(guò)使用移液器吸頭。將NSCs1浮于DMEM-F12中含有2%B-27的培養(yǎng)基中，并在潮濕氣氛中培養(yǎng)用5% CO 2在37C。進(jìn)彳T NSCs的傳彳t每7天培養(yǎng)。對(duì)于增殖研究，NSCs接種濃度為 5 g/ 104細(xì)胞/ mL其由補(bǔ)充了 2%B-27的DMEM-F12 培養(yǎng)基組成與 20ng / mL

9、 EGF 和 20ng / mL FGF-2 ( R& D Systems,美國(guó))。 對(duì)于 分化研究，NSC以相似的方式接種濃度在含有2%B-27的DMEM-F12培養(yǎng)基中與胎牛血清(GIBCO, USA)和1mM視黃酸(Sigma)。在這些實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物的護(hù)理和使用遵循由護(hù)理和 使用批準(zhǔn)的指導(dǎo)方針和協(xié)議東南大學(xué)動(dòng)物委員會(huì)。所有的努力使所使用的動(dòng)物數(shù)量和他們的痛苦最小化。2.4。 免疫熒光用PBS洗滌細(xì)胞，在4%多聚甲醛中固定 45分鐘，在含有2%BSA的PBS中封閉，并用透化 0.1%triton X-100, 90分鐘。 將細(xì)胞與原代培養(yǎng)抗體孵育90分鐘，然后與第二抗體溫育持續(xù)60分鐘，然后進(jìn)

10、行 DAPI染色?？贵w小組包括針對(duì) GFAP的一抗，Ki67 (Abcam, USA),Tuj-1, O4,微管蛋白，紐蛋白( Sigma)和 TREK-1 (Santa Cruz Biotechnology,美國(guó))。 對(duì) 于成像樹(shù)突棘，細(xì)胞已被轉(zhuǎn)導(dǎo)與編碼mCherry-肌動(dòng)蛋白的慢病毒。pLVX-mCherryactin載體(Clontech, USA)用于包裝慢病毒。細(xì)胞在 DIV 21成像。2.5。 基于WST的細(xì)胞增殖測(cè)定WST-8 2- (2-甲氧基-4-硝基苯基)-3- (4-硝基苯基)-5- (2,4-二磺苯基)-2H-四詠瑜單鈉鹽 色度測(cè)定法根據(jù) Cell Counting K

11、it-8 ( Dojindo , Japan)。簡(jiǎn)言之，10% (v / v) CCK-8溶液在指定的時(shí)間點(diǎn)加入培養(yǎng)基中并在培養(yǎng)箱中孵育細(xì)胞4小時(shí)。 然后，200mL的最終溶液轉(zhuǎn)移到96孔板中使用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)入下測(cè)量吸光度450nm。2.6。 RNA 提取和 RT-PCR進(jìn)彳t RNA分離，逆轉(zhuǎn)錄和 PCR分析按照標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，總細(xì)胞 RNA使用TRIzol試齊J (Life Technologies) , 1mg RNA分離使用 TaqMan Reverse Transcription Reagents進(jìn)行逆 轉(zhuǎn)錄（Applied Biosystems）,和所示的 mRNA水平使用

12、SYBRGreen主混合物一式三份分析 基因（Applied Biosystems）和 Chromo-4 實(shí)時(shí) RT-PCRCZ器（MJ Research）。 將 mRNA 水平 標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH （內(nèi)部對(duì)照）和基因表達(dá)呈現(xiàn)為倍數(shù)變化（ DDCt法）。2.7。 免疫印跡用在0.03%EDTA中的0.25%胰蛋白酶收獲細(xì)胞并裂解在RIPA緩沖區(qū)。將收集的蛋白質(zhì)樣品裝載在10%聚丙烯酰胺凝膠，通過(guò)凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜（Millipore , USA）上。將細(xì)胞孵育與針對(duì)巢蛋白的多克隆一級(jí)抗體（1:400, Sigma） , TREK-1 （ 1:500, Santa CruzBiote

13、chnology）,突觸泡蛋白（1:400, Millipore ）或 PSD-95 （1:400, Abcam, USA）和次級(jí) 抗體（Santa Cruz Biotechnology）。 然后膜與 ECL western 印跡底物試劑盒（Pierce, USA） 反應(yīng)曝光。GAPDH用作內(nèi)部對(duì)照。2.8。 電生理記錄將補(bǔ)片移液管從硼硅酸鹽玻璃毛細(xì)管中取出（1.2 / 1.5mm： ID / OD）,并用含有移液管溶液填充 120mM CsCl, 20mM 四乙基氯化鏤，2mM MgCl 2 , 10mM EGTA, 2mM ATP 二鈉，和 10mM HEPES電阻 3e4 MU。記錄溶液

14、由 156mMNaCl , 4mM KCl, 1mM MgCl 2 , 2mM CaCl 2, 10mM HEPES 10mM葡萄糖，pH 7.25 （用KOH調(diào)節(jié)）。獲得常規(guī)的全細(xì)胞膜片鉗記錄用Axopatch1-D （ Molecular Devices , USA）。在此期間電壓鉗位，保持電位設(shè)定為？ 64mV。無(wú)補(bǔ)償串聯(lián)電阻值8e12MU。在此期間電流鉗記錄，電橋平衡連續(xù)監(jiān)測(cè)和調(diào)整。密封不良的細(xì)胞或 那些丟棄15e30MU范圍之外的串聯(lián)電阻。對(duì)于 VR記錄，石墨烯和 TCPS上的細(xì)胞樣品每天 記錄。 記錄AP至少7分鐘后膜破裂。通過(guò)具有上升速度來(lái)鑒定 AP超過(guò)50mV / ms并且根據(jù)

15、全或無(wú)代。刺激閾值是最低強(qiáng)度刺激所需的誘導(dǎo)AP。這是由200毫秒確定的電流步長(zhǎng)（10e150 pA, 10epA增量）。 振幅（從基線到峰值）和持續(xù)時(shí)間（在 20mV以上測(cè)量閾 值）。 檢查重復(fù)AP點(diǎn)火，一串強(qiáng)度為 40 pA的1 s電流高于刺激閾值，并注射細(xì)胞的反應(yīng) 記錄。 對(duì)于自發(fā)性突觸后電流 （sPSC記錄，在？ 70mV的保持電位下記錄 sPSCt用EPC-9 放大器（HEKA,德國(guó)）。所有信號(hào)都被數(shù)字化在10kHz下，在2kHz下過(guò)濾，存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)硬盤(pán)上，并用Igor Pro 4.05軟件（Wavemetrics,美國(guó)）。2.9。 數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)表示為平均值土 SEM。通過(guò)分析數(shù)據(jù)雙向

16、或單因素方差分析，然后進(jìn)行Tukeys事后檢驗(yàn)。Ap值小于0.05被認(rèn)為是顯著的。2.10。 討論3.1。 石墨基板制備石墨烯膜通過(guò)化學(xué)氣相合成沉積（CVD）法26,然后轉(zhuǎn)移到組織培養(yǎng)聚苯乙烯（ TCPS基板（僅TCPS對(duì)照底物）。石墨烯膜顯示出良好的透光特性（圖1A）。 基于對(duì)光透射率（在波長(zhǎng)處？ 90%的光透射率的500e1000nm）和室溫微拉曼光譜的石墨烯薄膜，我們估計(jì)石墨烯薄膜包含 3e5層27,這進(jìn)一步驗(yàn)證通過(guò)透射電子顯微鏡（TEM）圖像（圖1B）。的石墨烯膜的表面通過(guò)SEM （圖1E）和原子力顯微鏡（AFM）成像由許多波紋組成和微米級(jí)的皺紋（圖1C）。表面通過(guò)X射線進(jìn)一步檢查石墨

17、烯膜的化學(xué)光電子能譜（XPS）。 。 1D,兩個(gè)明顯的組成部分可以觀察到，主峰在284.6 eV對(duì)應(yīng)到非氧化環(huán) C,和反射的小峰在 CeO鍵中的Co這些結(jié)果表明相對(duì)惰性的表面化學(xué)。在用層粘連蛋白預(yù)包被后，據(jù)信是可用于NSC附著和生長(zhǎng)，石墨烯顯示支持NSC增長(zhǎng)與單獨(dú)的TCP涮當(dāng)?shù)哪芰Γ〝?shù)據(jù)不是顯示）。此 外，由石墨烯的I-V曲線計(jì)算膜的薄層電阻在50mm內(nèi)為約350U。 50mm尺寸（圖1F）,其與報(bào)告的薄層電阻相當(dāng)?shù)氖┠?8。3.2。 石墨烯基板上的 NSC生長(zhǎng)在使用前通過(guò)幾種方法檢查NSCs自由浮動(dòng)可以在增殖條件下在DIV5形成神經(jīng)球（補(bǔ)充圖S1A）,其被接受為 NSC的證據(jù)存在。此外，

18、對(duì)巢蛋白（一種 NSC標(biāo)記）顯示大多數(shù)細(xì)胞是巢蛋白陽(yáng)性（補(bǔ)充圖。S1B和C）,進(jìn)一步在本研究中提供NSCs的驗(yàn)證。在增殖或分化下培養(yǎng)幾天后條件（見(jiàn)材料與方法部分）的特點(diǎn)的NSCs及其后代，包括粘附，遷移，形態(tài)學(xué)和生存力，仔細(xì)檢查了石墨烯基質(zhì)。接種2e4小時(shí)后，細(xì)胞粘附石墨烯基板（數(shù)據(jù)未示出）。一周后播種，SEM顯微照片顯示石墨烯上的細(xì)胞通過(guò)廣泛鋪展和形成表現(xiàn)出健康的粘附強(qiáng)絲狀偽足/石墨烯相互作用（補(bǔ)充圖S2A）。還有，針對(duì)紐蛋白，膜性骨骼的免疫熒光染色蛋白參與粘連，顯示豐富在NSCs中的紐蛋白的表達(dá)（補(bǔ)充圖S2B）,提示細(xì)胞在石墨烯膜上的良好粘附。國(guó)家統(tǒng)計(jì)委員會(huì)生長(zhǎng)在石墨烯膜上表現(xiàn)出正常的容量

19、早在接種后一天從神經(jīng)球遷移（補(bǔ)充圖S2C。 此外，細(xì)胞（特別是神經(jīng)元）生長(zhǎng)在石墨烯基板上顯示典型的細(xì)胞體形態(tài)和大小伴隨正常軸突生長(zhǎng)和擴(kuò)展。最后，石墨烯上的細(xì)胞活力通過(guò)鈣黃綠素-AM和EthD-1染色評(píng)價(jià)底物測(cè)定。 補(bǔ)充圖S2E顯示幾乎90%的細(xì)胞在石墨烯上培養(yǎng) 7 天是活的，并且沒(méi)有石墨烯和TCPM間的細(xì)胞活力的顯著差異在增殖條件下控制7天的培養(yǎng)（補(bǔ)充圖S2F）。這些數(shù)據(jù)證明了好石墨烯作為NSC培養(yǎng)基質(zhì)的生物相容性生長(zhǎng)，這與以前的研究一致7。值得提，我們的研究調(diào)查的直接互動(dòng)的效果在細(xì)胞和石墨烯之間。其他研究顯示的可能性操縱有效的細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-材料耦合3周神經(jīng)干細(xì)胞29和刺激分化的后顯影的非

20、接觸電刺激，以控制細(xì)胞-細(xì)胞使用石墨烯材料30。這些研究可能開(kāi)放基于石墨烯用于充實(shí)細(xì)胞耦合的新方法組織工程神經(jīng)修復(fù)和再生。3.3。 細(xì)胞在石墨烯上的被動(dòng)生物電特性基板石墨烯對(duì)細(xì)胞的最直接和明顯的影響應(yīng)該是在細(xì)胞膜上?？紤]離子的重要作用用于控制細(xì)胞功能的膜中的通道和泵，石墨烯上膜生物電特性的可能變化需要先解決。在這里，我們專(zhuān)注于兩者被動(dòng)和主動(dòng)電氣活動(dòng)。此外，我們?cè)噲D闡明發(fā)展之間的可能關(guān)系NSCs的生物電性能和隨后的行為這些細(xì)胞通過(guò)探索NSCs中的表型變化生長(zhǎng)在石墨烯基板上。評(píng)彳t NSCs的被動(dòng)電學(xué)性質(zhì)和活性和他們的后代在石墨烯基板的開(kāi)發(fā)過(guò)程中徹底檢查各種電 生理參數(shù)在增殖和分化條件下。后緊緊地

21、粘附到基底上，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理全細(xì)胞膜片鉗記錄每天。我們測(cè)量和量化了被動(dòng)膜的性質(zhì)，包括電容，輸入電阻（Rin）和靜息膜電位（VR）。在電容或Rin之間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著差異控制和石墨烯組在增殖和分化條件在體外7天（DIV7）（增殖：18.32.6pF 和 24.2 3.4pF; 344.2 22.8 MU362.7 24.8 MU;分別為 n = 60 ,對(duì)照 和石墨烯，圖。2A）（分化：19.5 1.8pF 和 22.5 2.0pF;260.3 26.3 MU 和 251.3 27.0 MU; 兩者n = 60,控制和石墨烯。2B）。在我們的研究中的 NSCs的Rin類(lèi)似于以前研究中報(bào)道的值31,3

22、2。注意Rin在分化條件下比在增殖下更小兩組均表現(xiàn)為正常分化NSCs到神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，因?yàn)镹SC后代通常具有降低 Rin。這些結(jié)果表明石墨烯偶聯(lián)沒(méi)有改變細(xì)胞膜的電容或Rin。VR作為另一種重要的被動(dòng)膜生物電參數(shù)，進(jìn)一步分析。VR是相對(duì)靜態(tài)的膜靜止細(xì)胞的電位并且不同于特異性動(dòng)態(tài)電化學(xué)動(dòng)作電位（AP）,如下所述。這些參數(shù)被廣泛接受為度的指標(biāo)細(xì)胞發(fā)育和健康33。有趣的是，NSCs和他們?cè)谑┗咨仙L(zhǎng)的后代具有VR的值比來(lái)自DIV5的對(duì)照在增殖下更負(fù)條件（兩組的n 50,從DIV5至DIV7的p 9, p 0.05）。 NSCsE石墨烯基底下的干度通過(guò)western印跡分析檢查增殖條件。NS

23、Cs通常在增殖培養(yǎng)中不容易分化介質(zhì)，并且它們傾向于保持干燥。眾所周知不同的細(xì)胞類(lèi)型保持不均勻的VR,所以我們調(diào)查生長(zhǎng)在石墨烯上的細(xì)胞的更負(fù)VR是否到期到一些神經(jīng)干細(xì)胞的分化。Western印跡結(jié)果顯示巢蛋白的表達(dá)，神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記35從DIV6eDIV7顯著下調(diào)（圖3EeF）,甚至在增殖條件下。很難確定是否在石墨烯基板上產(chǎn)生更負(fù)的VR在NSC分化或如果它是石墨烯誘導(dǎo)的NSC分化導(dǎo)致更負(fù)面的 VR。但是，我們推測(cè)它是在石墨烯偶聯(lián)時(shí)觀察到的更負(fù)的VR誘導(dǎo)NSC分化，因?yàn)闆](méi)有明顯的在石墨烯組中巢蛋白表達(dá)的下調(diào)DIV5與對(duì)照相比，即使 VR更負(fù)在DIV5。石墨烯基板上的電 池顯示更負(fù)的 VR當(dāng)在分化培養(yǎng)

24、基中生長(zhǎng)時(shí)比它們?cè)谏峡刂疲▓D4A）?？刂坪褪┲g的差異組在分化時(shí)更明顯（從DIV3到DIV14）條件下比較差異增殖條件。這些結(jié)果表明石墨烯底物可能加速NSCs的生物電成熟術(shù)語(yǔ)的 VR在沒(méi)有實(shí)質(zhì)性變化的情況下測(cè)量性能。我們進(jìn)一步分析了分化的表型變化NSCs在石墨烯基材上。分化7天后，細(xì)胞展示細(xì)長(zhǎng)形細(xì)胞與健康神經(jīng)突生長(zhǎng)導(dǎo)致匯合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)幾乎跨越整個(gè)石墨烯表面。免疫染色結(jié)果表明石墨烯膜上的NSCs保持了其多能性以分化成所有三種神經(jīng)亞型（圖4B）,包括神經(jīng)元（Tuj-1沉積細(xì)胞），星形膠質(zhì)細(xì)胞（ GFAP陽(yáng)性細(xì)胞）少突膠質(zhì)細(xì)胞（O4-陽(yáng)性細(xì)胞）。如圖所示。 4C, NSCs培養(yǎng)在石墨烯上顯示出顯著更

25、高的百分比Tuj-1沉積細(xì)胞與對(duì)照組相比，GFAP陽(yáng)性或O4-陽(yáng)性細(xì)胞在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間。這些結(jié)果清楚地表明石墨烯基材可以大大增強(qiáng)NSC分化為神經(jīng)元。接下來(lái)，在 NSCs的后代中的VR在它們分化7天后計(jì)算。星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞不容易在明場(chǎng)下鑒定顯微鏡，所以他們都包括作為膠質(zhì)細(xì)胞。VR在兩者神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞在石墨烯基板上顯著與在對(duì)照底物上生長(zhǎng)的那些相比更負(fù)（圖4D;神經(jīng)元：對(duì)石墨烯為？ 61.41.4mV和？ 64.3 1.4mV和控制；膠質(zhì)細(xì)胞：e78.5 2.3 mV和石墨烯和對(duì) 照，分別為85.7 2.5 mV。 n 40, p 0.05 ）。 間隔在尖峰序列內(nèi)兩個(gè)連續(xù)的AP之間增加，

26、并且在尖峰序列方面在石墨烯和對(duì)照之間沒(méi)有顯著差異（圖6D）。的倒數(shù)計(jì)算穗間隔以表示瞬時(shí)AP發(fā)射速率。 圖。圖6E示出了誘發(fā)AP的疊加軌跡從在從中采樣的尖峰序列中的穩(wěn) 態(tài)AP細(xì)胞生長(zhǎng)在石墨烯和 TCPS。尖峰在重復(fù)期間展寬射擊是神經(jīng)元中的廣泛現(xiàn)象。在我們的實(shí)驗(yàn)中，APs表現(xiàn)出持續(xù)增加的持續(xù)時(shí)間兩個(gè)培養(yǎng)組中的前五個(gè)AP,隨后是具有穩(wěn)態(tài)持續(xù)時(shí)間的 AP （圖6E）。在這些細(xì)胞中，平均值第一 AP的持續(xù)時(shí)間為2.15 0.09ms （n =18）和2.050.08 ms （n = 16）,穩(wěn)態(tài)持續(xù)時(shí)間為在對(duì)照中為3.120.11ms （n = 18）和3.170.13ms （n = 16）石墨烯。 這

27、些結(jié)果表明石墨烯具有加諫牛物電的成熟的能力性狀的 NSCsR不同的發(fā)育階段和它在分化成神經(jīng)元的NSCs已經(jīng)成熟N后不能影響離子通道3.6。 神經(jīng)元成熟和功能進(jìn)一步確認(rèn)生物電發(fā)展的后果對(duì)神經(jīng)元成熟和石墨烯基板上的功能，觀察和分析了幾個(gè)參數(shù)，包括脊柱密度，突觸蛋白表達(dá)和自發(fā)性突觸后電流（sPSCS ,在分化白文化21天。首先，通過(guò)熒光檢查脊柱密度顯微鏡下細(xì)胞轉(zhuǎn)染mCherry-肌動(dòng)蛋白后（圖7A）。棘是小膜突起，并作為突觸強(qiáng)度的儲(chǔ)存位點(diǎn) 51。脊柱密度，如圖所示計(jì)數(shù)每10mm樹(shù)突的棘突數(shù)。脊 柱密度石墨烯組顯著高于對(duì)照組（圖7B）。第二，突觸蛋白表達(dá)，包括突觸泡蛋白和 PSD95,通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分

28、析（圖7C）。發(fā)現(xiàn)兩者的相對(duì)蛋白表達(dá)的突觸素和PSD95在石墨烯組較高（圖7D）。最后，突觸活動(dòng)，特點(diǎn)是sPSC減功記錄在NSC分化的神經(jīng)元中組 （圖7E）。 sPSCS勺外觀提供清楚功能性突觸形成的證據(jù)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明石墨烯中 sPSCS勺平均頻率和振幅組顯著高于對(duì)照組（圖7F和G,分別）。sPSCs的頻率和振幅的增加在石墨烯組中表明存在局部變化石墨烯基板上的前和后突觸特征。注意，形成和在石墨烯基材料上神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的再生非常需要它們?cè)谏窠?jīng)系統(tǒng)中的應(yīng)用52。然而，我們沒(méi)有嘗試調(diào)查 NSC分化的形成神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)在這里，因?yàn)檫@是超越我們目前的研究范圍。此外，圖1中的突觸電流。 7有間接暗示細(xì)胞中的健康神

29、經(jīng)元接觸石墨烯基板。3.7。 石墨烯基板上的電場(chǎng)的建模。微環(huán)境中的電場(chǎng)可能影響成熟和發(fā)展的生物電特性細(xì)胞膜。因此，我們假設(shè)電場(chǎng)開(kāi)導(dǎo)電石墨烯基板可能不同于非導(dǎo)電基板控制基板。驗(yàn)證我們的假設(shè)，COMSOL多物理場(chǎng)被用來(lái)重塑和計(jì)算電場(chǎng)分布?？紤]表面的對(duì)稱性基底其中細(xì)胞附著和生長(zhǎng)，我們比較電場(chǎng)沿著通過(guò)單個(gè)電池的中心的軸使用一維模型（圖8A和B）來(lái)獲得更好的理解兩個(gè)底物上的細(xì)胞生長(zhǎng)。為了簡(jiǎn)化系統(tǒng)的建模，NSC被認(rèn)為是是具有 5mm直徑和高度的表面帶電圓柱體的4mm等于NSC的尺寸。 在NSC的過(guò)程中分化，NSCs的VR及其后代轉(zhuǎn)移？ 40mV至？ 80mV, 這也通過(guò)我們的研究證實(shí)（圖 4A）。假設(shè)膜的

30、比電容是 1 mF / cm2,膜的表面電荷密度可 以達(dá)到計(jì)算為Q =C x V，其中Q是表面電荷密度，C是特定面積電容，V是內(nèi)部和外部之間的電位膜。因此表面電荷密度轉(zhuǎn)變？ 4 10 -4 C / m 2至？ 10 -4 C / m2。在。之間圓柱體和基底，有一層介 電介質(zhì)具有a相對(duì)介電常數(shù)為 2.15e,等于各層聚-L-鳥(niǎo)氨酸（PLO）和層粘連蛋白（LN）用 橢偏儀測(cè)量的 NSC培養(yǎng)中的底物（M-2000DI, J.A.Wo011am Co., USA）。介電常數(shù)培養(yǎng)基為 ? 80 （類(lèi)似于間質(zhì)液體），并且在襯底的中心的電位為零（用PLO-LN涂覆的石墨烯）。我們首先模擬表面的電場(chǎng)使用僅一個(gè)細(xì)胞坐標(biāo)的情況來(lái)定位細(xì)胞點(diǎn)（0,0）,其是表面的中心，具有密度的表面電荷 ？ 10 -4 C / m 2。圖。圖8A和B示出了差值電場(chǎng)線的分布導(dǎo)致 的差異基底的導(dǎo)電性。電場(chǎng)線，表示電場(chǎng)的取向和強(qiáng)度是垂直的到表面，它們延伸遠(yuǎn)離中心導(dǎo)電石墨烯基板（圖 8A）。相比之下，電