2002年全國中學(xué)生生物奧賽教練員培訓(xùn)班分子生物學(xué)...

1、2002 年全國中學(xué)生生物奧賽教練員培訓(xùn)班一一分子生物學(xué)專題分子生物學(xué)基礎(chǔ)理論DNA 復(fù)制基因轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)生物合成基因表達(dá)的調(diào)控基因工程專題內(nèi)容（一）復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯（二）基因表達(dá)調(diào)控（三）基因工程（一） 復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯遺傳信息以遺傳密碼的形式編碼在DNA 分子上，表現(xiàn)為特定的核苷酸順序，并通過DNA 復(fù)制由親代傳遞給子代。在后代的生長發(fā)育中，遺傳信息通過DNA 轉(zhuǎn)錄成 RNA，然后由 RNA 翻譯成特定的蛋白質(zhì)，通過蛋白質(zhì)執(zhí)行各種生命功能，將生命的遺傳特征體現(xiàn)出 來。1 DNA 復(fù)制DNA 復(fù)制是指以親代 DNA 分子的兩條鏈為模板合成各自的互補(bǔ)鏈，形成兩個(gè)子代 DNA分子的過程。復(fù)制的過程

2、是半保留模式和不連續(xù)的。復(fù)制過程是由一系列酶和蛋白質(zhì)參與的。復(fù)制開始時(shí)，親代雙螺旋 DNA 鏈?zhǔn)紫缺仨毥忾_螺旋，成為兩條獨(dú)立的單鏈分子，以作 模板之用，催化完成這步反應(yīng)的主要是解螺旋酶，Rep 蛋白幫助解開雙螺旋。解開的兩條單鏈隨即被單鏈結(jié)合蛋白所覆蓋，作用是阻止單鏈本身折疊配對(duì)形成雙鏈DNA，并保護(hù)單鏈部分不被核酸酶降解。 DNA 復(fù)制過程中擔(dān)任 DNA 合成的酶是 DNA 聚合酶，只能從 5宀 3 的方向逐個(gè)連入核苷酸。因此只能利用35 方向的模板鏈合成子鏈，合成方向?yàn)?宀 3,稱為前導(dǎo)鏈。由于親代 DNA 雙鏈中只有一條鏈的方向?yàn)?3 T5 ,故另一條鏈 （5T3 ）的復(fù)制只能先合成多個(gè)

3、小片段DNA （稱為岡崎片段），然后連接成長的鏈，稱為滯后鏈。合成岡崎片段之前需由引物合成酶先合成一小段RNA 引物。在此引物 3 -OH端由 DNA 聚合酶 III 沿 5T3 的方向催化合成小的岡崎片段。之后由 DNA 聚合酶 I 切除RNA 引物，并填補(bǔ)修復(fù)缺口。最后由DNA 連接酶將多個(gè)小片段 DNA 連接成長鏈。而 3 T5方向的模板鏈可以在一個(gè)引物上連續(xù)進(jìn)行5 T3 方向的鏈合成。而模板鏈可以在一個(gè)引物上連續(xù)進(jìn)行 5T3方向的鏈合成。DNA 復(fù)制所需的酶和蛋白質(zhì)酶和蛋白質(zhì)作用拓?fù)洚悩?gòu)酶幫助解開復(fù)制叉前后的超螺旋結(jié)構(gòu)DNA 解螺旋酶解開超螺旋Rep 蛋白幫助解開雙螺旋引物合成酶合成

4、RNA 引物單鏈結(jié)合蛋白穩(wěn)定單連區(qū)DNA 聚事酶 III合成 DNADNA 聚合酶 1消除引物，填滿裂隙DNA 連接酶連接 DNA 末端2 基因轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后加工轉(zhuǎn)錄是以 DNA 為模板，在 RNA 聚合酶作用下合成 RNA 的過程，是遺傳信息從 DNA 向 RNA 傳遞的過程，是遺傳信息表達(dá)的第一步。轉(zhuǎn)錄單位是指RNA 聚合酶作用的起始點(diǎn)與終止點(diǎn)之間的 DNA 順序；啟動(dòng)子是 DNA 分子上可與 RNA 聚合酶特異性結(jié)合， 而使轉(zhuǎn)錄 開始的一段DNA 序列；增強(qiáng)子是包括啟動(dòng)子上游與啟動(dòng)子重疊的一段DNA 序列，使啟動(dòng)子發(fā)動(dòng)轉(zhuǎn)錄的能力大大增強(qiáng)。轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)使 mRNA 從轉(zhuǎn)錄復(fù)合物上釋放出來而終

5、止轉(zhuǎn)錄。DNA 指導(dǎo)的 RNA 聚合酶在 RNA 合成中起催化作用?？梢宰R(shí)別DNA 分子中起始區(qū)的啟動(dòng)子，使 DNA 部分雙螺旋解開，解開長度為17bp，從而產(chǎn)生單鏈 DNA 模板，并選擇正確的核糖核苷酸催化形成磷酸二酯健。能識(shí)別轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)， 并可與調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的活化蛋白或阻遏蛋白作用，從而對(duì)基因的表達(dá)起調(diào)控制作用。轉(zhuǎn)錄起始時(shí)，必須有一些蛋白質(zhì)因子參與，稱為轉(zhuǎn)錄因子，作用是幫助 RNA 聚合酶結(jié)合到啟動(dòng)子上。 包括：TF2D、TF2A、TF2B、TF2H、 TF2E、TF2H 等。轉(zhuǎn)錄起始時(shí)，RNA 聚合酶識(shí)別結(jié)合啟動(dòng)子，并解除啟動(dòng)子區(qū)域雙螺旋結(jié)構(gòu)，解開的以 鏈相當(dāng)于 17個(gè)堿基對(duì)，開始催化合成

6、 RNA。轉(zhuǎn)錄延長階段，RNA 聚合酶沿模板 3 宀 5 方向移動(dòng)，并按模板的堿基序列，配對(duì)加入四種核苷酸，進(jìn)行RNA 的聚合。RNA 的合成方向沿著 53方向進(jìn)行。酶前面的 DNA 雙螺旋不斷解開，后面的 DNA 重新回復(fù)到雙螺旋結(jié)構(gòu)，同時(shí) RNA 鏈也不斷地從 RNA-DNA 雜交體中分離出來。轉(zhuǎn)錄終止時(shí)，RNA 聚合酶停止作用，RNA 合成終止。新生的 RNA 鏈釋放，局部解開的 DNA 回復(fù)到雙螺旋結(jié)構(gòu)， 酶從模板上釋放出來。轉(zhuǎn)錄過程即告結(jié)束。轉(zhuǎn)錄后加工：按照 DNA 模板轉(zhuǎn)錄生成的 RNA 鏈經(jīng)過修飾、切除和拼接等反應(yīng)，去除 非編碼序列，形成成熟的、具有功能的RNA 分子，這一過程稱

7、為 RNA 轉(zhuǎn)錄后加工。原核生物的 mRNA 不需要修飾加工，在它的 3端尚未完成轉(zhuǎn)錄前，其 5端已與核糖體結(jié)合， 開始蛋白質(zhì)的合成，即轉(zhuǎn)錄與翻譯偶聯(lián)。真核生物的轉(zhuǎn)錄在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行，而翻譯過程在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行，轉(zhuǎn)錄和翻譯在時(shí)間和空間上是分開的。真核生物的 mRNA 在細(xì)胞核中合成后，還必須經(jīng)過一系列的加工處理，才能到達(dá)細(xì)胞質(zhì)中指導(dǎo)蛋白的合成。轉(zhuǎn)錄后加工包括：5端加帽，即新合成的 mRNA 的 5 端與第 7 位碳原子被甲基化了的鳥嘌呤核苷酸在酶的作 用下相連的過程，有提供核糖體的識(shí)別位點(diǎn)和使mRNA 避免受到磷酸酶和核酸酶的攻擊等作用。3端加多聚腺苷酸尾，即在多聚腺苷酸聚合酶的催化下，在mRNA

8、 的 3端連接多聚腺苷酸（polyA ），具有增加 mRNA 的穩(wěn)定性和增加翻譯效率的功能。mRNA 前體的剪接，大多數(shù)真核基因都是由蛋白編碼序列和非編碼序列組成，編碼序列稱為外顯子， 非編碼序列稱為內(nèi)含子。外顯子往往被內(nèi)含子隔開，形成相間排列方式。 在基因轉(zhuǎn)錄中，內(nèi)含子和外顯子同時(shí)被轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)物為 RNA 前體。在形成成熟的 mRNA 時(shí)，內(nèi)含子被切除，外顯子被順序 連接，稱為剪接。因此，基因在轉(zhuǎn)錄為 RNA 前體后，還必須經(jīng)這樣一系列的加工處理，才能到達(dá)細(xì)胞質(zhì)中指導(dǎo)蛋白的合成。3蛋白質(zhì)的牛物合成蛋白質(zhì)的生物合成是存在于 mRNA 中且由堿基序列決定的遺傳信息被表達(dá)為蛋白質(zhì)的 過程。參與蛋白質(zhì)

9、合成的元件主要有mRNA、tRNA、核糖體。mRNA 攜帶遺傳信息，是蛋白質(zhì)合成的直接模板，tRNA 轉(zhuǎn)運(yùn)特異性氨基酸進(jìn)行蛋白質(zhì)的生物合成，核糖體是蛋白質(zhì)合 成的場(chǎng)所。一個(gè)核糖體有兩個(gè) tRNA 位點(diǎn)：P 位點(diǎn)和 A 位點(diǎn)。攜帶新生肽的 tRNA （肽酰 tRNA ） 占據(jù) P 位點(diǎn)，新進(jìn)入的攜帶氨基酸的 tRNA （氨酰 tRNA ）結(jié)合在 A 位點(diǎn)。新進(jìn)入的氨酰 tRNA 的反密碼子與 mRNA上的密碼子配對(duì)，結(jié)合在 A 位點(diǎn)。核糖體的組分催化肽酰tRNA 攜帶的多肽被轉(zhuǎn)移至氨酰 tRNA 所攜帶的氨基酸，肽健形成。P 位點(diǎn)上的 tRNA 卸下肽鏈而成為無負(fù)載的脫酰 tRNA。一個(gè)新生的肽

10、酰 tRNA 在 A 位點(diǎn)形成。在前一個(gè)肽鏈的基礎(chǔ)上長一個(gè)氨基酸殘基。核糖體沿著 mRNA 移動(dòng)一個(gè)密碼子的距離，即轉(zhuǎn)位。使脫酰 tRNA 移出 P 位 點(diǎn)，新的肽酰 tRNA 移入 P 位點(diǎn)。待轉(zhuǎn)譯的下一個(gè)密碼子正位于A 位點(diǎn)，準(zhǔn)備讓下一個(gè)新的氨酰 tRNA 進(jìn)入。脫酰 tRNA 離開核糖體，轉(zhuǎn)運(yùn)新的氨基酸。此合成周期循環(huán)重復(fù)，至加 入最后一個(gè)氨基酸。核糖體識(shí)別終止密碼子，釋放已合成完畢的肽鏈，核糖體同mRNA 分離，蛋白質(zhì)合成結(jié)束。(二)基因表達(dá)調(diào)控現(xiàn)已揭示細(xì)菌基因組有 4000 個(gè)基因，人類基因組有 30 000 個(gè)基因，但其中只有一部分 基因在特定的時(shí)間內(nèi)表達(dá)。 在多細(xì)胞真核生物的發(fā)育

11、過程中， 某些影響細(xì)胞分化的蛋白僅在 某種細(xì)胞中存在很短一段時(shí)間。各種具有不同功能的細(xì)胞所表達(dá)的基因產(chǎn)物也有很大差別。一個(gè)典型的例子就是紅細(xì)胞中需要絕對(duì)高濃度的血紅蛋白，而其他體細(xì)胞中則不是這樣，成熟的紅細(xì)胞中血紅蛋白基因呈現(xiàn)高水平表達(dá)，產(chǎn)生的大量血紅蛋白滿足了紅細(xì)胞運(yùn)輸氧和二氧化碳的功能。這里就有一個(gè)基因的調(diào)控問題?；虮磉_(dá)由一定的調(diào)控機(jī)制決定，呈現(xiàn)一定的時(shí)間順序和空間順序。在多細(xì)胞生物的生長發(fā)育過程中，相應(yīng)的基因按一定的時(shí)間順序開啟或關(guān)閉，決定細(xì)胞向特定的方向分化和發(fā)育。多細(xì)胞生物同一基因產(chǎn)物在不同的組織器官中的分布是不同的，某些基因在一種組織細(xì)胞中暫不表達(dá)或永不表達(dá)， 而另外一些基因則可

12、能是相反的情況。任何影響轉(zhuǎn)錄核翻譯過程的啟動(dòng)、關(guān)閉和速率的較為直接的因素及其作用，叫做基因表達(dá)的調(diào)控。1.基因表達(dá)調(diào)節(jié)模式根據(jù)調(diào)控蛋白對(duì) RNA 聚合酶活性調(diào)節(jié)可將基因表達(dá)調(diào)控分為正調(diào)控和負(fù)調(diào)控。正調(diào)控 是指激活物結(jié)合到啟動(dòng)子附近從而增強(qiáng)RNA 聚合酶的結(jié)合與活性。激活物與信號(hào)分子的相互作用既可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)也可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的減弱。有時(shí)信號(hào)分子的作用使結(jié)合在 DNA 上的激活物脫落，轉(zhuǎn)錄停止；有時(shí)信號(hào)分子的作用使激活物結(jié)合在DNA 上，轉(zhuǎn)錄得以進(jìn)行。負(fù)調(diào)控是指阻遏物結(jié)合到啟動(dòng)子附近而阻遏RNA 聚合酶與啟動(dòng)子的相互作用。阻遏物與信號(hào)分子的相互作用既可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)也可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的減弱，某些情況下，信

13、號(hào)分子與結(jié)合在DNA 上的阻遏物作用，構(gòu)象的變化使結(jié)合在DNA 上的阻遏物脫落，轉(zhuǎn)錄得以進(jìn)行；有時(shí)，信號(hào)分子與非活性狀態(tài)的阻遏物相互作用使阻遏物結(jié)合到DNA 上，阻遏轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行。2 原核基因表達(dá)調(diào)控(1 )原核基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)調(diào)控元件的特點(diǎn)原核生物是較為簡(jiǎn)單的生物體系，它們的基因組成較真核生物簡(jiǎn)單。原核生物的基因組僅包含一條染色體。 基因是連續(xù)的，沒有內(nèi)含子，而且絕大部分基因編碼蛋白，只有小部分 不翻譯。幾個(gè)功能相關(guān)的基因成簇地串聯(lián)排列于染色體上，共同組成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，受同一個(gè)啟動(dòng)基因控制，組成的基因表達(dá)調(diào)控單元，叫做操縱子，原核生物的一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位編碼多條肽鏈。以操縱子為調(diào)控單位進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是

14、原核基因表達(dá)調(diào)控的基本方式。此外，原核基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯是偶聯(lián)的，幾乎在轉(zhuǎn)錄的同時(shí)翻譯過程也在核糖體中進(jìn)行。(2 )原核基因表達(dá)調(diào)控方式一一乳糖操縱子模型通過代謝物調(diào)節(jié)基因活性是原核基因最普遍的一種調(diào)控方式，是指在一些代謝物的作用下，通過一些調(diào)節(jié)蛋白的作用，使基因活化或阻遏。 其中最突出也是研究最早的一個(gè)例子便是大腸桿菌的乳糖操縱子模型。在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基中，細(xì)菌優(yōu)先利用葡萄糖作為能量來源。在只有乳糖的培養(yǎng)基中，細(xì)菌的生長在開始階段不好，但過一段時(shí)間后，在乳糖的誘導(dǎo)作用下，細(xì)菌就可以表達(dá)出分解和利用乳糖的酶：3-半乳糖苷酶一將乳糖轉(zhuǎn)變?yōu)楫悩?gòu)乳糖；3-半乳糖苷透過酶協(xié)助乳糖分子透過細(xì)胞膜進(jìn)

15、入胞內(nèi)；3-半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶?？刂七@三個(gè)基因表達(dá)的調(diào)控單元就是乳糖操縱子，包括：3 個(gè)結(jié)構(gòu)基因 z、y、a,分別編碼3-半乳糖苷酶、3-半乳糖苷透過酶、3-半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶；操縱基因o,是阻遏蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)阻遏蛋白與操縱基因結(jié)合時(shí)，lac mRNA 的轉(zhuǎn)錄受阻；調(diào)節(jié)基因 i，編碼阻遏蛋白，可與 O 基因 結(jié)合；啟動(dòng)基因 p，位于 i 和 o 之間。在培養(yǎng)基中沒有乳糖存在時(shí)，i 基因編碼的阻遏物結(jié)合在 o 區(qū)，結(jié)合到啟動(dòng)子 p 區(qū)的 RNA 聚合酶便不能越過 o 區(qū)到達(dá)結(jié)構(gòu)基因區(qū)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，lac 操縱子處于阻遏狀態(tài)。但即便在阻遏狀態(tài)，lac 操縱子也存在本底表達(dá)，每個(gè)細(xì)胞中可能有幾個(gè)

16、3-半乳糖苷酶及透過酶生成。當(dāng)有乳糖存在時(shí)，在單個(gè)透過酶分子作用下，少量乳糖 分子進(jìn)入細(xì)胞，又在單個(gè)3-半乳糖苷酶分子作用下轉(zhuǎn)變?yōu)楫悩?gòu)乳糖，而異構(gòu)乳糖是 lac 操縱子的誘導(dǎo)物。異構(gòu)乳糖與阻遏物結(jié)合后，使阻遏物失活，這樣轉(zhuǎn)錄開始。這些mRNA 翻譯出大量的3-半乳糖苷酶和透過酶，使大量的乳糖進(jìn)入細(xì)胞，從而使 lac 操縱子更大限度地去 阻遏，產(chǎn)生更多的可以分解代謝乳糖的酶。3.真核基因表達(dá)調(diào)控真核生物與原核生物在基因表達(dá)調(diào)控上最主要的區(qū)別在于原核生物只要通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控 來開啟或關(guān)閉某些基因的表達(dá)以適應(yīng)環(huán)境條件的變化，而對(duì)大多數(shù)真核生物來說，基因表達(dá)調(diào)控最明顯的特征是能在特定的細(xì)胞中激活特定的基因

17、，從而實(shí)現(xiàn)有序的、不可逆轉(zhuǎn)的分化發(fā)育過程，并使特定的組織和器官行使不同的功能。真核生物基因表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜性和特殊性是由其自身的基因結(jié)構(gòu)的特殊性、基因組的特點(diǎn)以及真核細(xì)胞的復(fù)雜性決定的。(1 )真核基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)調(diào)控元件的特點(diǎn)真核生物的基因組十分龐大， 而有編碼功能的基因只占全部基因組的一小部分。大部分基因組 DNA 不具有直接的遺傳學(xué)功能，很可能在基因復(fù)制或基因表達(dá)中起調(diào)節(jié)作用，真核 生物 DNA 中含有大量重復(fù)序列。真核生物的基因組有內(nèi)含子，體現(xiàn)了真核基因的不連續(xù)性。 內(nèi)含子和外顯子共同被錄，然后在形成成熟的mRNA 時(shí)，內(nèi)含子被切除，外顯子被順序連接，稱為剪接。對(duì)于同一個(gè)初級(jí)轉(zhuǎn)錄本，不同的

18、剪接方式產(chǎn)生不同的mRNA，可翻譯成不同的多肽，因此初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的剪接過程是真核基因表達(dá)調(diào)節(jié)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。真核生物的一個(gè)基因?qū)?yīng)于一條 mRNA，只編碼一條多肽鏈。此外，轉(zhuǎn)錄和翻譯在時(shí)間和空間上是分 離的，轉(zhuǎn)錄在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行，翻譯在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行。(2) 真核基因表達(dá)是多級(jí)調(diào)控從基因的活化到蛋白質(zhì)的合成與分解，有多個(gè)環(huán)節(jié)可以作為控制點(diǎn)，包括：轉(zhuǎn)錄前水平的調(diào)控、轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控、翻譯水平及蛋白質(zhì)加工水平的調(diào)控。其中， 基因在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控是一個(gè)最主要的控制點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄前水平的調(diào)控：通過改變 DNA 序列和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)從而影響基因表達(dá)的過程均屬于 轉(zhuǎn)錄前水平的調(diào)控。包括：染色質(zhì)的丟失、

19、基因擴(kuò)增、染色質(zhì)DNA 序列的重排、染色質(zhì)DNA 的修飾和異染色質(zhì)化等方面。轉(zhuǎn)錄發(fā)生之前，染色質(zhì)會(huì)在特定的區(qū)域被解旋或松馳， 形成自由的DNA，這些變化將導(dǎo)致結(jié)構(gòu)基因的暴露，以使RNA 聚合酶有效地結(jié)合到 DNA模板上，并沿著模板 5宀 3方向進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。因此，被轉(zhuǎn)錄基因的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)要經(jīng)歷一個(gè) 構(gòu)象的變化，進(jìn)入一個(gè)“活化”狀態(tài)。轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控：真核生物基因的表達(dá)調(diào)控除涉及到啟動(dòng)子、RNA 聚合酶活性的調(diào)節(jié)及調(diào)節(jié)蛋白外，還涉及增強(qiáng)子等DNA 元件以及更多的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。轉(zhuǎn)錄因子通過與啟動(dòng)子或增強(qiáng)子結(jié)合，改變 DNA 的構(gòu)象，影響基因轉(zhuǎn)錄。沒有大量的轉(zhuǎn)錄因子，RNA 聚合酶不可能識(shí)別真核生物數(shù)量巨大

20、的啟動(dòng)子。轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控是目前研究最為精細(xì)也是機(jī)體所采取的 最普遍的基因表達(dá)調(diào)控方式，是調(diào)控的基本控制點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控：真核生物的基因轉(zhuǎn)錄在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行，而翻譯則在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行， 這種轉(zhuǎn)錄和翻譯過程的時(shí)空差別使得基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控成為真核基因區(qū)別于原核基因表達(dá) 調(diào)控的一個(gè)重要方面。真核基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄首先形成初級(jí)轉(zhuǎn)錄本，然后經(jīng)過5端加帽、3 端的加尾、剪接等加工后才成為有功能的RNA 分子，被認(rèn)為是產(chǎn)生蛋白質(zhì)多樣性的分子機(jī)制之一。翻譯水平及蛋白質(zhì)加工水平的調(diào)控：翻譯水平的調(diào)控主要是控制mRNA 的穩(wěn)定性和有選擇地進(jìn)行翻譯，是一種快速調(diào)控基因表達(dá)的方式。翻譯后加工指多肽鏈合成后通常需經(jīng)過加工和折疊后

21、才能成為有活性的蛋白質(zhì)。包括蛋白質(zhì)及多肽的切割加工、多肽的化學(xué)修飾(糖基化或磷酸化)以及多肽的剪接等過程，使蛋白成為有生物活性的分子。一種翻譯產(chǎn)物經(jīng)過 不同的加工過程可形成不同活性的產(chǎn)物，這種后加工過程在基因表達(dá)的調(diào)控上起重要作用。(三)基因工程基因工程作為分子生物學(xué)中的核心成分，已滲透到生命科學(xué)研究的每一學(xué)科。在農(nóng)業(yè)、 工業(yè)、環(huán)保業(yè)、醫(yī)藥業(yè)等領(lǐng)域取得了令人矚目的成就。在醫(yī)學(xué)方面，基因工程藥物、基因工 程疫苗、基因工程抗體、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的問世，為人類疾病的診斷和治療作出了重大貢獻(xiàn)。自從 1953 年 Watson 和 Crick 闡明了 DNA 的雙螺旋結(jié)構(gòu)以來，生物學(xué)的發(fā)展進(jìn)入了一 個(gè)全新的階

22、段，即跨入了分子水平。在50、60 年代科學(xué)家們確立了 DNA 復(fù)制、重組修復(fù)、遺傳信息傳遞機(jī)制的中心法則及有關(guān)遺傳密碼等分子遺傳學(xué)理論；發(fā)現(xiàn)了諸如限制性核酸內(nèi)切酶、連接酶等一系列工具酶；在技術(shù)上又發(fā)展了DNA 純化與鑒定等，從而為基因工程學(xué)科的建立奠定了基礎(chǔ)。1973 年，Cohen 等人將帶有四環(huán)素抗性表型的質(zhì)粒pSC101 和帶有新霉素抗性的質(zhì)粒 R6-3 分別用 EcoR1 酶切后，在體外將二者連接起來，然后將產(chǎn)物導(dǎo)入大腸 桿菌，成功地進(jìn)行了無性繁殖，并得到了既抗四環(huán)素又抗新霉素的大腸桿菌，從而完成了 DNA 體外重組和擴(kuò)增的全過程，基因工程這門新興學(xué)科也就應(yīng)運(yùn)而生。基因工程是指在體外

23、條件下，人工將DNA 分子剪切并重新拼接，形成一個(gè)新的雜合的DNA 分子，然后將它導(dǎo)入微生物或真核細(xì)胞內(nèi)，使該分子得到無性繁殖，并可使該基因在 細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的基因產(chǎn)物或改造、創(chuàng)造新的生物類型。 基因工程所采用的基本技術(shù)被稱為 DNA 體外重組技術(shù)，也稱為基因克隆或分子克隆技術(shù)。1 基因工程的基本程序(1) 目的基因的 DNA 片段的帶有獲得；(2) DNA 片段與載體 DNA 的連接，即體外重組；(3) 連接產(chǎn)物導(dǎo)入宿主細(xì)胞；(4) 重組體的擴(kuò)增、篩選與鑒定；(5) 目的基因在細(xì)胞中的表達(dá)；(6 )表達(dá)產(chǎn)物的分離、鑒定等。2.基因工程工具酶基因工程工具酶是進(jìn)行基因工程操作必不可

24、少的工具。包括：限制性核酸內(nèi)切酶和核酸修飾酶。限制性核酸內(nèi)切酶主要來源于原核生物，具有識(shí)別自身 DNA 和異源 DNA 的功能，通過切割破壞或限制異源 DNA 分子侵入宿主細(xì)胞來保護(hù)自身。分為I、II、III 型，常用的是 II 型。為獲得適用于不同目的的核到片段，如DNA 片段間的連接、粘性 DNA 片段的補(bǔ)平或削平、DNA 序列測(cè)定、聚合酶鏈反應(yīng)等，基因工程中還經(jīng)常用到核酸修飾酶。限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別專一的核苷酸順序，并在該順序內(nèi)的固定位置上切割雙鏈DNA ,識(shí)別順序最常見的是 4-6 個(gè)核苷酸，多為回文對(duì)稱序列。有兩種切割方式：當(dāng)它切割雙鏈 DNA 時(shí)，若切割部位在識(shí)別序列的中心軸，產(chǎn)生

25、平末端；不在中心軸，產(chǎn)生帶有單鏈突出 端的 DNA 片段，稱為粘末端。某種 DNA 分子的限制酶位點(diǎn)數(shù)目和排列順序圖譜稱為限制 性內(nèi)切酶圖譜，是基因操作的重要基礎(chǔ)。在基因工程操作中，必須首先了解限制性內(nèi)切酶在目的基因和載體 DNA 上的位置和數(shù)目，才能利用合適的酶切位點(diǎn)進(jìn)行DNA 重組工作。核酸修飾酶的特性及應(yīng)用名稱特性應(yīng)用甲基化酶與限制性內(nèi)切酶組成限制-修飾系統(tǒng)，使 順序中某個(gè)堿基甲基化保護(hù)自身 DNA 不被切開連接酶催化雙鏈 DNA 中相鄰的 5磷酸基團(tuán) 與 3 羥基之間形成磷酸二酯鍵連接具有粘性末端或平末端 的兩個(gè) DNA 片段，成為一個(gè) 重組分子聚合酶以 DNA 或 RNA 為模板在體

26、外合成DAN 或 RNA合成一個(gè)基因或一個(gè)片段，制備 DNA 或 RNA 探針Taq 酶耐熱的 DNA 聚合酶，具有 5 -3 聚合 酶活性，缺乏 3 -5 外切酶活性PCR 反應(yīng)核酸酶是一類降解核酸的酶缺口平移法標(biāo)記探針、制備DNA、RNA 等堿性磷酸酯酶催化水解 DNA、RNA 的 5磷酸基團(tuán)防止載體自身連接環(huán)化等綜上所述，基因工程工具酶就象是外科醫(yī)生的手術(shù)刀一樣，是進(jìn)行基因工程操作必不可少的工具。為便于目的基因與載體之間的連接，應(yīng)根據(jù)它們各自的特點(diǎn)和功能，選擇適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶切酶切割DNA，或利用核酸修飾酶再對(duì)這些酶切后的片段進(jìn)行處理，從而為 DNA 體外重組打下基礎(chǔ)。3載體載體是供插入目的基因并將其導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和復(fù)制的運(yùn)載工具， 常用的有質(zhì)粒、噬體和病毒。質(zhì)粒和噬菌體用于原核細(xì)胞為宿主的分子克隆；動(dòng)物病毒用于真核細(xì)胞為宿主的分子克