基因克隆題源

1、1、 限制性核酸內(nèi)切酶：簡(jiǎn)稱限制酶，是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中某些特定的核苷酸序列，并在該序列切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。2、 同尾酶：末端是相同的限制性核酸內(nèi)切酶。3、 DNA聚合酶：是指那些以DNA或RNA為模板催化合成互補(bǔ)新鏈的酶，這類沒(méi)大都需要一個(gè)引物來(lái)引發(fā)DNA的聚合作用，參與DNA復(fù)制和DNA損傷的修復(fù)。4、 DNA連接酶：簡(jiǎn)稱連接酶，是指在雙鏈DNA分子單鏈間斷處或是兩條DNA片段接頭位置上相鄰的5P和3OH之間催化形成一個(gè)磷酸二酯鍵，使兩個(gè)DNA片段或DNA單鏈間斷連接起來(lái)的一種酶。5、 基因克隆技術(shù)：是包括把來(lái)自不同生物的基因同有自主復(fù)制能力的載體DNA在體外人工連接

2、，構(gòu)建成新的重組的DNA，然后送入受體生物中去表達(dá)。從而產(chǎn)生遺傳物質(zhì)和狀態(tài)的轉(zhuǎn)移和重新組合。6、 載體： 要把一個(gè)有用的基因通過(guò)基因工程手段送進(jìn)生物細(xì)胞中，需要運(yùn)載工具，攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的這種工具叫載體。7、 質(zhì)粒：是細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子，是一類亞細(xì)胞有機(jī)體，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，沒(méi)有蛋白質(zhì)外殼，沒(méi)有細(xì)胞外的生命周期，可以在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立增殖，可以隨宿主細(xì)胞的分裂而被遺傳下去。8、 轉(zhuǎn)化：是感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞捕獲和克隆或表達(dá)質(zhì)粒DNA分子的基因轉(zhuǎn)化方法。9、 轉(zhuǎn)染：是感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞捕獲和表達(dá)噬菌體DNA分子的基因轉(zhuǎn)化方法。10、感受態(tài)細(xì)胞：為了有效地使細(xì)菌吸收外源 DNA分

3、子，通常要對(duì)它們進(jìn)行一些物理或化學(xué)處理，處理后的細(xì)胞吸收外源DNA分子的能力大大提高，這種細(xì)胞被稱為感受態(tài)細(xì)胞。11、藍(lán)白篩選：當(dāng)帶有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中加有X-gal及一種ß-半乳糖苷酶的誘導(dǎo)物IPT是，那些能合成完整ß-半乳糖苷酶的未重組子就會(huì)因它能酶解X-gal而變成深藍(lán)色，而重組子因lacz基因被破壞不能合成完整的ß-半乳糖苷酶而呈白色。12、融合蛋白：由一條短的多肽和真核蛋白質(zhì)結(jié)合在一起的蛋白。13、開(kāi)放閱讀框：在DNA鏈上，由蛋白質(zhì)合成的起始密碼開(kāi)始，到終止密碼子為止的一個(gè)連續(xù)編碼序列。14、星活性：是指在非最適的反應(yīng)條件下，有些酶的識(shí)別特異性會(huì)降低，

4、表現(xiàn)出松弛的專一性。15、基因組文庫(kù)：將某種生物的全部遺傳組成（DNA）切成適當(dāng)長(zhǎng)度的片段，連接在載體上，轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中而構(gòu)建的基因文庫(kù)。16、cDNA文庫(kù)：通過(guò)一系列的酶催作用，使總Poly（A）mRNA轉(zhuǎn)變成雙鏈cDNA群體，并插入到適當(dāng)?shù)妮d體分子上，然后再轉(zhuǎn)化給大腸桿菌寄主菌株的細(xì)胞內(nèi)。如此便構(gòu)成了包含著所有基因編碼序列的cDNA基因文庫(kù)。17、目的基因表達(dá)系統(tǒng)：泛指目的基因與表達(dá)載體重組后，導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞，并能在其中有效表達(dá)，產(chǎn)生目的基因產(chǎn)物（目的蛋白）18、間斷：在DNA的一條鏈上某一位置兩個(gè)相鄰的核苷酸之間的磷酸二酯鍵發(fā)生斷裂。19、粘性末端：大多數(shù)限制性核酸內(nèi)切酶在DNA的

5、兩條鏈錯(cuò)開(kāi)24個(gè)核苷酸切斷，這樣產(chǎn)生的DNA末端會(huì)帶有5突出或是3突出的DNA單鏈，這種末端稱為粘性末端。20、質(zhì)粒的不親和性：是指沒(méi)有選擇壓力的情況下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個(gè)寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。其基礎(chǔ)是由于它們?cè)趶?fù)制功能之間的相互干擾造成的。一、 填空題1.（1973年）被評(píng)定為基因工程誕生之年。而Cohen創(chuàng)立了基因工程的基本模型，是基因工程的創(chuàng)始人。（1996年）世界上第一只基于核移植技術(shù)的克隆動(dòng)物“Dolly”誕生。2. DNA聚合酶的Klenow片段是用（枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶）切割DNA聚合酶得到的分子質(zhì)量為76kDa的大片段，具有兩種酶活性：（53

6、合成酶的活性）；（35外切核酸酶）的活性。3. 切口移位法標(biāo)記DNA的基本原理在于利用（DNA聚合酶）的（53外切核酸酶）和（53合成酶）的作用。4. 反轉(zhuǎn)錄酶除了催化DNA合成外，還具有（核酸水解酶H）的作用，可以將DNA-RNA雜種雙鏈中的（RNA）水解掉。5. 就克隆一個(gè)基因來(lái)說(shuō)，最簡(jiǎn)單的質(zhì)粒載體也必須包括三分部分：（復(fù)制區(qū)）、（選擇標(biāo)記）、（克隆位點(diǎn)）。另外，一個(gè)理想的質(zhì)粒載體必須具有低分子質(zhì)量。6. pBR322是一種改造型的質(zhì)粒，它的復(fù)制子來(lái)源于（pMB1），它的四環(huán)素抗性基因來(lái)自于（pSC101），它的氨芐青霉素抗性基因來(lái)自于（pSF2124或R質(zhì)粒）。7. pBR322的最大容

7、載能力是（6kb），DNA的最大容載能力是（23kb）。8. 既能在又能在中自我復(fù)制的載體DNA稱為（穿梭載體）。9.型限制性核酸內(nèi)切酶屬于（復(fù)合核酸酶），既具有（內(nèi)切酶的活性）又具有（甲基化酶）的活性。10. 正丁醇抽提法是用于去掉插入DNA中的（EB）。11. pUC質(zhì)粒載體的復(fù)制起點(diǎn)來(lái)自（pBR322），還含有大腸桿菌（-半乳糖酶基因）的啟動(dòng)子及其編碼（-肽鏈）的DNA序列，此結(jié)構(gòu)特稱為lacZ基因。12. taqDNA聚合酶具有一種（非模板依賴性）活性，這種活性可以在PCR產(chǎn)物的（3端）加上（一個(gè)）非配對(duì)的脫氧腺嘌呤核苷。13. 型限制性核酸內(nèi)切酶一般識(shí)別（4-6）個(gè)堿基，也有6個(gè)以上

8、的，這些序列具有（雙重螺旋對(duì)稱）的結(jié)構(gòu)形式，換言之，這些核苷酸對(duì)的序列是呈（回文）結(jié)構(gòu)的。14. 通過(guò)比較不同組合的限制性內(nèi)切核酸酶處理某一特定基因區(qū)域所得到的不同大小的片段，可以構(gòu)建顯示該區(qū)域各限制性內(nèi)切核酸酶切點(diǎn)相互位置的（限制性酶切圖譜），又叫做（物理圖譜）。15. 在酶切反應(yīng)管加完各種反應(yīng)物后，需要離心2s，其目的是（混合均勻）和（防止部分酶切）。16. 由于DNA是由四種堿基組成的，所以任何限制性內(nèi)切核酸酶的切割頻率的理論值應(yīng)該是（4n ）。17. 核酸雜交探針可分為兩大類：DNA探針和RNA探針。其中DNA探針又分為（基因組DNA）探針和（cDNA）探針。18. 限制性內(nèi)切核酸酶是

9、按屬名和種名相結(jié)合的原則命名的，第一個(gè)大寫字母取自（屬名的第一個(gè)字母），第二、三兩個(gè)字母取自（種名的前2個(gè)字母），第四個(gè)字母則用（菌株名）。19. 在抽提DNA的過(guò)程中加入異戊醇的目的是（起消泡的作用，并使蛋白質(zhì)層緊密，使水相和有機(jī)相分層較好）。20. 在采用乙醇沉淀法進(jìn)行DNA溶液的濃縮時(shí)，應(yīng)該向含（一價(jià)陽(yáng)離子）的DNA溶液中加入（2體積）的無(wú)水乙醇，并使溫度在（-20），從而使DNA沉淀。21. 限制性核酸內(nèi)切酶切割DNA常用的方法有（單酶切法）、（雙酶切法）和（部分酶切）等幾種。22. 利用載體的雙抗藥性，再次篩選真正的重組DNA分子的操作過(guò)程中需要進(jìn)行（平板影 ?。?，以免出現(xiàn)大量的假陰

10、性或假陽(yáng)性重組子現(xiàn)象。23. 由于RNA分子與硝酸纖維素膜結(jié)合能力相對(duì)較差，Northern印跡雜交法中采用的疊氮化的（活性濾紙或尼龍膜）。24. 具有Ampr Tets 表型的細(xì)胞所攜帶的pBR322，在其（Tet）基因內(nèi)帶有插入的外源基因。25. 經(jīng)過(guò)凝膠電泳分離的DNA或RNA分子，通過(guò)（毛細(xì)管或電導(dǎo)或虹吸）作用被轉(zhuǎn)移到濾膜上。26. cosmid 克隆載體能克隆（40kb）左右的外源DNA片段，所以被廣泛地用于構(gòu)建基因組文庫(kù)。27. 平末端DNA分子的連接，可以利用（T4DNA）連接酶能連接平末端分子的特性直接進(jìn)行載體和目的基因的連接，實(shí)現(xiàn)重組。28.（轉(zhuǎn)化反應(yīng)）是使重組DNA在熱休克

11、的短暫時(shí)間內(nèi)被導(dǎo)入宿主細(xì)胞的過(guò)程。29.（細(xì)菌）RNA聚合酶不能識(shí)別真核基因的啟動(dòng)子。30. 從（真核）基因轉(zhuǎn)錄的mRNA缺乏SD序列，不能結(jié)合到核糖體蛋白上。31. DNA分子連接分為（平末端連接）、（粘性末端連接）。32.（S1核酸酶）是一種特異性單鏈核苷酸內(nèi)切酶，能降解單鏈DNA和單鏈RNA，雙鏈核酸分子的單鏈區(qū)。33.（多核苷酸激酶）可以催化ATP的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至DNA或RNA的5羥基末端。34. DNA重組技術(shù)主要涉及兩大核心技術(shù)：（DNA重組）和（克?。?。35. 一個(gè)完整的基因克隆過(guò)程應(yīng)包括：目的基因的獲取，（載體）的選擇與改造，（目的基因與載體）的連接，重組 DNA 分子（導(dǎo)入）

12、受體細(xì)胞，（篩選）出含感興趣基因的重組 DNA 轉(zhuǎn)化細(xì)胞。 36 .限制性核酸內(nèi)切酶是由（細(xì)菌）產(chǎn)生的一類識(shí)別 （細(xì)菌），并在識(shí)別位點(diǎn)切割（磷酸二酯）鍵的核酸內(nèi)切酶。 37. 科學(xué)家感興趣的外源基因又稱（目的基因），其來(lái)源有（制備基因組文庫(kù)）、（構(gòu)建cDNA文庫(kù)）、（PCR擴(kuò)增）、（人工合成DNA技術(shù)）等幾種途徑。38. 常用的目的基因與載體連接的方式有（黏性末端連接）、（平頭末端連接）、（人工接頭法）、（同源多聚尾連接法）。 49. 根據(jù)采用的克隆載體性質(zhì)不同，將重組 DNA 分子導(dǎo)入細(xì)菌的方法有（轉(zhuǎn)化）、（轉(zhuǎn)導(dǎo)）等。 40. Northern印跡雜交將（RNA）進(jìn)行變性電泳后，再轉(zhuǎn)移到固相

13、支持物上與探針雜交的一種核酸分子雜交技術(shù)，可用于檢測(cè)目的基因在（轉(zhuǎn)錄）水平上的變化。41. 基因組文庫(kù)指存在于（轉(zhuǎn)化細(xì)菌或宿主細(xì)胞）內(nèi)、由克隆載體所攜帶的（所有基因組DNA片段）的集合?；蚪MDNA文庫(kù)涵蓋了基因組全部基因信息。42. cDNA文庫(kù)是指從組織細(xì)胞中分離得到純化（mRNA）的，然后以之為模板，利用（逆轉(zhuǎn)錄酶）合成其互補(bǔ)DNA，再?gòu)?fù)制成雙鏈片段（ cDNA ），與適當(dāng)載體連接后導(dǎo)入受體菌內(nèi)，擴(kuò)增，構(gòu)建cDNA文庫(kù)。43. 基因組文庫(kù)含有組織或細(xì)胞的（DNA)信息，cDNA文庫(kù)含有組織或細(xì)胞的(mRNA）信息。44. 具有相同識(shí)別序列的限制性核酸內(nèi)切酶稱為（同裂酶）。45. 如果用限

14、制性內(nèi)切核酸酶切割雙鏈DNA產(chǎn)生5突出的黏性末端，則可以用（Klenow酶填補(bǔ)的方法）進(jìn)行3端標(biāo)記。如果用限制性內(nèi)切核酸酶切割DNA產(chǎn)生的是3突出的黏性末端，則可以用（T4 DNA聚合酶）進(jìn)行3端標(biāo)記。46.將酵母染色體DNA的（端粒復(fù)制序列）、（自主復(fù)制序列）和（著絲粒）以及必要的選擇標(biāo)記克隆到大腸桿菌智力pBR322中就構(gòu)建成了YAC克隆體。47.目前常用的DNA探針標(biāo)記方法有（缺口平移標(biāo)記法）、（隨機(jī)引物標(biāo)記法）、（末端標(biāo)記法）、（酶直接標(biāo)記法）及（PCR反應(yīng)標(biāo)記法）等。48.大腸桿菌lac操縱子由（啟動(dòng)子）、（操縱子）和（結(jié)構(gòu)基因）三部分組成。49.目的基因起始轉(zhuǎn)錄后，保持（mRNA的

15、有效延伸）、（終止及穩(wěn)定存在）是外源基因有效表達(dá)的關(guān)鍵。50.噬菌體基因組的中間區(qū)段約占噬菌體基因組的（40%），包括（編碼基因調(diào)節(jié)）、（溶源狀態(tài)的發(fā)生）、（維持)以及(遺傳）重組所需要的基因。51. 可用T4DNA聚合酶進(jìn)行平末端DNA標(biāo)記，因?yàn)檫@種酶具有（53 合成酶）和（35外切核酸酶）的活性。52. 人工感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞在溫度為（0）時(shí)吸附DNA，在溫度為（42）時(shí)攝入DNA。53. 感受態(tài)的兩種假說(shuō)：（局部原生質(zhì)化假說(shuō)）；（酶受體假說(shuō)）54. 基因工程的兩個(gè)基本特點(diǎn)：（分子水平操作）；（細(xì)胞水平表達(dá)）55. 噬菌體之所以被選為基因工程的載體，主要有兩方面的原因：它在細(xì)菌中能夠（大

16、量繁殖），這樣有利于外源DNA的擴(kuò)增；對(duì)某些噬菌體如噬菌體的遺傳結(jié)構(gòu)和功能研究的比較清楚，其（大腸桿菌宿主系統(tǒng)）的遺傳也研究得比較詳盡56. 噬菌體的基因組DNA為（）kb，有（60）多個(gè)基因。在體內(nèi)，它有兩種復(fù)制方式，擴(kuò)增時(shí)按（凱恩斯模型）復(fù)制，成熟包裝時(shí)則是按（滾環(huán)）復(fù)制。它有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，進(jìn)行（雙）向復(fù)制。噬菌體的DNA既可以以線性存在又可以以環(huán)狀形式存在，并且能夠自然成環(huán)。其主要原因是在噬菌體線性DNA分子的兩端各有一個(gè)（12）個(gè)堿基組成的天然黏性末端。這種黏性末端可以自然成環(huán)。成環(huán)后的黏性末端部位就叫作（cos）位點(diǎn)。57. 重組體的篩選有兩層含義：將攜帶有（外源插入DNA片段）的克

17、隆挑選出來(lái)；將攜帶有特定外源插入片段的（重組體）挑選出來(lái)58. Northern印記和Southern印記有兩點(diǎn)根本的區(qū)別：印記的對(duì)象不同，（Northern印記）是RNA，（Southern印記）是DNA；電泳條件不同，（Northern印記）是變性條件，（Southern印記）是非變性條件。59. 根據(jù)外源片段提供的遺傳表型篩選重組體，必須考慮三種因素：（克隆的是完整的基因）；（使用的是表達(dá)載體）；（不含內(nèi)含子）。60. 噬菌斑形成選擇法有兩種判斷標(biāo)準(zhǔn)：（能否形成噬菌斑）；（形成斑的清晰度）。二、 判斷對(duì)錯(cuò)1. 克隆是指生物體通過(guò)體細(xì)胞進(jìn)行的無(wú)性繁殖，以及由無(wú)性繁殖形成的表現(xiàn)型完全相同的后

18、代個(gè)體組成的種群。×（基因型）2. 類型I限制性內(nèi)切酶屬于復(fù)合核酸酶，既具有內(nèi)切酶的活性又具有甲基化酶的活性。3. 星活性是指某種限制性核酸內(nèi)切酶在最適反應(yīng)條件下，60min內(nèi)完全切割1mgDNA所需要的酶活性。×（1ug)4. 同尾酶是指識(shí)別序列不完全相同，但切割DNA產(chǎn)生的末端是相同的限制性核酸內(nèi)切酶。5. 大腸桿菌有細(xì)胞壁。6. pBR322質(zhì)粒載體上含有氨芐青霉素抗性基因和卡納霉素抗性基因。×（四環(huán)素抗性基因）7. M13噬菌體的結(jié)構(gòu)式是頭尾狀的。×（纖維狀）8. 噬菌體感染大腸桿菌后，線形DNA注入細(xì)胞內(nèi)，或者進(jìn)行溶菌生長(zhǎng)途徑，黏性末端連接，成

19、為環(huán)形DNA分子。9. 重組體篩選的轉(zhuǎn)入階段，DNA分子以雙鏈的形式進(jìn)入細(xì)胞。×（單鏈）10. 藍(lán)白篩選過(guò)程中，大腸桿菌株系修飾過(guò)的lacZ基因編碼-半乳糖苷酶的N末端-肽鏈。×（ C末端）11. Northern印跡雜交探針可用RNA也可用DNA。12. Northern印跡雜交的受體是DNA片段。×（RNA）13. 開(kāi)放閱讀框ORF不是外顯子集合。14. 開(kāi)放閱讀框ORF開(kāi)始全是起始密碼子AUG。×（不全是）15. 真核生物的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)是加帽位點(diǎn)。16. 真核生物的翻譯起始位點(diǎn)是起始密碼子。×（不是）17. 原核基因表達(dá)系統(tǒng)不具備真核生物

20、的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)，表達(dá)產(chǎn)物無(wú)特定的空間構(gòu)象。18. 當(dāng)通過(guò)RT-PCR得到cDNA片段,利用末端轉(zhuǎn)移酶將oligo(dA)加到cDNA第一鏈末端，通過(guò)另一個(gè)特異引物來(lái)擴(kuò)增5區(qū),這一技術(shù)稱為RACE。×（dT）19. 末端轉(zhuǎn)移酶催化作用不需要模板。20. 將導(dǎo)入外緣基因DNA分子后能穩(wěn)定存在的宿主細(xì)胞稱為重組子。×(轉(zhuǎn)化子）21. 嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒通常是一些具有自身傳遞功能的大質(zhì)粒。22. 轉(zhuǎn)化過(guò)程中熱擊溫度是37度。×（42度）23. SD序列與起始密碼子之間的距離為39個(gè)堿基.24. SD序列為原核生物特有。25. 質(zhì)粒提取過(guò)程中溶液I的作用是使蛋白質(zhì)和DNA變性。&

21、#215;（溶液II)26. TapDNA聚合酶具有非模板介導(dǎo)的核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性，可在雙鏈DNA末端加上一個(gè)單一的3突出的dATP 。27. 藍(lán)白篩選中培養(yǎng)基涂布的IPTG是乳糖類似物。×（-半乳糖苷酶的誘導(dǎo)物）28. 限制性內(nèi)切酶型酶的識(shí)別與切割順序全是呈回文結(jié)構(gòu)。29. DNA的濃縮中，在含一價(jià)陽(yáng)離子的DNA溶液中加入1體積的無(wú)水乙醇，使DNA沉淀。×（2倍體積）對(duì)稱。三、 簡(jiǎn)答題答：（1）DNA純度：純度越高，酶切效果越好； （2）DNA甲基化程度：甲基化的堿基將不能被酶切，所以要降低甲基化程度； （3）酶切消化反應(yīng)的溫度：溫度要在酶的最適反應(yīng)溫度； （4）DNA的分

22、子結(jié)構(gòu)：切割超螺旋DNA的酶量比線性DNA高出許多倍； （5）緩沖液：pH和離子濃度對(duì)酶切效果也有顯著影響。答：（1）能在宿主細(xì)胞獨(dú)立地自我復(fù)制與表達(dá)； （2）分子量應(yīng)較??； （3）應(yīng)具有兩個(gè)以上的容易檢測(cè)的遺傳標(biāo)記； （4）應(yīng)具有位于遺傳標(biāo)記基因內(nèi)的多個(gè)酶切單一位點(diǎn)。3. 簡(jiǎn)述pBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)答：（1）具有較小的分子量； （2）具有Amp和Tet兩種抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào)； （3）具有較高的拷貝數(shù)。答：（1）具有很小的分子量 （2）具有很高的拷貝數(shù) （3）可用組織化學(xué)法檢測(cè)重組體，如藍(lán)白篩選，簡(jiǎn)單方便 （4）具有多克隆位點(diǎn)噬菌體的生長(zhǎng)途徑答：噬菌體感染大腸桿菌之后，線性DN

23、A注入細(xì)胞內(nèi)， （1）進(jìn)入溶菌生長(zhǎng)途徑： 形成環(huán)形DNA分子，合成蛋白質(zhì)，復(fù)制DNA，包裝成子代噬菌體顆粒，并使宿主細(xì)胞破裂，釋放噬菌體感染新細(xì)胞。 （2）進(jìn)入溶源生長(zhǎng)途徑：DNA整合到宿主細(xì)胞染色體上，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制。只有在一定條件下，DNA才會(huì)脫離染色體，重新進(jìn)入溶菌生長(zhǎng)途徑。答：（1）局部原生質(zhì)體化假說(shuō) 即局部失去了細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)或局部溶解細(xì)胞壁，使外源DNA分子能通過(guò)質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞 （2）酶受體假說(shuō) 感受態(tài)細(xì)胞表面形成一種能接受DNA的酶切位點(diǎn)，使DNA分子能進(jìn)入細(xì)胞。答：（1）吸附階段：完整的雙鏈DNA分子吸附于感受態(tài)細(xì)胞的表面； （2）轉(zhuǎn)入階段：雙鏈DNA解鏈，以單鏈的形式進(jìn)入細(xì)

24、胞，另一鏈被降解； （3）自身穩(wěn)定階段：外源質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)又復(fù)制成雙鏈環(huán)狀DNA； （4）表達(dá)階段：目的基因隨質(zhì)粒一起復(fù)制，并轉(zhuǎn)錄翻譯。答：（1）RNA聚合酶亞基發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子序列與-35區(qū)結(jié)合，并進(jìn)一步與-10區(qū)結(jié)合；（2）DNA解鏈，模板被暴露；（3）因子識(shí)別并起始啟動(dòng)位點(diǎn)，開(kāi)始轉(zhuǎn)錄；（4）因子解離，RNA聚合酶繼續(xù)轉(zhuǎn)錄向前移動(dòng)；（5）轉(zhuǎn)錄終止。答：（1）外源基因是否插入在正確的閱讀框； （2）目的基因的有效轉(zhuǎn)錄，如啟動(dòng)子的作用； （3）mRNA的有效翻譯，如SD序列的作用； （4）轉(zhuǎn)錄后，翻譯后的適當(dāng)修飾和加工過(guò)程。答：（1）SD序列與rRNA的16s亞基3末端序列之間的互補(bǔ)程度； （2）起始

25、密碼子AUG與SD序列之間的距離以及SD序列的核苷酸組成； （3）起始密碼子之后的一個(gè)核苷酸對(duì)mRNA與核糖體的結(jié)合也有影響； （4）基因末端轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的影響。答：（1）細(xì)菌RNA聚合酶不能識(shí)別真核基因的啟動(dòng)子；所以載體上的啟動(dòng)子要用原核細(xì)胞的啟動(dòng)子。 （2）從真核基因轉(zhuǎn)錄的mRNA缺乏SD序列，不能結(jié)合到核糖體蛋白上；所以要在載體上加上SD序列。 （3）原核細(xì)胞沒(méi)有轉(zhuǎn)錄后修飾系統(tǒng)，真核基因mRNA的內(nèi)含子不能被切除，以致不能表達(dá)成蛋白；所以應(yīng)從真核細(xì)胞中分離mRNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA來(lái)導(dǎo)入載體。 （4）真核基因表達(dá)的蛋白在原核細(xì)胞中不穩(wěn)定，容易被細(xì)菌蛋白酶破壞；所以應(yīng)將真核基因插在幾個(gè)原核密

26、碼之后，這樣，翻譯表達(dá)出來(lái)的真核基因產(chǎn)物就與原核多肽連在一起，形成融合蛋白而不會(huì)被降解。12請(qǐng)簡(jiǎn)述堿裂解法提取質(zhì)粒的原理。答案：堿裂解法是基于DNA的變性與復(fù)性差異而達(dá)到分離目的的。兩種DNA在強(qiáng)堿環(huán)境都會(huì)變性。由于質(zhì)粒和主染色體的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)不同，變性時(shí)前者雖然兩條鏈分離，卻仍然纏繞在一起不分開(kāi)；但后者完全變性甚至出現(xiàn)斷裂，因此，當(dāng)溶液pH值恢復(fù)較低的近中性水平時(shí)，質(zhì)粒的兩條小分子單鏈可迅速?gòu)?fù)性恢復(fù)雙鏈結(jié)構(gòu)，但是主染色體DNA則交纏成網(wǎng)狀難以復(fù)性。在離心時(shí)，大部分主染色體與細(xì)胞碎片，雜質(zhì)等纏繞一起被沉淀，而可溶性的質(zhì)粒DNA留在上清液中。13在連接過(guò)程中，如何提高平末端的連接效率？答案：1.增加

27、連接酶的用量，通常是粘性末端連接酶用量的10倍。2.增加DNA平末端的濃度，提高平末端之間的碰撞幾率。3.適當(dāng)提高連接反應(yīng)的溫度，平末端連接與退火無(wú)關(guān)，適當(dāng)提高反應(yīng)溫度既可以提高底物末端或分子之間的碰撞幾率，又可增加連接酶的反應(yīng)活性，一般選擇20-25°C適合。4.還可延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間。14將目的片段重組后轉(zhuǎn)入到受體細(xì)胞中時(shí)，共有哪幾種可能進(jìn)入到受體的DNA 分子？15在對(duì)重組體的篩選中，電泳篩選法中有哪兩種方法？什么時(shí)候用第一種方法？什么時(shí)候用第二種方法？這兩種方法各有什么特點(diǎn)？答案：直接提質(zhì)粒跑電泳及用酶切下的目的片段跑電泳兩種方法。 （1）直接提質(zhì)粒跑電泳的方法：在目的片段比較大的

28、時(shí)候用此方法。此時(shí)所用的Marker較大，因此精確度不高，由于片段較長(zhǎng)，所用的膠濃度小。 （2）酶切后的目的片段跑電泳：在目的片段比較小的時(shí)候用此方法。此時(shí)所用的Marker較小，因此精確度較高，由于片段較短，所用的膠濃度大。16若想將一段真核生物的基因在原核生物中表達(dá),哪些結(jié)構(gòu)是一定必須的，此外在表達(dá)載體上還需哪些結(jié)構(gòu)才能使基因順利表達(dá)？答案：至少需要外顯子的全部序列之和。若這段序列不含起始密碼子或終止密碼子，則都得在表達(dá)載體上加上。此外，這個(gè)載體還需要一個(gè)啟動(dòng)子，SD序列及終止子。四、 問(wèn)答題1、 實(shí)驗(yàn)得到一原核基因，想要通過(guò)發(fā)酵獲得大量基因表達(dá)產(chǎn)物應(yīng)選哪種表達(dá)系統(tǒng)？為了使目的基因高效表達(dá)

29、應(yīng)注意哪些問(wèn)題？基因表達(dá)產(chǎn)物又應(yīng)該如何分離純化？答：原核表達(dá)系統(tǒng)。1）外源基因是否插入在正確的閱讀框架2）目的基因的有效轉(zhuǎn)錄（如啟動(dòng)子的作用）3）mRNA的有效翻譯（如SD序列等作用）4）轉(zhuǎn)錄后，翻譯后的適當(dāng)?shù)男揎椇图庸み^(guò)程細(xì)胞破碎離心-沉淀法-超濾、濃縮法分離特異表達(dá)蛋白-進(jìn)一步分離柱層析-聚丙烯凝膠電泳2、 我們知道要實(shí)現(xiàn)外源目的基因的克隆，除了選擇理想的載體，合適的受體及成功的構(gòu)建重組體外，還必須選擇合適的方法將重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞。簡(jiǎn)要列舉幾種將重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法；選擇適合的方法可以有效的提高轉(zhuǎn)化率，轉(zhuǎn)化率是轉(zhuǎn)化效率的評(píng)估指標(biāo)，請(qǐng)問(wèn)，當(dāng)我們用1ng 1kb DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化處

30、理，如果得到100個(gè)轉(zhuǎn)化子，那么計(jì)算該重組DNA的轉(zhuǎn)化效率是多少？（已知：1ng 10kb DNA的分子數(shù)為1×108個(gè)）解：1）將重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法目前主要有：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、顯微注射技術(shù)、電轉(zhuǎn)化法、基因槍法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法、花粉管通道法等。2）已知1ng 10 kb DNA的分子數(shù)為1×108個(gè)，則1ng1kb DNA 的分子數(shù)為1×109個(gè)，那么轉(zhuǎn)化率為100÷1×109=10-73、 實(shí)驗(yàn)中有哪些方法篩選出含有DNA重組體的宿主細(xì)菌？答案：直接篩選法：1）藥物抗性檢測(cè)：用于細(xì)菌, 真菌, 植物和動(dòng)物細(xì)胞的各種抗生素抗性基因-若克隆載

31、體攜帶某種抗菌性標(biāo)志基因，轉(zhuǎn)化后只有含這種抗菌基因的子細(xì)菌，才能在含該抗生素的培養(yǎng)板上形成菌落；2）標(biāo)志補(bǔ)救：轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的外源基因表達(dá)產(chǎn)物可彌補(bǔ)基因缺陷性宿主菌的性狀；3）分子雜交：對(duì)于整合型載體, 則應(yīng)該利用DNA雜交或RNA雜交法證實(shí)：用 探針與DNA克隆片段進(jìn)行雜交，直接選擇鑒定。免疫學(xué)方法：利用特異抗體，與目的基因表達(dá)產(chǎn)物作用，進(jìn)行篩選，包括免疫化學(xué)和酶免疫檢測(cè)分析。鑒定目的基因的特異表達(dá)產(chǎn)物，特異性強(qiáng)、靈敏度高，適用于篩選無(wú)任何選擇標(biāo)記的基因4、在植物某基因編碼區(qū)的全長(zhǎng)獲得時(shí)，某人僅有此基因的EST，且現(xiàn)在所有的數(shù)據(jù)庫(kù)中并沒(méi)有此基因的全長(zhǎng)序列，現(xiàn)在他想要獲得此基因編碼區(qū)的所有序列，并

32、克隆至表達(dá)載體上，請(qǐng)你幫助他設(shè)計(jì)一下實(shí)驗(yàn)。請(qǐng)寫出EST的中文名，并按適當(dāng)?shù)捻樞?，列出所用到的酶，及其作用。答：EST：表達(dá)序列標(biāo)簽。 首先提取此種植物的mRNA，進(jìn)行分析mRNA的純度，是否達(dá)到下一步操作的要求。隨后進(jìn)行5'RACE、3'RACE（或新RACE），獲得此基因mRAN的cDNA。將cDNA克隆至T載體上，進(jìn)行測(cè)序。將通過(guò)測(cè)序獲得序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。隨后通過(guò)帶有酶切位點(diǎn)的引物獲得兩端帶有酶切位點(diǎn)的cDNA，隨后酶切連入表達(dá)載體上。反轉(zhuǎn)錄酶以mRNA為模板復(fù)制出單鏈cDNA；DNA聚合酶以單鏈cDNA為模板合成雙鏈DNA；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶，在cDNA的3

33、9;端加上尾巴；（磷酸酶IP使無(wú)帽子結(jié)構(gòu)的mRNA去磷酸化；煙草酸性焦磷酸酶TAP去除帽子結(jié)構(gòu)；RNA連接酶將一段的RNA寡核苷酸與全長(zhǎng)mRNA5'端相連；）用限制性內(nèi)切酶切割載體；用DNA連接酶將cDNA插入載體中。5、我們現(xiàn)有一個(gè)質(zhì)粒，圖譜如圖一、圖二，并有一段原核基因序列，我們?nèi)绾卫么溯d體讓此基因表達(dá)，并獲得表達(dá)型載體。請(qǐng)寫出構(gòu)建載體的實(shí)驗(yàn)流程，并寫出理由。T7啟動(dòng)子為通用強(qiáng)啟動(dòng)子。圖 一圖 二序列如下，共有504bp： CAACT ACAA CAGG GACA ACGA TGGT AGAT CTGA CTAG TAAA GGAG AA GA. CCAC C ACC ACCA

34、CGTG TGAT ACCA TAAT TCAT答： 首先我們分析得到從21個(gè)堿基處開(kāi)始至491處是該序列的編碼區(qū)，因此我們把這段序列克隆入載體中。根據(jù)載體可知，T7啟動(dòng)子為強(qiáng)啟動(dòng)子，我們可以利用它來(lái)啟動(dòng)基因的表達(dá)（需用IPTG來(lái)誘導(dǎo)）。根據(jù)載體圖譜可知rbs（核糖體結(jié)合位點(diǎn)）后的第一個(gè)ATG位于Nco I酶切位點(diǎn)上，且原核細(xì)胞翻譯的起始通常為離SD或rbs最近的ATG開(kāi)始。因此我們可以根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，使基因上游引物都有Nco I的酶切位點(diǎn)，且起始密碼子與Nco I酶切位點(diǎn)中的ATG重合；對(duì)于下游引物，帶有載體上Nco I后面的任意一個(gè)酶切位點(diǎn)，且酶切位點(diǎn)后帶有終止密碼子，通過(guò)PCR獲得

35、此基因。隨后提取載體質(zhì)粒，并對(duì)質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，然后用連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)中，用卡那霉素進(jìn)行篩選。篩選后先以含有重組質(zhì)粒的菌液或重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR鑒定，得到陽(yáng)性菌落后，再次陽(yáng)性菌落提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，電泳后若出現(xiàn)與PCR產(chǎn)物大小一致的片段，即成功獲得重組質(zhì)粒。其中感受態(tài)細(xì)胞的基因組具有能夠編碼T7DNA聚合酶的能力，例如JM109、BL21等。利用卡那霉素進(jìn)行篩選因?yàn)檩d體上帶由此抗性基因。對(duì)于終止子，此載體上帶有T7終止子。6、 請(qǐng)你寫出七種DNA聚合酶及其特性與特點(diǎn)和用途。答：1）大腸桿菌DNA聚合酶I（全酶）:具有以單鏈為模板5'到3'DNA聚合酶的

36、活性，3'到5'外切核酸酶活性能降解單鏈或雙鏈DNA，5'到3'DNA外切核酸酶活性能降解DNA雙鏈。用途：用切口平移（缺口轉(zhuǎn)移）方法標(biāo)記DNA。2) 大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）:具有5'到3'聚合酶活性和3'到5'外切酶活性。用途：補(bǔ)平限制酶切割DNA產(chǎn)生的3'凹端。在許多情況下，用限制酶消化DNA及隨后用Klenow片段補(bǔ)平3'凹端；用32PdNTP補(bǔ)平3'凹端，對(duì)DNA片段進(jìn)行末端標(biāo)記。3) T4噬菌體DNA聚合酶:具有5'到3'聚合酶活性和3'到5'

37、外切酶活性，此活性對(duì)單鏈作用比對(duì)雙鏈強(qiáng)。用途：補(bǔ)平或標(biāo)記限制性內(nèi)切酶消化DNA后產(chǎn)生的3'凹端；對(duì)帶有3'突出端的DNA分子進(jìn)行末端標(biāo)記。4) T7噬菌體DNA聚合酶:具有5'到3'聚合酶活性，是目前所有已知DNA聚合酶中持續(xù)合成能力最強(qiáng)的，還有3'到5'外切酶活性。用途：用于拷貝長(zhǎng)段模板的引物延伸反應(yīng)；通過(guò)補(bǔ)平或交換（置換）反應(yīng)進(jìn)行快速末端標(biāo)記。5) Taq DNA聚合酶:具有耐熱性，5'到3'DNA聚合酶的活性，和5'到3'DNA外切核酸酶活性。用途：可使特定序列擴(kuò)增106倍；用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），對(duì)D

38、NA片段進(jìn)行體外擴(kuò)增。6) 逆轉(zhuǎn)錄酶:性質(zhì)RNA指導(dǎo)的DNA合成反應(yīng)；DNA指導(dǎo)的DNA合成反應(yīng)；RNA的水解的反應(yīng)，具有RNaseH活性。用途：將真核基因的mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA，構(gòu)建cDNA文庫(kù)，進(jìn)行克隆實(shí)驗(yàn)；標(biāo)記5'突出端的DNA片段；代替Klenow大片段，用于DNA序列測(cè)定。7) 末端轉(zhuǎn)移酶:是一種無(wú)需模板的DNA聚合酶，催化脫氧核苷酸結(jié)合到DNA的3'羥基端。用途：催化DNA3'末端添加同聚物；DNA3'末端標(biāo)記。7、 給出下面一段序列，請(qǐng)寫出HindIII的識(shí)別序列最可能為哪幾個(gè)，可能產(chǎn)生哪幾種末端，寫出末端序列，并寫出限制性核酸內(nèi)切酶的分類，及其

39、各類特點(diǎn)及以HindIII為例說(shuō)明命名規(guī)則。 AAT CCG GTT AAG CTT TCG AAT TCC GGA TCG TTA GGC CAA TTC GAA AGC TTAAGG CCT AGC答:識(shí)別序列為AAGCTT 可能產(chǎn)生平末端 AAG 5'黏性末端 A 3'黏性末端 T TTGCAA TTG TTGCAA TTGCAA限制性核酸內(nèi)切酶可分為三類，I型、II型和III型:I型限制性核酸內(nèi)切酶，屬于復(fù)合核酸酶，既具有內(nèi)切酶的活性又具有甲基化酶的活性。所識(shí)別的DNA序列長(zhǎng)度約為十幾個(gè)核苷酸，切割位置具有不確定性。II型限制性核酸內(nèi)切酶，不但能特異性地識(shí)別DNA序列，

40、而且識(shí)別的DNA序列與酶切割DNA的位置是一致的，識(shí)別序列一般為4-8個(gè)堿基，識(shí)別序列具有回文結(jié)構(gòu)，可產(chǎn)生平末端和黏性末端。III型限制性核酸內(nèi)切酶，既具有內(nèi)切酶的活性，又具有甲基化酶的活性，能識(shí)別特定的DNA序列，但切割DNA的位點(diǎn)往往在識(shí)別結(jié)合位點(diǎn)相鄰的位置。命名規(guī)則：H為宿主微生物屬名的第一個(gè)字母，大寫、斜體；in為種名的前兩個(gè)字母，小寫、斜體；d為菌株名，大小寫依菌株名而定，正體；III表示在這個(gè)菌株中發(fā)現(xiàn)限制性核酸內(nèi)切酶的順序號(hào)，羅馬數(shù)字，正體。1、T4 聚合酶與Klenow酶一樣，具有53聚合酶和3 5外切酶兩種活性，但它的3 5外切酶活性比Klenow酶強(qiáng)倍。該酶的DNA3 5外

41、切酶活性既能作用單鏈DNA，也能作用于雙鏈DNA，不過(guò)作用于 鏈的活性要強(qiáng)于鏈。2,性質(zhì)粒載體的最大容載能力是 。 3、限制性內(nèi)切酶是按屬名和種名相結(jié)合的原則命名的，第一個(gè)大寫字母取自，第二、三兩個(gè)字母取自稱 ，第四個(gè)字母則用。 4、關(guān)于細(xì)菌的感受態(tài)本質(zhì)與存在，目前主要有兩種假說(shuō)，一種為 ；另一種為。5、經(jīng)過(guò)修飾的DNA最多可以插入大小的外源基因。6、型限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列一般是個(gè)堿基，而且這些序列大多呈 結(jié)構(gòu)。7、粘性末端連接技術(shù)通常有、。9、根據(jù)測(cè)定的對(duì)象不同，可將分子雜交法分為三類，鑒別DNA的雜交稱為 、鑒別RNA的雜交稱為、鑒別蛋白質(zhì)的雜交稱為 。10、在DNA的一條鏈上某一位置兩個(gè)

42、相鄰的核苷酸之間的磷酸二脂鍵發(fā)生斷裂稱為 ，而在某一位置上丟失了一個(gè)或幾個(gè)核苷酸則稱為 。11,用不對(duì)稱PCR合成單鏈DNA探針時(shí)，兩個(gè)引物的濃度比為。12.、人工感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞在溫度為時(shí)吸附DNA，時(shí)攝入DNA。三、判斷是非題（每題1分，共10分，對(duì)者在括號(hào)內(nèi)填“對(duì)”；錯(cuò)者在括號(hào)內(nèi)填“錯(cuò)”）1、1972年，美國(guó)斯坦福大學(xué)的學(xué)者首先在體外進(jìn)行了DNA改造的研究，他們把SV40 的DNA和大腸桿菌DNA分別進(jìn)行切割，又將兩者連接在一起，成功地構(gòu)建了第一個(gè)體外重組的人工DNA分子。（ ）2、Ecoli菌株有一種降低噬菌體DNA生物活性的功能，同時(shí)又對(duì)噬菌體DNA分子進(jìn)行修飾，使其在下一次重新

43、感染菌株過(guò)程中能有效生長(zhǎng)，這兩個(gè)功能前者稱為“限制”，后者稱為“修飾”。（ ）3、類型限制性內(nèi)切酶識(shí)別的DNA順序長(zhǎng)約十幾個(gè)核苷酸，在離識(shí)別序列一端約1000bp的位置上切割DNA。（ ）4、T4噬菌體DNA聚合酶是所有已知DNA聚核酶中持續(xù)合成能力最強(qiáng)的一個(gè)，具有53聚合酶活性及35外切核酸酶活性。（ ）5、末端轉(zhuǎn)移酶的催化作用不需要模板，并強(qiáng)烈偏向于以帶3突出端的DNA為受體。（ ）6、Ecoli連接酶和T4DNA連接酶都有連接單鏈多核苷酸的功能，這種功能RNA連接酶也聚有。（ ）7、接合型質(zhì)粒又叫做傳遞性質(zhì)粒，可以從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)液里的所有其他細(xì)胞中。（ ）8、在細(xì)菌中，能發(fā)展感受態(tài)

44、的細(xì)胞只占少數(shù)，而且只有萬(wàn)分之一的的質(zhì)粒分子能夠進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞，在攝入質(zhì)粒DNA后能良好增殖的菌體也只有及少數(shù)。（ ）9、在DNA包裝時(shí)，包裝系統(tǒng)對(duì)DNA的大小有嚴(yán)格的要求，只有長(zhǎng)度與野生型DNA長(zhǎng)度完全相等的重組DNA才能得到有效的包裝。（ ）10、外源基因?qū)胝婧思?xì)胞的效率較高，而且在真核細(xì)胞內(nèi)，由于外源基因表達(dá)的蛋白可被糖基化，成為糖蛋白。（ ）4、已知某一內(nèi)切核酸酶在一環(huán)狀DNA上有三個(gè)切點(diǎn)，因此，用此酶切割該環(huán)狀DNA，可得到三個(gè)片段。5、EGTA是鎂離子螯合劑，加入反應(yīng)液后，可以抑制所有需要鎂離子作為輔助因子的酶活性。6、型限制性內(nèi)切核酸酶與型限制性酶的限制與修飾作用來(lái)源于兩種不同

45、的酶，而型酶則屬于復(fù)合核酸酶。7、 T4 DNA連接酶和連接酶都能催化雙鏈DNA和單鏈DNA的連接8,外源基因（或DNA片段）插入到某一基因內(nèi)的位點(diǎn)后，這個(gè)基因不再有任何功能。10、pBR322可以用于粘性末端連接、平末端連接和同聚物加尾法連接，無(wú)論用哪種方法連接，都可以用同一種酶回收外源片段。1、200，單鏈DNA，雙鏈DNA2、3545 Kb。 3、細(xì)菌屬名，細(xì)菌種名的前兩個(gè)字母，菌株的類型4、局部原生質(zhì)體化假說(shuō)，5、10Kb20Kb。6、46,回文。7、銜接體技術(shù)、接合體技術(shù)、同聚體加尾技術(shù)。9、Southern Blot 、 Northern Blot、 Western Blot 。1

46、0、間斷，缺刻 。1、錯(cuò)2、對(duì)3、對(duì)4、錯(cuò)5、對(duì)6、錯(cuò)7、對(duì)8、對(duì)9、錯(cuò)10、錯(cuò)1、在基因工程中，載體應(yīng)具備的一些基本性質(zhì)。答：第一，載體必須具有能夠在某些宿主細(xì)胞中獨(dú)立地自我復(fù)制和表達(dá)的能力。只有這樣，外源目的基因裝入該載體后，才能在載體的帶動(dòng)下一起復(fù)制，達(dá)到無(wú)性繁殖的目的。第二、載體DNA的分子量應(yīng)該較小，既可在受體細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增較多的拷貝，又便于結(jié)合更大的目的基因，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)操作中不易被機(jī)械性剪切，而且易于從宿主細(xì)胞中分離并進(jìn)行純化。第三，載體上最好應(yīng)具有兩個(gè)以上的容易檢測(cè)的遺傳標(biāo)記（如抗藥性基因等），以賦予宿主細(xì)胞以不同的表型。第四，載體應(yīng)具有多個(gè)限制性內(nèi)切酶的單一切點(diǎn)，這些單一酶切位點(diǎn)越

47、多，就越容易從中選出一種酶，使它在目的基因上沒(méi)有切點(diǎn)，保持目的基因的完整性。載體上的單一酶切位點(diǎn)最好是位于檢測(cè)表型的遺傳標(biāo)記之內(nèi)。這樣目的基因是否已連接載體就可以通過(guò)這一表型的改變與否而得知，有利于篩選重組體。2、 堿裂解法制備質(zhì)粒DNA的實(shí)驗(yàn)原理是什么？答：堿裂解法是一種用得最廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，它是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離的目的，當(dāng)細(xì)胞在有NaOH和SDS的溶液中裂解時(shí)，蛋白質(zhì)與染色體DNA發(fā)生變，加入溶液醋酸鉀中和后，質(zhì)粒DNA復(fù)性，質(zhì)粒DNA以原來(lái)的構(gòu)型保存在原溶液中，進(jìn)行離心后，蛋白質(zhì)與染色體DNA隨細(xì)胞碎片沉淀下來(lái)，質(zhì)粒DNA則留在上清液中。

48、1、 YAC載體。答：YAC是酵母人工染色體Yeast Artificial Chromosome的縮寫。真核生物染色體有幾個(gè)部分是最為關(guān)鍵的，一是著絲粒，它主管染色體在細(xì)胞分裂過(guò)程中正確地分配到各子細(xì)胞中，二是端粒，端粒位于染色體的末端，它們對(duì)于染色體末端的復(fù)制以及防止染色體被核酸外切酶切斷具有重要意義，三是復(fù)制起點(diǎn)。YAC帶有天然染色體所有的功能元件，包括一個(gè)著絲粒，一個(gè)DNA復(fù)制起點(diǎn)，兩個(gè)端粒，由于酵母染色體DNA至少有幾百Kb長(zhǎng)，因此人工染色體所能裝進(jìn)的外源DNA片段可達(dá)到幾百Kb長(zhǎng)，最大達(dá)到1000 Kb長(zhǎng)，這是質(zhì)粒與粘粒半不到的。2、 請(qǐng)說(shuō)出在細(xì)菌中l(wèi)acZ基因的“藍(lán)-白”篩選原理

49、。答：有些株系的帶有修飾過(guò)的lacZ基因，只編碼半乳糖苷酶的肽，即缺少lacZ的lacZ基因（lacZ基因編碼半乳糖苷酶的一部分），這些株系的細(xì)胞只有吸收了向PUC8這樣的帶有丟失的lacZ基因的質(zhì)粒分子的情況下，才能夠合成完整的半乳糖苷酶。半乳糖苷酶可以將Xgal分解成一種深藍(lán)色的產(chǎn)物，這個(gè)反應(yīng)很靈敏。當(dāng)帶有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中加有Xgal及一種半乳糖苷酶的誘導(dǎo)物IPTG時(shí)，那些能合成完整半乳糖苷酶的未重組克隆就會(huì)因它能酶解Xgal而變成深藍(lán)色，而重組子因lacZ基因被破壞不能合成完整的半乳糖苷酶而呈白色，此謂藍(lán)白選擇。五、問(wèn)答題（10分）試述RAPD技術(shù)。答：1、基本原理：RAPD是隨即擴(kuò)

50、增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA）的英文縮寫，建立于PCR技術(shù)基礎(chǔ)上，如果雙鏈DNA分子在一定長(zhǎng)度內(nèi)具有反向平行又與引物互補(bǔ)的片段，利用一系列不同的隨即排列堿基順序的寡聚核苷酸單鏈為引物，模板在9294變性解鏈后，在足夠低的溫度下根據(jù)堿基互補(bǔ)法則，單個(gè)引物退火到基因組DNA模板兩條反向鏈的不同位置上，在有足夠DNA聚合酶活性的條件下，dNTP從引物的3端摻入，從引物延伸到一定長(zhǎng)度，得到一段新的互補(bǔ)DNA鏈，在反應(yīng)中，某一引物可能會(huì)與單鏈DNA的多個(gè)位點(diǎn)互補(bǔ)結(jié)合，但只有這些引物的位置是在彼此可擴(kuò)增的距離內(nèi)（引物間距為2002000bp），那么不連續(xù)

51、的分子量為2002000bp的DNA片段就會(huì)通過(guò)PCR產(chǎn)生。經(jīng)過(guò)40個(gè)循環(huán)后就可以合成240條新鏈。如此高產(chǎn)的DNA片段經(jīng)電泳分離和EB染色后，可直接在紫外光下觀察。2、RAPD反應(yīng)體系：模板DNAdNTP 10XPCR緩沖液 引物Taq DNA聚合酶水補(bǔ)足體積溫度循環(huán)：94預(yù)變性2min 94變性30 s；36退火30 s；72延伸30 s 共3540循環(huán)72延伸7 min3、 技術(shù)問(wèn)題：（1）引物：引物的合成是隨機(jī)的，但必需滿足以下條件，引物的長(zhǎng)度以10個(gè)堿基為宜，引物太短結(jié)合到模板DNA分子上有困難，引物太長(zhǎng)，成本提高，且合成多態(tài)性DNA的可能性降低。（2）Mg2+濃度的要求：任何一種酶

52、都要求最適的反應(yīng)條件。Taq DNA聚合酶需要Mg2+激活。由于引物和模板的雙鏈雜交體的解鏈和退火溫度受二價(jià)離子的影響，因此必需運(yùn)用梯度試驗(yàn)確定擴(kuò)增反應(yīng)的最佳Mg2+。4、RAPD技術(shù)的應(yīng)用：RAPD技術(shù)簡(jiǎn)單、容易掌握。在短期內(nèi)可獲得大量的遺傳標(biāo)記，這些優(yōu)點(diǎn)逐漸被人們接受后，發(fā)展神速，在生物學(xué)的諸多領(lǐng)域，如遺傳育種、生物多樣性、細(xì)胞生物學(xué)、園藝學(xué)、植物生理與病理、物種起源與進(jìn)化的研究中得到廣泛應(yīng)用，對(duì)于流行病診斷、法醫(yī)鑒定等醫(yī)療、環(huán)保與公安部門也具有使用價(jià)值。主要應(yīng)用：遺傳指紋作圖、檢測(cè)遺傳多樣性與穩(wěn)定性（品種檢定、物種起源與進(jìn)化）1、200，單鏈DNA，雙鏈DNA2、3545 Kb。3、細(xì)菌

53、屬名，細(xì)菌種名的前兩個(gè)字母，菌株的類型4、局部原生質(zhì)體化假說(shuō)，5、10Kb20Kb。6、46,回文。7、銜接體技術(shù)、接合體技術(shù)、同聚體加尾技術(shù)。9、Southern Blot 、 Northern Blot、 Western Blot 。10、間斷，缺刻 。3、載體DNA分子轉(zhuǎn)化進(jìn)入細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞的四個(gè)階段是什么？答：第一個(gè)是吸附階段，完整的雙鏈DNA分子吸附于感受態(tài)細(xì)胞的表面，第二個(gè)為轉(zhuǎn)入階段，雙鏈的DNA分子解鏈，以單鏈的形式進(jìn)入細(xì)胞，而另一鏈則被降解；第三階段是自身穩(wěn)定階段，外源質(zhì)粒DNA在細(xì)胞內(nèi)又復(fù)制成雙鏈環(huán)狀DNA；第四階段是表達(dá)階段，即目的基因隨同質(zhì)粒的復(fù)制子一起復(fù)制，并被轉(zhuǎn)錄、翻譯。（ ）2、Bal 31核酸酶是Ca2+依賴性的，在反應(yīng)混合物中加入EDTA便可以抑制它的活性。（ ）3、DNA聚合酶有三種酶活性，其中35外切酶的活性在較多的dNTP存在下，常被5 3合成酶的活性所掩蓋。（ ）4、有A、B、C三個(gè)質(zhì)粒，因?yàn)锳和B能夠共存于一個(gè)細(xì)胞，A和C也可共存于同一個(gè)細(xì)胞，所以B和C一定能夠共存于同一個(gè)細(xì)胞。（ ）5、氯霉素?cái)U(kuò)增DNA時(shí)，加氯霉素的時(shí)間是重要的，因?yàn)榧拥锰?，菌?shù)不夠；加入時(shí)間過(guò)遲，菌齡過(guò)老，容易自溶。（ ）6、用限制性內(nèi)切核酸酶切割載體DNA、供體DNA后，要加入EDTA-SDS終止液使限制性內(nèi)切核酸酶失活，這樣有利