抗氧化活性研究方法

1、抗氧化活性研究方法以酶標(biāo)法清除以酶標(biāo)法清除DPPHDPPH自由基為主自由基為主目錄v一一. .檢測(cè)抗氧化活性的原因檢測(cè)抗氧化活性的原因v 二二. .自由基的產(chǎn)生及抗氧化的重要性自由基的產(chǎn)生及抗氧化的重要性v三三. .檢測(cè)方法檢測(cè)方法v四四.DPPH.DPPH法（原理，一般方法，酶標(biāo)法）法（原理，一般方法，酶標(biāo)法）v五五.ABTS.ABTS法法 v六六.TBARS.TBARS法法v七七. .鐵離子還原能力鐵離子還原能力(FRAP)(FRAP)一.檢測(cè)抗氧化活性的原因 1.1.天然植物中許多化學(xué)物質(zhì)具有抗氧化活性天然植物中許多化學(xué)物質(zhì)具有抗氧化活性2.2.抗氧化劑有延緩衰老等功效，越來(lái)越受到人們關(guān)

2、注抗氧化劑有延緩衰老等功效，越來(lái)越受到人們關(guān)注3.3.據(jù)文獻(xiàn)記齊墩果酸型三萜有較好的抗氧化活性據(jù)文獻(xiàn)記齊墩果酸型三萜有較好的抗氧化活性4.4.抗氧化活性測(cè)試簡(jiǎn)單，快捷，經(jīng)濟(jì)抗氧化活性測(cè)試簡(jiǎn)單，快捷，經(jīng)濟(jì) 二.自由基的產(chǎn)生及抗氧化的重要性抗氧化劑抗氧化劑自由基對(duì)人體造成的傷害自由基對(duì)人體造成的傷害天然植物天然植物三.檢測(cè)方法v 目前常用的抗氧化活性檢測(cè)方法主要基于以下機(jī)理：目前常用的抗氧化活性檢測(cè)方法主要基于以下機(jī)理：v (1)(1)在特定條件下，樣品對(duì)檢測(cè)體系中在特定條件下，樣品對(duì)檢測(cè)體系中脂類物質(zhì)的氧化抑脂類物質(zhì)的氧化抑制能力制能力反映被測(cè)物的抗氧化活性；反映被測(cè)物的抗氧化活性；（TBARS

3、TBARS法）法）v (2)(2)在特定條件下，樣品對(duì)檢測(cè)體系中在特定條件下，樣品對(duì)檢測(cè)體系中自由基的清除能力自由基的清除能力反映被測(cè)物的抗氧化活性；反映被測(cè)物的抗氧化活性；（DPPHDPPH自由基的清除）自由基的清除）v (3)(3)在特定條件下，測(cè)定樣品的在特定條件下，測(cè)定樣品的還原能力還原能力反映被測(cè)物的抗反映被測(cè)物的抗氧化活性。氧化活性。（還原（還原FeFe3+3+） 四.DPPH法 1. 1.原理原理 DPPH(DPPH(二苯代苦味?；杂苫酱辔鄂；杂苫? ) 是一種以氮為中心的是一種以氮為中心的穩(wěn)穩(wěn)定定自由基自由基。 特點(diǎn)：特點(diǎn)：醇溶液呈紫色醇溶液呈紫色，波長(zhǎng)為波長(zhǎng)為517

4、nm517nm下具有最大吸收。下具有最大吸收。 具有單一電子，故能接受一個(gè)電子或氫離子，具有單一電子，故能接受一個(gè)電子或氫離子，有自由基有自由基清除劑存在時(shí)，清除劑存在時(shí)，DPPHDPPH的單電子被捕捉而使其顏色變淺，的單電子被捕捉而使其顏色變淺，在最大光吸收波長(zhǎng)處的吸光值下降在最大光吸收波長(zhǎng)處的吸光值下降, ,吸光度水平的降低吸光度水平的降低表明抗氧化性的增加，從而以評(píng)價(jià)試驗(yàn)樣品的抗氧化能表明抗氧化性的增加，從而以評(píng)價(jià)試驗(yàn)樣品的抗氧化能力。力。此抗氧化能力用抑制率來(lái)表示，抑制率越大，抗氧此抗氧化能力用抑制率來(lái)表示，抑制率越大，抗氧化性越強(qiáng)?；栽綇?qiáng)。實(shí)驗(yàn)步驟 2. 2.實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟 （1

5、 1）酶標(biāo)法檢測(cè)）酶標(biāo)法檢測(cè)酶標(biāo)儀酶標(biāo)儀v 取取9696孔細(xì)胞培養(yǎng)板，各孔分別加入孔細(xì)胞培養(yǎng)板，各孔分別加入150molL150molL- 1- 1的的DPPHDPPH溶液溶液180L,180L,各濃度梯度樣品溶液各濃度梯度樣品溶液20L,20L,終濃度分別為終濃度分別為3.9 3.9 500molL500molL- 1- 1，反應(yīng)總體積，反應(yīng)總體積200L,200L,以溶劑作對(duì)照。加以溶劑作對(duì)照。加樣后，振蕩混勻。封板膠封板后，室溫下避光靜置。分別樣后，振蕩混勻。封板膠封板后，室溫下避光靜置。分別在在1010 120min120min時(shí)間范圍內(nèi)于時(shí)間范圍內(nèi)于517nm517nm處測(cè)定各孔吸光

6、度值。觀處測(cè)定各孔吸光度值。觀察樣品抗察樣品抗DPPHDPPH的時(shí)效量效變化過(guò)程，確定實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和的時(shí)效量效變化過(guò)程，確定實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和最佳實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間。最佳實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間。v 計(jì)算公式為計(jì)算公式為: :清除率清除率( ()=A)=A( (溶劑溶劑) )- A- A( (樣品樣品) )/A/A（溶劑）（溶劑）x100 x100 VitEVitE清除清除DPPHDPPH自由基抗氧化量效曲線自由基抗氧化量效曲線10-120min10-120min內(nèi)內(nèi), ,隨著隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)作用時(shí)間的延長(zhǎng)VitEVitE抗抗DPPHDPPH作用增作用增強(qiáng)，強(qiáng)，但在但在3.9- 3.9- 31.2molL31.2

7、molL- 1- 1范范圍內(nèi)，各時(shí)間點(diǎn)的圍內(nèi)，各時(shí)間點(diǎn)的藥效變化不明顯，藥效變化不明顯，62.5-500molL-62.5-500molL-1 1濃度范圍，隨著濃濃度范圍，隨著濃度增加，各時(shí)間點(diǎn)度增加，各時(shí)間點(diǎn)的藥物作用曲線逐的藥物作用曲線逐漸分離漸分離，并在，并在500500molL-molL-1 1，各各時(shí)間點(diǎn)量效趨于平時(shí)間點(diǎn)量效趨于平穩(wěn)。從圖中可以看穩(wěn)。從圖中可以看出，在這些時(shí)間點(diǎn)出，在這些時(shí)間點(diǎn)中，中，30min30min的量效曲的量效曲線基本呈斜線上升。線基本呈斜線上升。30min30minVitEVitE清除清除DPPHDPPH自由基抗氧化量效曲線自由基抗氧化量效曲線 反應(yīng)時(shí)間反應(yīng)

8、時(shí)間t t為為30min30min的量效曲線的量效曲線（相關(guān)系數(shù)）（相關(guān)系數(shù)）實(shí)驗(yàn)步驟 （2 2）一般方法）一般方法紫外分光光度計(jì)法紫外分光光度計(jì)法 將樣品用甲醇配制成一系列濃度，取將樣品用甲醇配制成一系列濃度，取0.1mL0.1mL樣品加入樣品加入3.5 3.5 mL DPPHmL DPPH甲醇溶液甲醇溶液(0.06 mmol/L)(0.06 mmol/L)，混合，混合30min30min后測(cè)定后測(cè)定515 515 nmnm處吸光度。每份樣品平行操作處吸光度。每份樣品平行操作3 3次。次。 計(jì)算公式為計(jì)算公式為: :清除率清除率( ()=A)=A( (溶劑溶劑) )- A- A( (樣品樣品

9、) )/A/A（溶劑）（溶劑）x100 x100酶標(biāo)法優(yōu)勢(shì) 3. 3.酶標(biāo)法優(yōu)勢(shì)酶標(biāo)法優(yōu)勢(shì) 抗氧化微孔板實(shí)驗(yàn)方法的優(yōu)勢(shì)：抗氧化微孔板實(shí)驗(yàn)方法的優(yōu)勢(shì)：耗材量少，試劑量以微耗材量少，試劑量以微升計(jì)；升計(jì)；試劑種類少，部分試劑配制可交互使用；試劑種類少，部分試劑配制可交互使用；方法方法簡(jiǎn)便，耗時(shí)短；簡(jiǎn)便，耗時(shí)短；可重復(fù)性強(qiáng)，可以廣泛應(yīng)用于藥物篩選，可重復(fù)性強(qiáng)，可以廣泛應(yīng)用于藥物篩選，特別是高通量藥物篩選研究。特別是高通量藥物篩選研究。五.ABTS法 1. 1.原理原理 以水溶性的以水溶性的ABTSABTS+ +自由基引發(fā)劑為顯色劑。自由基引發(fā)劑為顯色劑。 特點(diǎn)：特點(diǎn)：ABTSABTS與過(guò)硫酸鉀反應(yīng)生

10、成穩(wěn)定的藍(lán)與過(guò)硫酸鉀反應(yīng)生成穩(wěn)定的藍(lán)/ /綠色陽(yáng)離子自綠色陽(yáng)離子自由基由基ABTSABTS+ +，最大吸光波長(zhǎng)為最大吸光波長(zhǎng)為734nm734nm。 向向ABTSABTS+ +其中加入被測(cè)物質(zhì)，如果該物質(zhì)中存在抗氧化成其中加入被測(cè)物質(zhì)，如果該物質(zhì)中存在抗氧化成分，則該物質(zhì)會(huì)與分，則該物質(zhì)會(huì)與ABTS+ABTS+發(fā)生反應(yīng)而使反應(yīng)體系發(fā)生反應(yīng)而使反應(yīng)體系褪色褪色，然，然后在后在ABTSABTS+ +這種自由基的這種自由基的734nm734nm吸光波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度的變吸光波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度的變化來(lái)反映物質(zhì)的抗氧化能力?；瘉?lái)反映物質(zhì)的抗氧化能力。實(shí)驗(yàn)步驟 2. 2.實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟v 將樣品用甲醇配制成

11、一系列濃度將樣品用甲醇配制成一系列濃度, ,取取0.15mL0.15mL樣品加入樣品加入2.85mLABTS2.85mLABTS自由基工作液，混合，放置自由基工作液，混合，放置10min10min后后, ,在在734nm734nm處測(cè)定吸光度。每份樣品平行操作處測(cè)定吸光度。每份樣品平行操作3 3次。次。v 計(jì)算公式為：清除率計(jì)算公式為：清除率( ()=A)=A( (溶劑溶劑) )- A- A( (樣品樣品) ) /A /A（溶劑）（溶劑） 100100 v A A（溶劑）（溶劑）為為2.85 mLABTS2.85 mLABTS溶液與溶液與0.15mL0.15mL甲醇混合后的吸度，甲醇混合后的吸

12、度，A A（樣品）（樣品）為為2.85mLABTS2.85mLABTS溶液與溶液與0.15mL0.15mL樣品混合后的吸光度。樣品混合后的吸光度。 ABTS法優(yōu)缺點(diǎn) 3. 3.優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)缺點(diǎn) 簡(jiǎn)便，快速，簡(jiǎn)便，快速，適合于大量樣品的檢測(cè)適合于大量樣品的檢測(cè)。 ABTSABTS在與氫原子供體的反應(yīng)中在與氫原子供體的反應(yīng)中選擇性差選擇性差是此法的一個(gè)不足，是此法的一個(gè)不足，它它可與任何羥基化的芳香族化合物反應(yīng)可與任何羥基化的芳香族化合物反應(yīng)，這與它們的實(shí)際，這與它們的實(shí)際抗氧化能力關(guān)，因此抗氧化能力關(guān)，因此,T,TEACEAC值也包括對(duì)抗氧化不起作用的值也包括對(duì)抗氧化不起作用的羥基。羥基。六.TBA

13、RS法 簡(jiǎn)介簡(jiǎn)介 脂質(zhì)體系中氧化反應(yīng)抑制或中止的判斷主要通過(guò)測(cè)量被氧脂質(zhì)體系中氧化反應(yīng)抑制或中止的判斷主要通過(guò)測(cè)量被氧化物的濃度，氧的去除或氧化產(chǎn)物的形成。化物的濃度，氧的去除或氧化產(chǎn)物的形成。因此，反應(yīng)物因此，反應(yīng)物( (不飽和脂肪酸，自由基等不飽和脂肪酸，自由基等) )的消失，的消失，氧化產(chǎn)物的定量氧化產(chǎn)物的定量可能可能是判斷氧化階段的最合適方法。通過(guò)直接或者間接檢測(cè)氧是判斷氧化階段的最合適方法。通過(guò)直接或者間接檢測(cè)氧的消失和自由基的電子自旋光譜，適用于氧化過(guò)程的初始的消失和自由基的電子自旋光譜，適用于氧化過(guò)程的初始階段。通常采用階段。通常采用TBARSTBARS法來(lái)評(píng)價(jià)脂質(zhì)的過(guò)氧化法來(lái)評(píng)價(jià)脂質(zhì)的過(guò)氧化. .七.鐵離子還原能力(FRAP) 原理原理 FRAP FRAP的原理是基于氧化還原反應(yīng)的比色法的原理是基于氧化還原反應(yīng)的比色法。在酸性條件下，。在酸性條件下，F(xiàn)eFe3+3+一一TPTA(FeTPTA(Fe3+3+