半乳糖對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞擬衰老作用的實(shí)驗(yàn)研究_圖文

1、D2半乳糖對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞擬衰老作用的實(shí)驗(yàn)研究邢玉芝楊玲麟林洪胡火珍王有為【摘要】目的探討D2半乳糖(D2galacto se,D2gal誘導(dǎo)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(m arrow m esenchym al stem cells,M SC s衰老后的形態(tài)學(xué)及生物學(xué)變化情況。方法取3只2月齡SD大鼠M SC s分離培養(yǎng)至第3代,一部分置于含8g L D2gal的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)至第6代作為誘導(dǎo)組;另一部分在原培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)至第6代作為對(duì)照組,并作表型鑒定。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)對(duì)照組加入8g L D2gal后4d內(nèi)細(xì)胞周期的分布變化。兩組M SC s培養(yǎng)7d并繪制生長(zhǎng)曲線,在光鏡和透射電

2、鏡下觀察其形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化,2半乳糖苷酶染色、單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)DNA損傷方法檢測(cè)其衰老后的生物學(xué)行為變化。結(jié)果誘導(dǎo)組M SC s鏡下呈典型的衰老細(xì)胞形態(tài);對(duì)照組M SC s形態(tài)均勻,長(zhǎng)勢(shì)良好。流式細(xì)胞儀檢測(cè)表明加入D2gal誘導(dǎo)后90%M SC s停留在G0 G1期,而S期和G2 M期M SC s趨于消失,并隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)趨勢(shì)越明顯;對(duì)照組M SC s各期比例正常。M SC s生長(zhǎng)曲線示誘導(dǎo)組生長(zhǎng)速度較對(duì)照組明顯減慢。誘導(dǎo)組約85%呈2半乳糖苷酶陽性染色,對(duì)照組染色為陰性。單細(xì)胞凝膠電泳示誘導(dǎo)組M SC s DNA有拖尾現(xiàn)象,對(duì)照組M SC s無DNA損傷。結(jié)論D2gal對(duì)SD大鼠M SC s

3、的老化具有誘導(dǎo)作用,初步推斷8g L為最適濃度,為研究M SC s衰老提供了較好的模型?！娟P(guān)鍵詞】D2半乳糖骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞衰老大鼠中圖分類號(hào):R318Q813文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:ASTUDY ON CELL SENESCENCE IND UCED B Y D-GALACT OSE IN CUL TURED RAT M ESENCHYM AL STE M CELL S X IN G Y uz h i,YA N G L ing lin,L IN H ong,et a l.Cell B iology D ep a rt m en t,L if e S cience Colleg e,S ichuan

4、U n iversity,Cheng d u S ichuan,610064,P.R.Ch inaCorresp ond ing au thor:H U H uoz hen,E2m a il:huhuoz hen163.co m【Abstract】ObjectiveTo study mo rpho logical and b i o logical senescence changes induced by D2galacto se in the cu ltu red rat m esenchym al stem cells.M ethodsA fter3rd generati on s cu

5、 ltu red in the DM E M2F12,M SC s w ere changed in to DM E M2F12m edium con tain ing8g L D2galato se and cu ltu red to the6th generati on s as the inducem en t group.T he comparison w ere the6th generati on s w h ich w as cu ltu red in the DM E M2F12m edium all along,and then inden tified by su rfac

6、e w ave.U sing flow cytom eter to check the comparison s cell cycle change after s w ing in w ith8g L D2galato se w ith in the4days.In the first7days to draw the grow th cu rve to the tw o group s.Op tical and electron ic m icro scope w ere u sed to iden tify the influences of characteristic mo rpho

7、 logical of m esenchym al stem cells of the tw o group s,the influences of b i o logical m arkers w ere iden tified by single cell gel electropho resis and2galacto se dye.ResultsA fter treatm en t w ith D2galacto se,the m esenchym al stem cells disp layed mo rpho logical and b i o logical changes in

8、 the cell senescence w ith the senescen t characteristic mo rpho logicalm arkers;85%of the cells w ere X2gal dye m ascu line,and the singal cell gel electropho resis show ed DNA dam n ificati on.T he flow cytom etry show ed that90%of the cells stayed in G0 G1,bu t the cells in S and G2 M al mo st di

9、sappeared.How ever,the cells in the con tro l group had no such DNA dam ages.ConclusionD2galacto se can induce senescence of the m esenchym al stem cells,and8g L is the best concen trati on to do so.T h is study has p rovided a good model fo r the research of the m esenchym al stem cells senescence.

10、【Key words】D2galacto seM arrow m esenchym al stem cellsCell senescenceR at正常細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí),隨傳代數(shù)的增加,細(xì)胞的增殖能力逐漸喪失,當(dāng)不能再進(jìn)行有絲分裂時(shí),達(dá)到其生長(zhǎng)極限而成為衰老細(xì)胞1。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作者單位:四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室(成都, 610064通訊作者:胡火珍,教授,碩士導(dǎo)師,研究方向:衰老細(xì)胞的分子機(jī)制及干細(xì)胞研究,E2m ail:huhuozhen (m arrow m esenchym al stem cells,M SC s作為目前骨組織工程中重要的種子細(xì)胞224,其體外培養(yǎng)也隨著傳

11、代的增加而衰老,這對(duì)組織工程的構(gòu)建將產(chǎn)生不利影響,需要我們進(jìn)行有效監(jiān)控。D2半乳糖(D2 galacto se,D2gal可作為一種致老劑,能誘導(dǎo)細(xì)胞及整體動(dòng)物衰老5,6,但能否致M SC s衰老則罕見報(bào)道。因此我們擬初步建立一種M SC s的體外培養(yǎng)衰老模型體系,旨在探討D2gal對(duì)M SC s擬老化作用的影響,為抗組織工程種子細(xì)胞衰老提供依據(jù)。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑2月齡雄性SD大鼠3只,體重160185g(四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。DM E M2F12培養(yǎng)基、X2Gal染色劑(Sigm a公司,美國,小牛血清(成都生物制品有限公司,Perco ll分離液(1.073g mL

12、,Pham acia公司,美國,M T T、胰酶(Gibco公司,美國,D2gal(上海伯奧生物技術(shù)有限公司,DM SO(成都化學(xué)試劑廠,低熔點(diǎn)瓊脂糖和正常熔點(diǎn)瓊脂糖(O xo id公司,英國, CD142PE CD452F ITC、CD442F ITC、CD342F ITC CD452Percp、CD1052F ITC,CD292PE(Pharm ingen公司,美國。1.2M SC s體外分離培養(yǎng)SD大鼠斷頸處死后無菌操作,取雙側(cè)股骨和脛骨,剔除周圍肌肉組織,剪去兩骺端,抽取5m l無血清DM E M2F12培養(yǎng)基(含青霉素、鏈霉素各100U m l沖洗骨髓腔,吹打制成單細(xì)胞懸液,注入含有

13、5m l Perco ll分離液離心管中,離心半徑8c m,2000r m in 離心20m in,收集離心液界面上乳白色云霧狀的細(xì)胞層,先后以PB S和DM E M漂洗,用含15%小牛血清DM E M2F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,計(jì)數(shù)35×105個(gè) m l 后即接種于培養(yǎng)瓶中,置于37、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代培養(yǎng)。分別于1、3d半換液,以后每3天全量換液1次。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞培養(yǎng)全過程。13d后細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底80%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng),以1×104個(gè) m l終濃度傳代。1.3M T T檢測(cè)細(xì)胞活力取第3代M SC s按1×105個(gè) m l接種于96孔

14、板,置5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)接近融合時(shí),換含不同濃度D2gal為0、4、8、12、16g L100l培養(yǎng)液,同時(shí)等體積PB S作空白對(duì)照組,每組做5個(gè)平行樣品,3d后吸去培養(yǎng)液,PB S洗滌2次,每孔加入M T T(5m g m l 20l,繼續(xù)培養(yǎng)4h,棄上清,加入150lDM SO振蕩10 m in,用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定570nm的吸光度(A值。根據(jù)細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組-空白對(duì)照組 (對(duì)照組-空白對(duì)照組×100%計(jì)算細(xì)胞活力,選用8g L D2gal 建立M SC s衰老模型。1.4M SC s衰老模型的建立取部分第3代M SC s改換在含8g L D2gal DM E M2

15、F12培養(yǎng)液培養(yǎng),繼續(xù)培養(yǎng)至第6代,即為D2gal誘導(dǎo)的大鼠M SC s衰老模型,作為誘導(dǎo)組。另一部分在原培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)至第6代作為對(duì)照組。1.5M SC s表型鑒定取對(duì)照組M SC s以0.25%胰酶消化后制成1×105個(gè) m l的細(xì)胞懸液。室溫下分別與熒光標(biāo)記大鼠抗體CD142PE CD452F ITC、CD442F ITC、CD342 F ITC CD452Percp、CD1052F ITC、CD292PE混勻,孵育30m in,PB S洗滌2次,離心半徑8c m,1800r m in 離心5m in,棄上清,加入500l PB S中,各取6個(gè)樣本,流式細(xì)胞儀檢測(cè)。1.6檢測(cè)

16、項(xiàng)目1.6.1細(xì)胞周期分析取一部分對(duì)照組M SC s改換于含8g L D2gal DM E M2F12培養(yǎng)液中培養(yǎng),分別用0125%胰酶消化余對(duì)照組M SC s及培養(yǎng)1、2、3及4d 的M SC s,每個(gè)樣本收集約1×106個(gè)M SC s,PB S洗2次后懸浮于0.5m l PB S中,充分吹散混勻。將細(xì)胞懸液加入5m l70%乙醇中,4固定過夜。離心半徑8c m, 1200r m in離心10m in,棄乙醇,PB S洗2次后懸浮于015m l PB S中,加入碘化丙啶1m l(終濃度為50m g m l室溫避光反應(yīng)30m in,流式細(xì)胞儀檢測(cè)。1.6.2繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線取對(duì)照組和

17、誘導(dǎo)組M SC s,分別以1×104個(gè) m l細(xì)胞懸液接種于24孔培養(yǎng)板,當(dāng)單層細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%融合時(shí),每24小時(shí)消化收集細(xì)胞,制成細(xì)胞懸液,苔盼藍(lán)染色計(jì)數(shù),每組計(jì)數(shù)3孔,計(jì)算均值;共記數(shù)7d,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1.6.32半乳糖苷酶染色X2Gal染色劑配制: 100mm o l L磷酸鈉(pH7.3,113mm o l L氯化鎂, 3mm o l L鐵氰化鉀,3mm o l L亞鐵氰化鉀,1m g m l X2Gal;以上經(jīng)0.45m的膜過濾。固定液配制:濃甲醛10m l,冰醋酸3m l,生理鹽水加至100m l。2半乳糖苷酶染色:將對(duì)照組和誘導(dǎo)組M SC s分別接種于6孔板,調(diào)整細(xì)胞

18、密度為215×104個(gè) m l,待長(zhǎng)成單層后,吸凈培養(yǎng)液,加入1m l醋酸2甲醛固定液,室溫固定10m in;吸凈固定液,PB S洗滌3次,每次3m in;每孔加入1m l X2Gal染色劑;37孵育46h,保鮮膜封住6孔板防止蒸發(fā),至大部分M SC s變藍(lán),鏡下觀察。1.6.4單細(xì)胞凝膠電泳觀察按文獻(xiàn)7方法,磨砂載玻片上制備3層不同熔點(diǎn)的瓊脂糖凝膠層:1層為正常熔點(diǎn)的瓊脂糖凝膠層,作為底層;2層分別為對(duì)照組和誘導(dǎo)組M SC s懸液與低熔點(diǎn)的瓊脂糖凝膠混合后的凝膠層;3層為低熔點(diǎn)的瓊脂糖凝膠覆蓋層。將制好的凝膠板置于新鮮配置的冷裂解緩沖液中,4裂解1h,取出晾干,置于水平電泳槽中,電

19、泳完畢用中性化液中和,沖洗后溴化乙錠染色照相,進(jìn)行圖像分析。1.6.5透射電鏡觀察分別取兩組M SC s培養(yǎng)液4m l以離心半徑8c m,1200r m in離心10m in,棄上清,加入0.3%戊二醛固定液,4靜置30m in;再以離心半徑3c m,12000r m in離心15m in,棄上清,加入3%戊二醛固定液,固定60m in,經(jīng)脫水、包埋、超薄切片后透射電鏡下觀察。1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS10.0軟件統(tǒng)計(jì)包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用方差分析, P值<0105為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1M SC s體外分離培養(yǎng)原代培養(yǎng)的M SC s于1d

20、開始貼壁,細(xì)胞伸展成梭形、橢圓形或多角形;2d有細(xì)胞集落形成,貼壁細(xì)胞增多;4d呈典型的成纖維細(xì)胞形態(tài);10d細(xì)胞集落不斷擴(kuò)大而融合成單層(圖1。傳代M SC s生長(zhǎng)較原代快,7d即鋪滿培養(yǎng)瓶底,傳代細(xì)胞保持原代細(xì)胞的形態(tài)特征,隨代數(shù)增加M SC s得到純化,梭形細(xì)胞占90%以上(圖2。誘導(dǎo)組M SC s形態(tài)及排列不規(guī)則,體積較大,胞漿區(qū)域增大,漿核的比例增加,胞漿中可見較多顆?；蚩张?圖3。2.2M SC s表型鑒定由流式細(xì)胞表面標(biāo)志鑒定可見,CD44、CD29、CD105為陽性表達(dá),不表達(dá)造血細(xì)胞表面抗原CD14、CD34、CD45。2.3M T T檢測(cè)細(xì)胞活力0、4、8、12和16g L

21、組吸光度(A值分別為: 01241、0.230、0.201、0.136、01092g L,空白對(duì)照組為0.039g L;各組存活率分別為:96.70%±0.04%、84140%±0.02%、47.80%±0.04%、26.40%±0103%及21.20%±0102%,組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0105。根據(jù)存活率選用8g L D2gal建立M SC s的衰老模型。2.4流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期8g L D2gal加入后大部分M SC s停滯于G0 G1期,S期及G2 M期趨于消失;對(duì)照組各期比例正常。培養(yǎng)14d M SC s,S期依次為

22、11.4%、8.0%、7.1%及6.4%,明顯低于對(duì)照組(S期38.8%,見表1。2.5M SC s生長(zhǎng)曲線從細(xì)胞生長(zhǎng)曲線可見,誘導(dǎo)組M SC s生長(zhǎng)速度較對(duì)照組明顯減慢。對(duì)照組最大增殖數(shù)約為4.9×105,對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期在36d之間;誘導(dǎo)組最大增殖數(shù)約為718×104,對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期在47d之間(圖4。2.62半乳糖苷酶染色于pH6條件光鏡下可見誘導(dǎo)組85%的M SC s細(xì)胞質(zhì)內(nèi)為均勻的藍(lán)色陽性染色,而對(duì)照組胞質(zhì)內(nèi)仍為無色均勻的霧狀陰性染色(圖5。表18g L D-gal培養(yǎng)M SCs不同時(shí)間細(xì)胞周期分析(%Tab.1Cell cycle analysis of M SCs tr

23、eated by D-gal at differen t ti m es (%細(xì)胞周期Cell cycleG1G2S對(duì)照組Contro l group51.89.438.3加入D2galT reated by D2gal1d71.517.111.42d75.316.88.03d73.319.67.14d77.316.26.42.7單細(xì)胞凝膠電泳觀察在經(jīng)溴化乙錠染色的圖像分析后可見,對(duì)照組M SC s無DNA損傷,其熒光在細(xì)胞內(nèi);誘導(dǎo)組M SC s DNA的斷裂遷移出產(chǎn)生帶有熒光的尾部(圖6。2.8透射電鏡觀察誘導(dǎo)組M SC s呈典型的衰老形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化,核膜內(nèi)折,核染色質(zhì)濃縮,形成不同形狀的塊

24、狀;漿內(nèi)存在大量空泡,線粒體數(shù)量減少,體積增大或腫脹,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張;但細(xì)胞膜保持完整(圖7。對(duì)照組M SC s核膜平整光滑,染色質(zhì)分布均勻,胞漿內(nèi)可見豐富的線粒體(圖8。3討論3.1M SC s的生物學(xué)特點(diǎn)及表型鑒定體外擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)M SC s生長(zhǎng)性狀穩(wěn)定,1、3、5代細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)曲線和貼壁率無顯著差異;體外擴(kuò)增容易、接種存活率高、適應(yīng)能力強(qiáng)及增殖速度快,所以作為研究干細(xì)胞衰老是一個(gè)很好的模型8。我們采用密度梯度離心法分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞,再利用M SC s易貼壁生長(zhǎng)的特性,通過連續(xù)傳代獲得較純的M SC s。目前主要通過3種特征鑒定M SC s:體外培養(yǎng)貼壁生長(zhǎng)呈梭形;一定條件下可向成骨、軟

25、骨、脂肪和成纖維細(xì)胞等細(xì)胞譜系分化,對(duì)上述成熟細(xì)胞進(jìn)行功能鑒定;用特異結(jié)合M SC s細(xì)胞膜抗原的單克隆抗體直接鑒定9。但目前仍沒有用于鑒定的理想標(biāo)志性分子或方法,有學(xué)者10通過其表面分子的表達(dá)及多向分化潛能進(jìn)行鑒定。我們選擇了CD34、CD45、CD44、CD105、CD29抗原作表面標(biāo)記。雖然M SC s與造血干細(xì)胞共同存在于骨髓中,但M SC s不表達(dá)造血系統(tǒng)的標(biāo)志,包括CD14、CD34及白細(xì)胞共同抗原CD45,但CD44卻表達(dá)陽性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,所得細(xì)胞是骨髓中一群處于未分化狀態(tài)的非定向干細(xì)胞,而且不是造血干細(xì)胞。3.2M SC s 衰老模型的建立依據(jù)在M T T 的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中,可見

26、中等濃度(8g L D 2gal 處理M SC s ,活力降低;而高濃度(16g L 的D 2gal 處理呈負(fù)增長(zhǎng),表明D 2gal 能使M SC s 增殖速度減慢,但D 2gal 濃度過高,會(huì)使細(xì)胞受到損傷,引起細(xì)胞的凋亡或死亡,所以我們初步選擇8g L 的濃度進(jìn)行誘導(dǎo)衰老。誘導(dǎo)傳代3次后即建立了M SC s 衰老的研究模型。3.3M SC s 衰老模型的鑒定參照近年來有關(guān)學(xué)者11,12提出的衰老生物學(xué)方面的一些指標(biāo),實(shí)驗(yàn)對(duì)模型進(jìn)行了幾個(gè)衰老生物學(xué)標(biāo)志的鑒定。首先對(duì)M SC s 的動(dòng)態(tài)學(xué)形態(tài)學(xué)觀察,光鏡下 圖1M SCs 原代培養(yǎng)10d (×100圖2傳至第3代的M SCs (&#

27、215;100圖3M SCs 誘導(dǎo)組(×250圖4對(duì)照組與誘導(dǎo)組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖5M SCs -半乳糖苷酶染色a 誘導(dǎo)組染色呈陽性(×200b 對(duì)照組染色呈陰性(×100圖6M SCs 單細(xì)胞凝膠電泳圖(溴化乙錠染色×400a 誘導(dǎo)組b 對(duì)照組圖7M SCs 誘導(dǎo)組超微結(jié)構(gòu)a 核膜內(nèi)折(透射電鏡×10k b 胞漿內(nèi)大量空泡(透射電鏡×10k c 脂核素顆粒(透射電鏡×6k 圖8M SCs 對(duì)照組超微結(jié)構(gòu)(透射電鏡×6k F ig .1RatM SCs cultured for 10days (×100F i

28、g .2The 3rd passage of cultured rat M SCs (×100F ig .3M SCs i n the i nduce men t group (×250F ig .4Growth curves i n the con trol and the i nduce men t groups F ig .5-galactose dye of the M SCs a Po sitive 2galacto se dyeing of M SC s in the inducem ent group (×200b N egative 2galact

29、o se dyeing of M SC s in the contro l group (×100F ig .6Si ngle cell gel electrophoresis of M SCs (Eth idiu m bro m ide sta i n i ng ×400a T he inducem ent group b T he contro l group F ig .7Ultrastructure of M SCs i n the i nduce men t group a Inflexed karyo theca (T E M ×10k b L o t

30、s of vacuo les (T E M ×10k c L i poch rom e (T E M ×6k F ig .8Ultrastructure of M SCs i n the con trol group (TE M ×6k 誘導(dǎo)組較對(duì)照組的形態(tài)及排列不規(guī)則,體積較大,胞漿區(qū)域增大,胞漿中可見較多顆?；蚩张?有衰老表現(xiàn);透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)固化,核膜嚴(yán)重內(nèi)折,線粒體明顯減少并腫脹,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,與細(xì)胞衰老的生理行為一致;胞漿內(nèi)深色的圓形或橢圓形即為脂褐素,脂褐素是在胞漿中沉積隨老年化過程而增加,也是細(xì)胞衰老的特征性標(biāo)志。其次是對(duì)M SC s活力和

31、增殖速度的影響,通過繪制兩組M SC s的生長(zhǎng)曲線可以看出,細(xì)胞老化的進(jìn)程中生長(zhǎng)速度逐漸變緩,提示細(xì)胞老化是各種因素的作用積累到一定程度,才發(fā)生增殖休止生長(zhǎng)趨勢(shì)的改變,誘導(dǎo)組M SC s生長(zhǎng)速度較對(duì)照組的明顯減慢。D i m ri和Pendergrass等13,14發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞衰老的另一特征,體外培養(yǎng)人二倍體成纖維細(xì)胞在pH6時(shí),2半乳糖苷酶染色的陽性率隨代齡增加而增加,他們將這種中性2半乳糖苷酶定義為衰老相關(guān)的2半乳糖苷酶。2半乳糖苷酶是一種常用的報(bào)告基因分子,通過原位染色,在普通的光學(xué)顯微鏡下就可以用于檢測(cè)到2半乳糖苷酶的表達(dá)。誘導(dǎo)衰老的細(xì)胞中有85%細(xì)胞D2半乳糖苷酶染色陽性,表明該酶活性

32、明顯升高,是與衰老相關(guān)的。衰老是細(xì)胞脫離細(xì)胞周期并不可逆喪失增殖能力后進(jìn)入的一種相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài),是正常細(xì)胞的必然歸宿。細(xì)胞周期變化可反映細(xì)胞的增殖能力,在流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況發(fā)現(xiàn),正常的M SC s中僅有20%的靜止細(xì)胞(G0 G1細(xì)胞,這表明M SC s具有強(qiáng)大的自我更新能力;而誘導(dǎo)組大多數(shù)的M SC s則停滯于G0 G1期,S期及G2 M期M SC s趨于消失,表明M SC s分裂緩慢,增殖能力逐漸喪失。這與H ayflick發(fā)現(xiàn)人二倍體成纖維細(xì)胞在體外隨傳代次數(shù)的增加,逐漸喪失增殖能力而得到復(fù)制衰老的結(jié)果相似15。隨著D2gal作用時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞周期中G0 G1比例增高,但非

33、二倍體比例也顯著升高,細(xì)胞周期中非二倍體比例的升高提示,D2gal對(duì)M SC s的作用可能不僅是誘導(dǎo)衰老,更進(jìn)一步是誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。單細(xì)胞凝膠電泳能提供單個(gè)細(xì)胞中DNA損傷的情況,并可通過彗星尾長(zhǎng)的程度估計(jì)DNA損傷程度。細(xì)胞核中DNA是呈環(huán)狀附著在核基質(zhì)上的,細(xì)胞分裂時(shí)核基質(zhì)被溶解、抽提,但DNA仍保留核樣結(jié)構(gòu)。當(dāng)斷裂劑作用于細(xì)胞時(shí),DNA出現(xiàn)單鏈或雙鏈斷裂,即在DNA鏈上出現(xiàn)缺口,使DNA超螺旋變得松弛。堿性(>13使DNA變性,解螺旋,同時(shí)由于缺口暴露了陰電荷,在電場(chǎng)力作用下DNA斷片向陽極遷移。但DNA一端仍附著于核DNA,其遷移距離受到限制。DNA的移行可用溴化乙錠染色后在熒光

34、顯微鏡下觀察。未受損的M SC s則只有圓形熒光頭部,而無彗星樣尾部7,在衰老M SC s中常出現(xiàn)DNA斷裂損傷。綜上述,我們采用D2gal誘導(dǎo)方法初步建立了復(fù)制衰老的M SC s模型,實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示誘導(dǎo)的合適濃度是8g L,該M SC s衰老模型僅為進(jìn)一步研究干細(xì)胞衰老和抗細(xì)胞衰老奠定了實(shí)驗(yàn)平臺(tái),但在細(xì)胞衰老的機(jī)制及抗衰老等方面還存在一些問題,有待進(jìn)一步研究。4參考文獻(xiàn)1H ayflick L.T he li m ited in v itro lifeti m e of hum an di p lo id cell strains.Exp Cell R es,1965,37:6142636.2

35、孔清泉,項(xiàng)舟,楊志明.骨髓基質(zhì)干細(xì)胞作軟骨組織工程種子細(xì)胞研究.中國修復(fù)重建外科雜志,2002,16(4:2772280.3B ianco P,R i m inucciM,Grontho s S,et a l.Bone m arrow strom al stem cells:nature,bi o logy,and po tential app licati ons.Stem Cells,2001,19(3:1802192.4M outsatso s IK,T urgem an G,Zhou S,et al.Exogenously regulated stem cell2m ediated gene therapy fo r bone regenerati on.M o l T her,2001,3(4:4492461.5Song X,Bao M,L i D,et a l.