大孔吸附樹脂分離純化龍須藤總黃酮的工藝研究

1、大孔吸附樹脂分離純化龍須藤總黃酮的工藝研究                    作者：徐偉，張淑玲，洪振豐，鄭海音【摘要】目的 研究AB8大孔樹脂分離純化龍須藤黃酮的工藝條件。方法 通過靜態(tài)吸附解吸附實(shí)驗(yàn)篩選最佳大孔樹脂，并以總黃酮含量為考核指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)法對影響AB8大孔樹脂分離純化龍須藤黃酮的因素進(jìn)行考察，確定最佳工藝條件。結(jié)果 最佳工藝條件為：采用AB8型大孔樹脂，取龍須藤黃酮提取液(含生藥0

2、.5 g/mL)上樣，樹脂用量為4倍生藥量，洗脫劑采用體積分?jǐn)?shù)50乙醇，用量為16倍生藥量。結(jié)論 該工藝條件 科學(xué) 合理，可有效地用于龍須藤黃酮的分離富集。 【關(guān)鍵詞】   龍須藤 大孔樹脂 正交設(shè)計(jì)法 總黃酮Abstract:Objective To optimize the separation and purification procedure of total flavonoids from Bauhinia championii Benth by AB8 macroporus resin. Methods  The yield of total flavonoi

3、ds was used as a maker. The static and dynamic adsorption/desorption methods and orthogonal design L9（34）were used to evaluate factors such as concentration of alcohol，ratio of alcohol to raw material and ratio of resin to raw material. The content of total flavonoids was determined by UVVis spectro

4、photometer. Results  The optimum conditions were as following: ratio of resin to raw material was 4, 50% of alcohol was used for eluent, ratio of alcohol to raw material was 16. Conclusion This procedure is reasonable, which could be used to separate and purify the total flavonoids from Bauhini

5、a championii Benth.Key words:Bauhinia championii Benth；macroporus resin；orthogonal test；total flavonoids龍須藤 (Bauhinia championii Benth.)為雙子葉植物豆科羊蹄甲屬植物多年生藤，具有祛風(fēng)濕、行血?dú)獾墓πА?文獻(xiàn) 研究表明龍須藤具有鎮(zhèn)痛抗炎、抗風(fēng)濕骨痛、抗血小板凝集等藥理作用，主要含有黃酮、氰苷、沒食子酸等成分1。其中黃酮類是主要有效成分，具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛抗炎2、抗血小板凝集3等活性。大孔吸附樹脂是一類有機(jī)高聚物吸附劑，兼具吸附和分子篩分離原理，對有機(jī)化合物具有良好的

6、吸附分離性能。本文采用靜態(tài)吸附解吸實(shí)驗(yàn)，篩選最佳大孔樹脂，利用正交試驗(yàn)法對大孔樹脂分離純化龍須藤黃酮的主要影響因素進(jìn)行考察，優(yōu)化樹脂分離工藝參數(shù)，為開發(fā)利用龍須藤黃酮提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 1  儀器與試藥WFZ800D3B紫外可見分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器公司)；KQ2500B超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，BS200S 電子 天平（賽多利斯公司）。龍須藤采集于福建永泰縣青云山地區(qū)，由福建中院藥學(xué)系鑒定為豆科羊蹄甲屬植物龍須藤(Bauhinia championii Benth.)的藤。蘆丁對照品( 中國 藥品生物制品檢定所，供含量測定用，批號100080200306)，其他試劑

7、均為分析純。 2  方法與結(jié)果 2.1  龍須藤黃酮的提取4取粉碎過篩的龍須藤藥材適量，加10倍(生藥量)的體積分?jǐn)?shù)60乙醇浸泡3 h，回流提取3次，每次2 h，過濾，合并濾液，回收至無醇味，加水溶解至每1 mL含0.5 g生藥，離心(4 000 r/min )15 min，過濾，備用。測得總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.91。2.2  總黃酮含量測定42.2.1  標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制  精密稱取干燥至恒重的蘆丁對照品23.0 mg,置50 mL量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)95%乙醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用。精密吸取對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0

8、、6.0 mL，分別置25 mL量瓶中，加水至6.0 mL；加入5% NaNO2溶液1.0 mL，使混勻，放置6 min；加入10% Al(NO3)3 1.0 mL，搖勻，放置6 min；再加入4NaOH溶液10.0 mL，加水至刻度，搖勻，放置15 min，于500 nm波長處測定吸光度。以吸光度（A）對質(zhì)量濃度()進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：A=0.0055+0.024,r=0.999 87，表明蘆丁對照品質(zhì)量濃度在18.40110.4 g/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。2.2.2  樣品含量測定  龍須藤洗凈，晾干，置恒溫干燥箱中于75 下干燥8 h，取出粉碎，過篩(20目)

9、，所得粉末干燥保存?zhèn)溆?。按下述試?yàn)條件回流提取后，將粗提取液過濾，濃縮，放置冷卻后定容于100 mL量瓶中。精密吸取樣品溶液1.0 mL置10 mL量瓶中，再精密吸取溶液1.0 mL，按“2.2.1”項(xiàng)下方法，自“加水至6.0 mL”起依法測定吸光度，代入回歸方程 計(jì)算 出樣品溶液中總黃酮的提取率（總黃酮提取率總黃酮質(zhì)量/龍須藤質(zhì)量×100）。2.3  大孔樹脂的篩選選擇4種極性、孔徑、比表面等參數(shù)不同的大孔樹脂(DA101、AB8、HP20和H103)，分別用靜態(tài)吸附法和靜態(tài)解吸法測定其吸附與解吸性能，以確定實(shí)驗(yàn)用樹脂。2.3.1  大孔樹脂預(yù)處理 

10、稱取上述4種樹脂適量，用乙醇浸泡樹脂24 h后，分別上柱進(jìn)行預(yù)處理，用體積分?jǐn)?shù)95乙醇流動清洗，檢查流出的乙醇液至乙醇液與水15混合不呈白色混濁為止，然后以大量蒸餾水沖洗，至水洗液無醇味為止。2.3.2  靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)  稱取4種處理好的大孔樹脂(DA101，AB8，HP20，H103)2 g，分別加入龍須藤黃酮提取液10 mL置25 mL三角瓶中，每間隔10 min振蕩1次，持續(xù)4 h后，靜置24 h，使達(dá)到飽和吸附，過濾，測定濾液中黃酮含量，按吸附率=(初始濃度-吸附后濃度)初始濃度×100計(jì)算吸附率，結(jié)果見表1。2.3.3  靜態(tài)解吸實(shí)驗(yàn) 

11、; 將靜態(tài)吸附后的樹脂過濾抽干，各加入體積分?jǐn)?shù)50乙醇20 mL，每間隔10 min振搖1次，持續(xù)4 h后，靜置24 h。測定洗脫液中龍須藤黃酮的含量，按解吸率=(洗脫液濃度×洗脫液體積)/(初始濃度-吸附后濃度)×吸附液體積×100計(jì)算解吸率，結(jié)果見表1。         表1  樹脂對龍須藤黃酮的吸附率和解吸率（略）Table 1  Static and dynamic adsorption/desorption of total flavonoids比較各種樹

12、脂的吸附率和解吸率，綜合分析，以AB8型大孔樹脂對龍須藤黃酮的吸附分離效果較佳，故選擇AB8大孔樹脂作為實(shí)驗(yàn)用樹脂。2.4  大孔樹脂純化工藝研究2.4.1  正交試驗(yàn)5  采用AB8型大孔樹脂對龍須藤黃酮提取液進(jìn)行分離純化，對樹脂分離純化過程中的主要因素如大孔樹脂用量、洗脫劑(乙醇)濃度、乙醇用量等進(jìn)行考察，因素水平表見表2，正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。2.4.2  結(jié)果分析  以總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為考察指標(biāo)進(jìn)行直觀分析和方差分析，結(jié)果見表3和表4。可見各因素影響程度大小為CBA，其中C因素(樹脂用量)有顯著影響，A2B3C3為各因素的最佳水平，確定A2

13、B3C3為較優(yōu)樹脂純化工藝條件，即采用AB8型大孔樹脂，樹脂用量為4倍生藥量，洗脫劑采用體積分?jǐn)?shù)50乙醇，洗脫劑用量為16倍生藥量。2.4.3  驗(yàn)證試驗(yàn)  取龍須藤黃酮提取液，按照A2B3C3條件重復(fù)3次，結(jié)果3批樣品中黃酮平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.25，從提取液中的轉(zhuǎn)移率為83.67，表明該工藝條件合理，能較大程度地分離富集龍須藤黃酮。表2  因素水平表（略）Table 2  Factors and Levels表3  正交試驗(yàn)結(jié)果（略）Table 3  Result of orthogonal experiment表4  方差

14、分析結(jié)果（略）Table 4  Variance analysis results 3  討論大孔樹脂是一種多孔性高分子材料，具有多孔性和較大的比表面積，主要通過物理作用從溶液中有選擇性地吸附有機(jī)物質(zhì)，從而達(dá)到分離純化的目的。AB8為聚苯乙烯型非極性吸附樹脂，表面有一定的酯基，親水性得到改善，但吸附機(jī)理仍為疏水性吸附。該樹脂的比表面積和孔徑較大，適合于吸附具有一定疏水性的中藥成分，吸附量較大，洗脫容易，吸附動力學(xué)性能良好。對熱、有機(jī)溶劑和一般使用條件下的酸、堿穩(wěn)定，使用壽命較長。對蛋白、糖類、無機(jī)酸、堿、鹽、小分子親水性有機(jī)物均不吸附，因而可將一般中藥成分與這些物質(zhì)分離。通

15、過正交試驗(yàn)篩選得到龍須藤黃酮的分離純化條件：采用AB8型大孔樹脂，取龍須藤黃酮提取液(含生藥0.5 mL)上樣，樹脂用量為4倍生藥量，洗脫劑采用體積分?jǐn)?shù)50乙醇，用量為16倍生藥量。實(shí)驗(yàn)表明該法可有效地從龍須藤提取液中富集分離黃酮類有效成分。實(shí)驗(yàn)中對龍須藤黃酮的含量測定方法進(jìn)行了方考察，結(jié)果表明精密度、重復(fù)性、回收率均符合要求，在2 h內(nèi)顯色基本穩(wěn)定?！?參考 文獻(xiàn) 】 1 白海云，詹慶豐，夏增華，等.九龍?zhí)倩瘜W(xué)成分研究J. 中國 中藥雜志，2005，30(1)：42-43.2 洪振豐，徐偉，鄭海音，等.康美膚燒傷膏的抗炎和鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)研究J.中國中醫(yī)藥科技，2007，14（6）：410-411.3 胡娟，葉蕻芝，馮亞，等.3種閩產(chǎn)中藥體外對大鼠血小板凝集的影響J.福建中院學(xué)報(bào)，2007，17（3）：23-26.4 徐偉，洪振豐，王瑞國.龍須藤中黃酮類化合物提取