全身照射引起間充質(zhì)干祖細胞池縮小及成骨潛能改變

1、全身照射引起間充質(zhì)干/祖細胞池縮小及成骨潛能改變          作者：馬杰，陳斌，王宏蘭，李靜，史明霞，李炳宗，胡建立，趙春華【摘要】  為了研究輻射對骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSC）數(shù)量及成骨分化潛能的影響，探討B(tài)MMSC在輻射損傷中的反應(yīng)及其與照射后造血和骨骼系統(tǒng)長期損傷的關(guān)系，用全身照射（total body irradiation, TBI）小鼠模型觀察TBI前后不同時間點小鼠骨髓纖維母細胞集落形成單位（colon

2、y?forming unit?fibroblast, CFU?F)的改變及BMMSC細胞周期分布情況；用Von Kossa染色法測定鈣鹽沉積,實時定量RT?PCR檢測成骨分化相關(guān)基因及成骨轉(zhuǎn)錄共刺激因子TAZ (transcriptional coactivator with PDZ?binding motif)的表達變化。結(jié)果顯示：TBI后骨髓CFU?F數(shù)量明顯減少；TBI后3天較多的BMMSC進入細胞周期并且其成骨潛能明顯增強，隨后細胞周期分布恢復(fù)正常，但成骨潛能明顯降低，同時伴有TAZ表達改變。結(jié)論：TBI能導(dǎo)致小鼠骨髓間充質(zhì)干/祖細胞池的顯著縮小并改變BMMSC的成骨分化潛能，TAZ表

3、達的變化可能在其成骨潛能的改變中發(fā)揮一定作用。 【關(guān)鍵詞】  全身照射；骨髓間充質(zhì)干細胞；成骨潛能；TAZ Reduction of Bone Marrow Mesenchymal Stem/Progenitor Cells Pool and Alteration of Their Osteogenesis Potential Caused by Total Body Irradiation        Abstract    To investigate the effect of

4、 irradiation on the quantity and osteogenesis potential of BMMSCs and to explore the response of them in the irradiation stress and its contribution to long?term effects of radiation?induced bone and hematologic injury, a total body irradiation (TBI) murine model was adopted. The number of CFU?F and

5、 cell cycle profile of BMMSCs were analyzed at different time points before and after TBI. Osteogenic differentiation was evaluated by Von Kossa staining,  expressions of    osteogenesis?related genes and transcriptional coactivator with PDZ?binding motif (TAZ)  were detecte

6、d by real?time RT?PCR. The results showed that the number of CFU?F decreased greatly at day 28 after TBI. At day 3 after TBI， more cells entered cell cycle and the osteogenesis potential was greatly enhanced followed by recovery of cell cycle distribution and signifiacant defect in osteoblast differ

7、entiation respectively,  meanwhile the expression of TAZ was changed. It is concluded that TBI results in the reduction  of bone marrow mesenchymal stem/progenitor cell pool and alters the osteogenesis potential of BMMSCs,  which is related to the change of TAZ expression.  

8、  Key words    TBI；bone marrow mesenchymal stem cell; osteogenesis potential; TAZ    放射治療在目前仍是腫瘤治療中的一個重要手段，但是這種治療方法并非是腫瘤特異性的，正常組織尤其是造血和骨骼系統(tǒng)極易受到損害。隨著接受放射治療的腫瘤患者生存狀況的改善，對放射治療導(dǎo)致的一些遠期毒副作用機制的探討顯得尤為重要。以往多認為造血干細胞（hematopoietic stem cells, HSC）的凋亡1,2、自我更新能力及HSC池的縮小3,4和成骨細胞

9、、破骨細胞的改變5分別是照射后造血和骨骼系統(tǒng)損傷的機制。然而造血功能的維持不僅與造血細胞本身有關(guān)，還與造血微環(huán)境息息相關(guān)，而骨容量的調(diào)控尤其是在病理條件下的調(diào)控皆依賴于足夠的成骨干/祖細胞的存在6。 骨髓中與HSC共存的BMMSC不僅能生成骨髓微環(huán)境中的大多數(shù)細胞，并且是成骨細胞的來源。此外，BMMSC因其多向分化潛能、分泌多種細胞因子及強的免疫調(diào)節(jié)功能，在損傷等病理生理情況下參與組織修復(fù)。因此，本研究利用全身照射的小鼠模型研究輻射對BMMSC的影響，并從BMMSC水平初步探討放射治療后一些遠期損傷的可能機制。  材料和方法    實驗動物及輻

10、射損傷模型制備    5周齡雄性C57BL/6小鼠購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所，實驗動物隨機分為正常對照組和全身照射組，后者經(jīng)137Cs射線進行一次性全身照射4.0 Gy，吸收劑量率為2.4 Gy/min。每批動物分別在照射后的0、1、3、7、14和28天取股骨和脛骨，所得到的BMMSCs分別命名為D0，D1，D3，D7，D14和D28。    主要試劑和儀器    Ficoll?Paque分離液為Pharmacia公司產(chǎn)品，胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品，100 g/ml青霉素、100 g/ml鏈

11、霉素、0.125%胰蛋白酶均購自Gibco公司，DF12、MCDB、地塞米松、?擦姿岣視湍啤夠笛?酸均購自Sigma公司，F(xiàn)lk1 抗體購自Santa Cruz 公司，CD34、CD45、CD31、GlyA、vWF、CD11a、CD11b 抗體購自晶美生物工程有限公司，TRIzoL為Invitrogen公司產(chǎn)品，5×Buffer、 RT?dNTP、 逆轉(zhuǎn)錄酶、RNase抑制劑、OligdT均購自TaKaRa公司；real?time試劑盒購自Qiagen公司，流式細胞儀為Becton Dickinson公司產(chǎn)品，real?time PCR儀（ABI PRISM7500）為Applied

12、 Biosystems公司產(chǎn)品）。    小鼠骨髓單個核細胞的制備和BMMSC的分離及培養(yǎng)    無菌狀態(tài)下取雄性C57 BL/6小鼠的股骨和脛骨，用4號針頭反復(fù)沖洗，將沖出的骨髓，制成單細胞懸液。用Ficoll?Paque(1.077 g/ml)分離出單個核細胞（bone marrow mononuclear cells, BMMNC）并計數(shù)，應(yīng)用MACS CD45，GlyA和CD34磁珠去除其中的造血細胞,以107/ml的細胞密度接種在25 cm2 的培養(yǎng)瓶內(nèi)。培養(yǎng)液成分為40% MCDB、55% DF12、4%胎牛血清、100

13、U/ml青霉素和1 000  U/ml鏈霉素,置于37、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24小時后去掉懸浮細胞,細胞融合達70%時，用0.125 %胰酶消化并以12比例傳代。這些細胞的免疫表型傳代30次以上始終保持CD34、CD45、CD31、vWF、GlyA、CD11a、CD11b陰性, Flk1陽性(資料未顯示)，因而我們稱之為Flk1+MSC。    CFU?F計數(shù)    以2×105/cm2 的密度將BMMNC接種在25 cm2的培養(yǎng)瓶中。在37、 5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，每3天換液1次，在

14、第9天去掉培養(yǎng)液，用D?Hank 液洗2遍，甲醇固定后，結(jié)晶紫染色。在100倍倒置顯微鏡下計數(shù)，大于50個纖維母細胞樣的細胞集落才被認為是CFU?F。    細胞周期測定    于細胞生長的對數(shù)期消化細胞并測DNA的含量。細胞首先用70%的冰乙醇4固定過夜，用磷酸鹽緩沖液洗滌細胞2遍，然后用40    g/ml的RNase A 37孵育20分鐘，加入3 g/ml 碘化丙錠，室溫孵育5分鐘，用流式細胞儀測定。    成骨的定向誘導(dǎo)分化和鑒定   

15、以2×104/cm2的密度將細胞加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、1.0×10-8 mol/L地塞米松、2.0×10-4  mol/L抗壞血酸、7.0×10-3  mol/L ?擦姿岣視偷?IMDM)，每3天半量換液1次，每天觀察1次。用Von Kossa 染色檢測鈣質(zhì)沉積，即中性甲醛固定1小時后，去離子水沖洗，加入2%硝酸銀溶液，37避光反應(yīng)10分鐘，去離子水沖洗后爆光15分鐘，光學(xué)顯微鏡下觀察鈣化基質(zhì)沉淀。    RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄    取體外擴增的小鼠BMMSC

16、及擴增后成骨誘導(dǎo)的細胞按照TRIzoL說明書提取細胞總RNA。每瓶貼壁細胞加1   ml TRIzoL液裂解，加0.2 ml三氯甲烷，冰浴后12 000×g離心10分鐘。上層水相移出后加異丙醇500 l 12 000×g離心10分鐘。75乙醇洗RNA  1次。將RNA配成30 l逆轉(zhuǎn)錄體系（5×Buffer 6 l, RT?dNTP 2 l, 逆轉(zhuǎn)錄酶1 l，RNase抑制劑1 l，OligdT 3 l，DEPC水17 l）。    RT?PCR    Real?time R

17、T?PCR前，cDNA產(chǎn)物在20 l體系中行PCR以檢測成骨指標，如Cbfa1（core?binding factors）/Runx2、型膠原（type 1 collagen，Col1）、骨鈣蛋白（osteocalcin, OC）、成骨蛋白(osteopontin, OPN)和TAZ的表達。反應(yīng)條件為：95 5分鐘，94 40秒，58-62 40秒，72  40秒，循環(huán)32次，最后72延伸7分鐘。引物及其相應(yīng)退火溫度如表1。    熒光實時定量RT?PCR（real time RT?PCR）    Real?time RT?

18、PCR測定正常及照射后1、3、7、14和28天小鼠BMMSC  TAZ的表達及上述的BMMSC體外成骨誘導(dǎo)1周或3周后成骨相關(guān)基因Cbfa1、Col1、OC和OPN的表達。以?actin為管家基因，應(yīng)用嵌入熒光染料SYBR Green I進行熒光定量PCR擴增。擴增體系為20 l，含2×Premix 10 l, 上游和下游引物各1 l，模板cDNA 1 l，DEPC水7  l。擴增條件為：95 15秒，94 15秒，58-62 30秒，72 40秒，40個循環(huán)，引物及退火溫度如表1。    統(tǒng)計學(xué)處理   

19、; 應(yīng)用SPSS軟件分析數(shù)據(jù)，兩樣本均數(shù)間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有顯著意義，P<0.01為差異有極顯著意義。    結(jié)    果    TBI后骨髓間充質(zhì)干/祖細胞池縮小    預(yù)實驗中我們發(fā)現(xiàn)，小鼠接受不同劑量（2、 4、 6.5 和 8 Gy）的TBI后，BMMNC和CFU?F的數(shù)量改變呈劑量和時間依賴性。我們選擇4 Gy作為TBI的劑量進行下面的實驗。如圖1所示，4 Gy TBI后BMMNC迅速降低，在TBI后第3天達最低點，此后逐漸恢復(fù)，在TB

20、I后28天基本恢復(fù)至正常水平（圖1A）。而CFU?F/106 BMMNC在第3天最高，然后逐漸下降，至第28天仍未見恢復(fù)的趨勢（圖1B）。分析每只小鼠后肢中所含CFU?F，我們發(fā)現(xiàn)，雖然CFU?F的絕對數(shù)量在TBI后第3天稍有回升，但其后表現(xiàn)為長期的降低，4周內(nèi)未見恢復(fù)（圖1C）。    Figure 1.  Reduction of BM mesenchymal stem/progenitor cell pool caused by TBI. A: BMMNC/ hind legs; B: CFU?F/106 BMMNC; C: CFU?F/2 hin

21、d legs. The data are expressed as means±SD (n=3). *P<0.01, compared with D0.    TBI對BMMSC細胞周期的影響    用流式細胞儀檢測正常及TBI后3、7和28天BMMSC細胞周期分布，結(jié)果如圖2和表2所示。正常情況下（86.1±2.64）% BMMSC處于G0/G1期，在TBI后第3天較多細胞進入S期(P=0.002)，但在TBI后28天BMMSC細胞周期的分布又恢復(fù)至正常。百事通     TBI

22、后BMMSC的體外成骨潛能的變化    如圖3所示，TBI前后不同時間點BMMSC在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液中誘導(dǎo)3周后，進行Von Kossa染色發(fā)現(xiàn)其成骨潛能明顯改變。TBI后3天成骨潛能明顯增強，而TBI 7天后則明顯下降，分別表現(xiàn)為黑色礦化物沉積的明顯增多和減少。4周內(nèi)成骨潛能未見明顯恢復(fù)。    TBI后BMMSC成骨分化相關(guān)基因的表達    TBI后一些成骨相關(guān)基因的表達呈時間依賴性，并與體外誘導(dǎo)時限相關(guān)。如圖4 A和B所示，體外成骨誘導(dǎo)1周，核心結(jié)合因子1 （core?binding factor 1

23、，Cbfa1）、型膠原（type 1 collagen，Col1）和骨鈣蛋白（osteocalcin， OC）在TBI后3天BMMSC中表達最高，在TBI后28天表達最低。骨橋蛋白（osteopontin，OPN）的表達同樣在TBI后3天最高，但其余時間點的表達與正常均無差異。而在成骨體系中培養(yǎng)3周，TBI后3天BMMSC Cbfa1的表達仍然最高，不同的是Col1和OC的表達在TBI后28天達高峰，TBI后3天最低。TBI后不同時間點OPN的表達與正常無差異。    TBI后BMMSC TAZ的表達    Real?time RT?

24、PCR 方法檢測 TBI 前后不同時間點BMMSC TAZ的表達，結(jié)果如圖4 C所示，TAZ在TBI后3天表達最高，但TBI后7天明顯降低，4周    內(nèi)其表達未見恢復(fù)。    討    論    近年來，在充分認識MSC的生物學(xué)特性后，有關(guān)MSC，尤其是BMMSC在損傷、疾病及衰老等病理生理情況下所發(fā)揮的作用和其在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用都取得了較多進展。重要的是，一些研究顯示BMMSC在某些疾病的發(fā)生發(fā)展中也起著重要作用7,8，在本研究中我們也發(fā)現(xiàn)TBI后骨髓間充質(zhì)干/祖細胞池明

25、顯縮小，體外成骨潛能改變顯著。    CFU?F是一種對間充質(zhì)干/祖細胞總數(shù)進行量化的檢測方法9。通過對TBI前后CFU?F的監(jiān)測，我們發(fā)現(xiàn)TBI對BMMSC的影響首先表現(xiàn)為間充質(zhì)干/祖細胞池的縮小。雖然通過凋亡的早期檢測方法Annexin V分析，我們沒有觀察到BMMSC的明顯的凋亡（結(jié)果未顯示），但這一結(jié)果并不能排除TBI后體內(nèi)BMMSC發(fā)生凋亡。干細胞的自我更新能力在維持干細胞池的穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用，因而TBI后骨髓間充質(zhì)干/祖細胞池的縮小是否源于BMMSC自我更新能力的改變還需進一步研究。    除了BMMSC數(shù)量的改變，通過

26、Von Kossa染色和成骨分化相關(guān)基因表達的分析我們發(fā)現(xiàn)，TBI能顯著改變BMMSC體外的成骨潛能。只有完全成熟的成骨細胞才能產(chǎn)生基質(zhì)并礦化。Cbfa1是成骨分化的重要調(diào)控因子，能調(diào)控分化的成骨細胞骨沉積的速率10-12，TBI后Cbfa1表達的變化與Von Kossa染色結(jié)果是一致的。Col1是成骨分化過程的早期標志之一，它在成骨分化早期被誘導(dǎo)表達，在鈣質(zhì)沉積將結(jié)束時表達降低13，而OC是分化成熟的成骨細胞的標志，僅表達于完全分化的成骨細胞，而在成骨分化的終末階段即分化至骨細胞和骨襯細胞（bone lining cells）時則不表達14。體外成骨誘導(dǎo)1周時， TBI后3天BMMSC的上述

27、成骨相關(guān)基因表達明顯增高，提示TBI后早期成骨細胞分化過程加速。誘導(dǎo)3周即成骨細胞分化以成熟基質(zhì)礦化為特征時，TBI后28天BMMSC不僅缺乏應(yīng)有的鈣質(zhì)沉積（Von Kossa結(jié)果所示），其成骨分化相關(guān)基因Col1和OC高表達，提示分化的成骨細胞仍然處于一個早期的不成熟的階段。而此時TBI后3天BMMSC的Col1和OC量明顯降低，這可能反映了成骨細胞已分化至終末階段即分化為骨細胞。OPN是骨基質(zhì)形成時的另一個標志，成骨分化過程中它的表達呈雙峰，即首先表達于活躍的細胞增殖期，然后降低，在細胞開始礦化時表達再次增高15。這一表達的雙時相性可能是TBI后OPN表達變化不顯著的原因。TAZ是一種轉(zhuǎn)錄

28、因子，通過WW模體結(jié)合于Cbfa1/Runx2的PPPY結(jié)構(gòu)域而產(chǎn)生共激活作用16，進而調(diào)節(jié)MSC向成骨分化而抑制成脂分化17。我們的研究結(jié)果顯示，TBI后BMMSC TAZ的變化趨勢和Cbfa1的一致，這種變化在向成骨誘導(dǎo)前就已經(jīng)存在。以上這些結(jié)果說明，TBI干擾了成骨細胞的分化過程，損傷的早期BMMSC成骨分化潛能明顯增強，而最終成骨細胞生成受阻，TAZ的表達變化可能是導(dǎo)致這一變化的原因之一。    正常情況下體內(nèi)的干細胞處于靜止狀態(tài)，在機體受到應(yīng)激或損傷時它們將重新進入細胞周期促進組織的再生與修復(fù)18。我們觀察到的TBI后早期更多的BMMSC進入細胞周期及成

29、骨潛能的增強提示，在放射損傷的早期BMMSC通過增殖能力和成骨能力的增強來盡力維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，但是BMMSC的這種代償功能是有限的。成骨細胞不僅在骨骼系統(tǒng)的維持中發(fā)揮重要作用，它還是骨髓造血龕位（niche）的重要組成成分19，因而TBI所導(dǎo)致的骨髓間充質(zhì)干/祖細胞池的縮小及其成骨分化潛能的降低使成骨細胞的分化明顯受阻，這可能是放射損傷后造血和骨骼系統(tǒng)遠期功能障礙的干細胞水平的機制?！緟⒖嘉墨I】  1Domen J, Gandy KL, Weissman IL. Systemic overexpression of BCL?2 in the hematopoietic syst

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