兔骨骼肌衛(wèi)星細胞的體外培養(yǎng)及生長特性的研究

1、    兔骨骼肌衛(wèi)星細胞的體外培養(yǎng)及生長特性的研究        摘要：目的：研究體外分離培養(yǎng)的兔骨骼肌衛(wèi)星細胞(SC)的生物學特性。方法：采用細胞培養(yǎng)方法，對兔骨骼肌SC進行活細胞觀察，并測定兔骨骼肌SC的細胞生長曲線、細胞分裂指數、細胞貼壁率。結果：兔骨骼肌SC為梭形，呈長軸平行排列，具有明顯的方向性；體外培養(yǎng)的兔骨骼肌SC在10代以內生長穩(wěn)定，超過10代以后肌SC的融合能力和形成肌管的能力也隨之下降。結論：體外培養(yǎng)的兔骨骼肌SC在合適的傳代比例和培養(yǎng)條件下在體外能夠生存

2、并保持其特性。從肌SC穩(wěn)定的生物學特性看，可以將其作為研究肌肉受損后再生修復的細胞模型，用于檢測和研究某些基因和生長因子對肌肉再生和功能恢復的影響。關鍵詞：衛(wèi)星細胞；細胞培養(yǎng)；兔；骨骼肌分類號：Q813.1+1文獻標識碼：A文章編號：1001-3733(2000)01-0007-03Culture and proliferative characteristics of rabbit skeletal muscle satellite cellXu PengGu Xianming(Stomatological Hospital, Fourth Military Mekical Universi

3、ty,Xi'an 710032)Abstract：Objictive：To study the biological characteristics of rabbit skeletal muscle satellite cells(SCs)cultured in vitro. Methods:Invitro cell culture technique, morphological observation, cell counting, mitosis index and adhesion rate measuring were used to study the character

4、istics of the SCs.Results:(1)Scs were spindle and parallel along their longitudinal axis, showing obvious orientation.(2) SCs grew steadily within 10 passages, and their ability to fuse and form myotubes faded after 10 passages.Conclusion:SCs cultured from rabbit skeletal muscle can grow and maintai

5、n their characteristics in vitro provided appropriate passaging rate and culture condition.Key words：Satellite cell; Cell cultivation; Rabbits; Skeletal muscle肌衛(wèi)星細胞(SC)是一種正常情況下位于成熟肌纖維表面的肌源性細胞。當肌纖維損傷或受到一定刺激后，即促使原來廣泛分布的SC向受損區(qū)遷移并被激活，進行有絲分裂，隨后SC之間相互融合或與受損肌纖維末端融合，融合后的細胞即開始合成收縮蛋白。通過這種方式恢復受損肌肉的連續(xù)性和收縮功能1。體外

6、培養(yǎng)的兔骨骼肌SC與體內的SC相比，其生物學特性如何，發(fā)生了那些變化，將直接影響到利用SC進行進一步的研究，目前相關的研究報道很少。本實驗的目的在于對體外分離培養(yǎng)的兔骨骼肌SC的生物學特性進行研究，并比較組織塊法、改良酶消化法和密度梯度離心法3種方法獲得的兔骨骼肌SC的活細胞形態(tài)和生長特性。1材料和方法1.1實驗動物為兩月齡新西蘭白兔。1.2采用組織塊法、改良酶消化法和密度梯度離心法2分離兔比目魚肌的SC，進行培養(yǎng)。對三種方法所獲SC利用倒置顯微鏡進行活細胞形態(tài)觀察；采用MTT法測定SC的生長曲線；同時測定SC的分裂指數和細胞貼壁率。2結果2.1原代或傳代后的肌SC倒置顯微鏡下的觀察2.1.1

7、組織塊法兔骨骼肌SC原代培養(yǎng)后第3天，在組織塊周圍長出梭形細胞和星形細胞，細胞體積中等，散在分布，細胞間較少見緊密連接(1)。第910天，培養(yǎng)瓶中細胞長滿。從第7天開始，梭形細胞的排列開始出現方向性，它們的長軸平行排列，部分細胞之間開始出現融合，形成多核細胞，同時有肌管形成。星形細胞呈網狀排列。傳代后的細胞部分呈梭形，多呈方向性排列；部分呈星形。融合的梭形細胞數量明顯增加(36個/20×10倍視野)。根據免疫組化染色鑒定的結果，可確定該細胞是肌SC，但隨傳代次數的增加，星形細胞數量迅速增加，其生長速度遠遠快于梭形細胞。這樣，在一定的生長時間內，梭形細胞數量相對逐漸減少。2.1.2改良

8、酶消化法原代培養(yǎng)24 h后即開始有細胞貼壁，多為梭形細胞，經鑒定是肌SC，呈長軸平行排列，少數為星形細胞。第3天部分肌SC即開始出現融合，肌管結構形成現象多見。傳代后觀察同組織塊法。2.1.3密度梯度離心法將細胞懸液加入15 ml離心管中，其下方為11.5 ml 20% Percoll，最底層為60% Percoll 1.5 ml。然后進行離心。根據密度指示球可劃分為7層。各層容積分別為14層各2.5 ml，5、6、7層分別為2.1、0.5、1.4 ml(2)。取第6、7層細胞進行培養(yǎng)，在原代培養(yǎng)24 h后即開始有細胞貼壁，幾乎全部是梭形細胞，呈長軸平行排列，星形細胞和圓形細胞(紅細胞)極為少

9、見。從第3天開始出現梭形細胞融合成多核細胞和肌管形成現象。傳代后幾乎全部為梭形細胞，梭形細胞融合成多核細胞以及肌管形成現象多見(3)。1組織塊法獲得的細胞，第3 天(20×)2密度梯度離心法各層細胞分布3密度梯度離心法獲得的細胞，可見梭形細胞融合，肌管形成(20×，HE染色)。2.2兔骨骼肌SC的生長曲線從4中可以看出，細胞在接種培養(yǎng)后第2天數量有所減少，屬于生長適應期。第3 天細胞數量重新開始增加。第46天細胞增殖速度最快，到第7 天增殖速度逐漸減慢。4兔骨骼肌衛(wèi)星細胞生長曲線根據細胞生長曲線上對數生長期始末兩點間吸光度值的變化，應用以下公式可以計算出兔骨骼肌SC數的相對

10、吸光度值倍增時間。DT=t×log2/(logN-logN0)DT為吸光度值增加1倍的時間，N0為培養(yǎng)第1 天的相對吸光度值，N為生長高峰時相對的吸光度值，t為倍增時間(h)。計算結果：肌SC相對吸光度值倍增時間為72 h。2.3兔骨骼骨SC的分裂指數變化5示在培養(yǎng)接種24 h后，開始出現細胞分裂相，但數量很少。培養(yǎng)到72 h，細胞分裂達到高峰，此后逐漸下降，至第7 天已看不見有細胞分裂相，分裂指數降為零。5兔骨骼肌衛(wèi)星細胞分裂指數曲線6兔骨骼肌衛(wèi)星細胞貼壁率曲線2.4兔骨骼肌SC貼壁率曲線從6中可以看出，肌SC在接種后2 h就有近45%的細胞貼壁，接種6 h后，貼壁率接近80%，1

11、2 h以后，90%以上的細胞貼壁。3討論通過對3種方法獲得的兔骨骼肌SC的活細胞形態(tài)和生長特性的觀察發(fā)現，以密度梯度離心法獲得的肌SC純化率(平均75%以上)最高。組織塊法獲得的細胞相當混雜，不可避免地混有成纖維細胞樣細胞、紅細胞、骨骼肌細胞和血管平滑肌細胞，影響體外對肌SC的培養(yǎng)和研究。改良酶消化法中由于經過Len's網過濾3，去除了肌纖維，但是也含有部分成纖維細胞樣細胞，并且SC的含量不高，所以也影響體外對肌SC的培養(yǎng)和研究。密度梯度離心法獲得的SC比例高，雜質細胞少。以密度梯度離心法獲得的細胞為例，SC為梭形，呈長軸平行排列，具有明顯的方向性，這與其在體內的排列方式，即與肌纖維長

12、軸平行的情況相符合。因肌SC在某種因素刺激下將被激活而形成肌細胞，肌細胞要完成功能性收縮，要求細胞的排列必須具有同向性，雜亂無章地排列既不能表現力，也不能表現位移。肌SC的按方向排列和融合的傾向是這種細胞內在的功能特性之一。從肌SC的生長特性來看，體外培養(yǎng)的兔骨骼肌SC在10代以內生長穩(wěn)定，尤以第3代至第8代之間最為穩(wěn)定。由于肌SC被認為是成肌干細胞，故應容易傳代并保持其特性。但本實驗中超過10代以后，肌SC的數量和特性均有所減低，典型的肌SC數量下降，其融合能力和形成肌管的能力也隨之下降，可能是體外環(huán)境不同于體內環(huán)境如神經支配、神經介質等多種因素作用的結果。但它們在合適的傳代比例和培養(yǎng)條件下

13、在體外還是能夠生存并保持其特性的。另一方面，肌SC的增殖速度低于正常成纖維細胞和一般體外培養(yǎng)的腫瘤細胞系，后兩者在體外的增殖速度均較快，倍增時間一般在20 h左右，分裂指數最高峰在3040，比肌SC高1.5倍。這是因為正常肌SC在體內環(huán)境中基本處于休眠狀態(tài)，不表現增殖，只有在肌肉失神經支配或肌肉受到損傷的情況下才被激活，進入增殖狀態(tài)。在體外培養(yǎng)中，從肌SC穩(wěn)定的增殖速率看，可以將其作為研究肌肉受損后再生修復的細胞模型，用于檢測和研究某些基因和生長因子對肌肉再生和功能恢復的影響。從肌SC的貼壁率測定結果看，兔骨骼肌SC對體外培養(yǎng)條件的適應性較強，可在短時間內(2 h)開始附壁存活，而且傳代后存活

14、率更高，對利用該細胞進行體外研究提供了穩(wěn)定的模型?；痦椖浚罕狙芯繛閲易匀豢茖W基金資助(編號：39770803)作者單位：徐蓬（西安第四軍醫(yī)大學口腔頜面外科，710032）顧曉明（西安第四軍醫(yī)大學口腔頜面外科，710032）參考文獻：1Campion DR.The muscle satellite cell:A review.Int Rev Cytol,1984,87:2252Yablonka-Reuveni Z,Nameroff M.Skeletal muscle cell populations separation and partial characterization of fibroblast like cells from embryonic tiss