綠色熒光蛋白和成肌調(diào)節(jié)因子在骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中的共表達(dá)

1、綠色熒光蛋白和成肌調(diào)節(jié)因子在骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中的共表達(dá)    作者：李美山，張成，陳松林，于美娟，張雅妮，王淑輝，熊符    【關(guān)鍵詞】 腺病毒    Coexpression of both green fluorescent protein and myogenic regulatory factors in bone marrowderived mesenchymal stem cells 【Abstract】 AIM: To investigate the transf

2、ection of bone marrowderived mesenchymal stem cells (MSCs) by recombinant adenovirus (Ad), and the expressions of both green fluorescent protein (GFP) and myogenic regulatory factors, which are MyoD and Myogenin. METHODS: Rat MSCs were separated, cultured and expanded in vitro, and taken for identif

3、ication of surface antigens by flow cytometry (FCM). AdGFP was amplified and identified to transfect MSCs. Expressions of both MyoD and Myogenin were detected in transfected MSCs by RTPCR. Differentiation of MSCs was induced by cocultured with C2C12 myoblasts, and MyoD expression was identified by i

4、mmunofluorescence (IF). RESULTS: FCM showed that CD11b and CD45 were negative, CD29 and CD44 were positive in MSCs surface antigens. With the increasing of AdGFP multiple of infection (MOI), transfection rate were also increased. When MOI was over 100, cytopathic effect appears on MSCs. Expressions

5、of both MyoD and Myogenin in transfected MSCs were approved by RTPCR; and MyoD protein can be found in induced MSCs by IF. CONCLUSION: MSCs can be effectively transfected by AdGFP and express GFP; and activation of intrinsic myogenic regulatory factors will enhance the myogenic differentiation of MS

6、Cs. 【Keywords】 mesenchymal stem cells; adenovirus; green fluorescent protein; C2C12; MyoD; Myogenin 【摘要】 目的：研究重組腺病毒（Ad）對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的轉(zhuǎn)染，以及綠色熒光蛋白（GFP）和成肌調(diào)節(jié)因子MyoD和Myogenin在MSCs中的表達(dá). 方法：用差速貼壁法體外培養(yǎng)大鼠MSCs，并用流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè)其表面標(biāo)志；對(duì)構(gòu)建有綠色熒光蛋白的重組腺病毒（AdGFP）進(jìn)行擴(kuò)增和鑒定，并轉(zhuǎn)染MSCs；用RTPCR檢測(cè)MyoD和Myogenin在轉(zhuǎn)染后MSCs中的表達(dá)；將MSCs與

7、C2C12成肌細(xì)胞共培養(yǎng)，誘導(dǎo)前者的分化，并用免疫熒光檢測(cè)MyoD的表達(dá). 結(jié)果：FCM檢測(cè)證實(shí)，在MSCs的表面標(biāo)志中CD11b和CD45陰性，而CD29和CD44陽性；隨著AdGFP感染復(fù)數(shù)（MOI）的增加，轉(zhuǎn)染效率也相應(yīng)提高，但在MOI大于100后，MSCs開始出現(xiàn)病變；RTPCR結(jié)果提示MyoD和Myogenin在轉(zhuǎn)染后的MSCs中有表達(dá)；免疫熒光檢測(cè)證實(shí)誘導(dǎo)后的MSCs可以表達(dá)MyoD蛋白. 結(jié)論：MSCs可以被AdGFP有效轉(zhuǎn)染而表達(dá)GFP；同時(shí)內(nèi)源性成肌調(diào)節(jié)因子的激活，可以促進(jìn)MSCs的成肌分化. 【關(guān)鍵詞】 基質(zhì)干細(xì)胞；腺病毒；綠色熒光蛋白；C2C12；MyoD；Myogeni

8、n 0引言 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells, MSCs）具有向成骨、脂肪、神經(jīng)以及肌肉等多種類型細(xì)胞分化的潛能，其易于分離和擴(kuò)增的特性，使其成為細(xì)胞治療的一種很有前景的治療手段1-3. 為促使MSCs更好地定向分化，對(duì)其進(jìn)行外源性基因修飾和/或內(nèi)源性基因的激活，成為目前亟待解決的問題. 我們通過構(gòu)建有綠色熒光蛋白（green fluorescent protein, GFP）的型重組腺病毒（AdGFP）轉(zhuǎn)染大鼠的MSCs，并與C2C12成肌細(xì)胞共培養(yǎng)，通過激活內(nèi)源性成肌調(diào)節(jié)因子，啟動(dòng)MSCs的成肌分化. 1材料和方法 1.1材料DMEM和1640培養(yǎng)基（Gibco

9、公司）、胎牛血清（杭州四季青公司）、新生牛血清（Hayclone公司）、FITC熒光標(biāo)記小鼠抗大鼠抗體（PharMingen and Serotec公司）、人胚腎293細(xì)胞和AdGFP（中山大學(xué)黃文林教授惠贈(zèng)）、C2C12細(xì)胞（中山大學(xué)潘秋輝博士惠贈(zèng)）、兔抗MyoD多克隆抗體（SantaCruz公司）、山羊抗兔cy3 IgG二抗（chemicon公司）. 健康雄性SD大鼠，清潔級(jí)，質(zhì)量5070 g，購(gòu)于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心. 1.2方法 1.2.1大鼠骨髓MSCs的體外分離培養(yǎng)及鑒定將SD大鼠引頸處死后于無菌條件下分離出股骨和脛骨，用注射器沖出骨髓后，再經(jīng)吹打制成單細(xì)胞懸液. 離心后棄上清，用

10、加有胎牛血清（FCS）的DMEM重懸細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)23 d后換液. 約12 wk，細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%時(shí)，用胰酶消化后傳代培養(yǎng)至P4代以后生長(zhǎng)均一，可用于實(shí)驗(yàn). 常規(guī)消化MSCs，PBS洗3次，加入飽和濃度FITC熒光標(biāo)記的小鼠抗大鼠CD11b, CD29, CD44和CD45抗體，室溫下避光孵育30 min，再以PBS清洗，多聚甲醛固定，流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè)MSCs的表面抗原. 1.2.2293細(xì)胞的培養(yǎng)、AdGFP的擴(kuò)增、純化、滴度的測(cè)定及鑒定將293細(xì)胞培養(yǎng)在含100 mL/L新生牛血清的1640中培養(yǎng)約48 h，細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)傳代培養(yǎng). 當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合時(shí)，

11、可用于AdGFP的擴(kuò)增. 棄去培養(yǎng)基，加入AdGFP，再加含50 mL/L新生牛血清和35 g/L精氨酸的1640培養(yǎng)3648 h. 當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE）時(shí)，連同培養(yǎng)液一同收集在離心管中，室溫1000 r/min，離心5 min，棄上清，加細(xì)胞裂解液，吹打均勻后凍存，在下次應(yīng)用前，應(yīng)于-80/37反復(fù)凍融3次，然后3600 r/min離心30 min，取上清接種至293細(xì)胞. 用CsCl2梯度離心法純化病毒，用TCID50檢測(cè)方法測(cè)定純化后的病毒滴度約為8×109國(guó)際單位（IU）. 取病變后293細(xì)胞的裂解上清，按照酚氯仿抽提方法提取病毒D

12、NA，進(jìn)行病毒基因組E2b區(qū)的PCR檢測(cè). 正義引物為5TCGTTTCTCAGCAGCTGTTG3， 反義引物為5CATCTGAACTCAAAGCGTGG3， 94預(yù)變性5 min，94變性1 min53退火1 min72延伸1 min，35個(gè)循環(huán)后，72延伸10 min. 1.2.3AdGFP轉(zhuǎn)染MSCs將MSC平均接種于六孔板中（2×105/孔），加無血清的DMEM，約23 h后細(xì)胞完全貼壁，按照感染復(fù)數(shù)（multiple of infection, MOI）分別為10，20，50，100，150，200，300，400和500，依次接種相應(yīng)劑量的AdGFP，2 h后，加含有FC

13、S的DMEM孵育24 h. 消化并離心后再用無血清的DMEM重懸，用FCM檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率. 檢測(cè)所用激發(fā)光為488 nm，接收光為530 nm，用Cellquest軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)獲取與分析. 以未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為陰性對(duì)照，使陰性對(duì)照區(qū)細(xì)胞數(shù)不超過0.1%.    1.2.4轉(zhuǎn)染前后MSCs的RNA提取及RTPCR反應(yīng)取轉(zhuǎn)染前后的MSCs提取總RNA. 按照試劑盒操作步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，分光光度計(jì)測(cè)定cDNA的濃度和純度后，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增. MyoD的正義引物為5CAACTGCTCTGATGGCATGATGG3，反義引物為5TGTTCTGCATCGCTTGAGGA

14、TGTC3；Myogenin的正義引物為5ACTACCCACCGTCCATTCAC3， 反義引物為5TCGGGGCACTCACTGTCTCT3；actin的正義引物為5AGGCATCCTGACCCTGAAGTAC3，反義引物為5TCTTCATGAGGTAGTCTGTCAG3，反應(yīng)條件為94預(yù)變性3 min，94變性40 s56退火40 s72延伸1 min，35個(gè)循環(huán)后，72延伸10 min. 1.2.5轉(zhuǎn)染GFP的MSCs與C2C12成肌細(xì)胞共培養(yǎng)后的免疫熒光檢測(cè)將轉(zhuǎn)染GFP后的MSCs與C2C12細(xì)胞按101混合，接種于培養(yǎng)板中共同培養(yǎng)（密度為104/cm2），48 h后檢測(cè)MyoD的表達(dá)

15、. 先后用多聚甲醛固定的Triton破膜， H2O2和山羊血清分別封閉，加兔抗MyoD（1100）于4過夜，山羊抗兔cy3（1200）孵育，DAPI（15000）復(fù)染后觀察. 2結(jié)果 2.1MSCs的傳代、擴(kuò)增、純化及表面標(biāo)志測(cè)定骨髓細(xì)胞懸液在接種24 h后開始貼壁，呈散在圓形分布；72 h后可見球形和梭形細(xì)胞生長(zhǎng). 培養(yǎng)57 d可見明顯分裂增殖的細(xì)胞，形成形態(tài)均一的細(xì)胞增殖集落. 培養(yǎng)至10 d左右，90%以上的細(xì)胞趨于融合，傳代后68 h以內(nèi)細(xì)胞基本貼壁. 24 h后開始增殖，細(xì)胞集落增多，呈“旋渦狀”生長(zhǎng). 3 d后可傳代，連續(xù)傳45代后趨于純化（圖1）. FCM檢測(cè)MSCs表面標(biāo)志，其

16、結(jié)果的均一性較好，其中造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志CD11b和CD45表達(dá)陰性，而CD29和CD44表達(dá)陽性（圖2）. 圖1P4代的MSC呈“旋渦狀”生長(zhǎng)×40（略） A：CD11b陰性；B：CD29陽性；C：CD44陽性；D：CD45陰性. 圖2檢測(cè)MSCs表面標(biāo)志的流式細(xì)胞圖（略） 2.2AdGFP在293細(xì)胞中的表達(dá)及鑒定AdGFP在轉(zhuǎn)染293細(xì)胞約68 h，就可以在熒光顯微鏡下見到綠色熒光，后者隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增多，24 h左右，綠色熒光最為強(qiáng)烈（圖3）. 約在3648 h出現(xiàn)CPE，表現(xiàn)為：90%100%的細(xì)胞腫脹變圓并離散，部分聚集呈葡萄狀，10%20%的細(xì)胞漂?。▓D4）.

17、本研究中所用重組腺病毒的E2b區(qū)為不可缺少的功能單位，將病變293細(xì)胞的裂解上清提取病毒DNA，進(jìn)行E2b區(qū)的PCR鑒定，得到一條861 bp的片段（圖5），提示腺病毒結(jié)構(gòu)完整.    圖3AdGFP轉(zhuǎn)染293細(xì)胞24 h所表達(dá)的綠色熒光 ×200（略） 2.3AdGFP轉(zhuǎn)染MSCs及其效率MSCs在感染AdGFP后，GFP的表達(dá)以24 h最為穩(wěn)定（圖6）. 當(dāng)MOI值（MOI=病毒滴度/所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞數(shù)）分別為10，20，50，100，150，200，300，400和500時(shí)，F(xiàn)CM測(cè)得相應(yīng)的轉(zhuǎn)染率依次為48.7，64.8，72.1，89.1，

18、89.9，93.1，94.4，95.8和96.8（%）（圖7），MOI從10100時(shí)候，轉(zhuǎn)染率增加最顯著，隨后盡管大幅度增加病毒的劑量，但其轉(zhuǎn)染效率不再明顯增加，同時(shí)細(xì)胞病變明顯，脫落細(xì)胞增多，因此以100作為最佳的MOI來感染MSCs. 圖4約3648 h出現(xiàn)病變效應(yīng)的293細(xì)胞表現(xiàn)腫脹變圓、部分已經(jīng)漂浮 ×200（略） M: 10 000 bp Marker; 1: E2B (861 bp). 圖5PCR檢測(cè)AdGFP的E2b區(qū)基因表達(dá)的電泳圖（略） 圖6AdGFP轉(zhuǎn)染MSCs 24 h所表達(dá)的綠色熒光 ×100（略） 圖7AdGFP對(duì)MSCs的轉(zhuǎn)染率（略） 2.4成肌

19、調(diào)節(jié)因子在轉(zhuǎn)染后MSCs mRNA水平上的表達(dá)AdGFP轉(zhuǎn)染后的MSCs經(jīng)RTPCR擴(kuò)增，分別得到長(zhǎng)度與目的基因MyoD（267 bp）和Myogenin（233 bp）相符的片斷（圖8），其中后者的表達(dá)量較少，二者與未經(jīng)轉(zhuǎn)染的MSCs的表達(dá)量相比無差別. M: 600 bp Marker; 1: actin (388 bp); 2: MyoD (267 bp); 3: Myogenin (233 bp). 圖8RTPCR檢測(cè)MyoD和Myogenin基因在轉(zhuǎn)染后MSCs中表達(dá)的電泳圖（略） 2.5免疫熒光檢測(cè)成肌調(diào)節(jié)因子在MSCs中的表達(dá)綠色熒光提示表達(dá)有GFP的MSCs，紅色熒光提示表達(dá)有

20、MyoD的細(xì)胞核（MSCs或C2C12細(xì)胞），藍(lán)色熒光是對(duì)全部細(xì)胞核的復(fù)染. 只有同時(shí)出現(xiàn)三種顏色熒光的陽性細(xì)胞核，才是MyoD陽性的MSCs（圖9）. 經(jīng)檢測(cè)未見Myogenin的表達(dá). 3討論 MSCs作為骨髓干細(xì)胞中的一種，含量很少（在骨髓中的全部有核細(xì)胞中僅占0.001%0.01%），但它們可以被高效地分離與擴(kuò)增，并在特定的培養(yǎng)條件下，被誘導(dǎo)向多種譜系細(xì)胞（如骨骼、脂肪、軟骨和肌肉）分化，因此在再生醫(yī)學(xué)和組織工程方面倍受關(guān)注1-3. 對(duì)表面抗原的研究表明，MSC表達(dá)多種細(xì)胞黏附分子，后者在干細(xì)胞的附著與歸巢方面發(fā)揮著作用4，在本研究中，經(jīng)FCM檢測(cè)顯示大鼠MSCs主要表達(dá)CD29和CD

21、44分子. A: GFP陽性的MSCs； B: MyoD陽性的細(xì)胞； C: DAPI復(fù)染的細(xì)胞核. 圖9MyoD在與C2C12成肌細(xì)胞共培養(yǎng)后的MSCs中的表達(dá) ×200（略） GFP是源于水母的一種穩(wěn)定的熒光團(tuán)，具有操作簡(jiǎn)便、可視性強(qiáng)并且不需要外源底物等優(yōu)點(diǎn)而成為細(xì)胞學(xué)研究的首選工具5. 通過其在活細(xì)胞或組織中的表達(dá)，而達(dá)到觀察后者形態(tài)和功能的變化的目的5. 重組腺病毒在不依賴細(xì)胞分裂的情況下，可以將目的基因轉(zhuǎn)運(yùn)至多種類型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并高水平表達(dá)，因此成為轉(zhuǎn)基因的一種首選載體6. AdGFP結(jié)合了GFP的示蹤特性和腺病毒轉(zhuǎn)染率高的特點(diǎn)，轉(zhuǎn)染MSC以后表達(dá)迅速而持久，有助于對(duì)細(xì)胞

22、進(jìn)行有效地示蹤觀察. 本研究采用流式細(xì)胞儀測(cè)定轉(zhuǎn)染效率，避免了人工計(jì)數(shù)可能帶來的誤差，敏感性和客觀性均得到提高7. 成肌調(diào)節(jié)因子基因家族包括MyoD，Myf5，Myogenin和MRF4，其中MyoD和Myf5在胚胎早期骨骼肌譜系的決定（determination）中起著關(guān)鍵作用，而Myogenin和MRF4則是發(fā)育中期成肌細(xì)胞向骨骼肌細(xì)胞進(jìn)一步分化（differentiation）所必需的8-9. 在本研究中，轉(zhuǎn)染GFP后的MSCs在mRNA水平仍然表達(dá)MyoD和Myogenin，提示前者的成肌潛力在受到腺病毒轉(zhuǎn)染以后并未受到影響. Thayer等研究表明，通過激活內(nèi)源性的成肌調(diào)節(jié)因子，可以

23、形成向成肌性細(xì)胞分化的正反饋調(diào)節(jié)環(huán)路10. C2C12細(xì)胞是小鼠C2成肌細(xì)胞的一種亞克隆，代表著肌肉分化的早期階段，在不同的培養(yǎng)條件下，即可以作為成肌細(xì)胞不斷增殖，也可以向肌管分化11-12. 本研究利用該細(xì)胞的成肌特性，與MSCs共培養(yǎng)，誘導(dǎo)后者向成肌方向分化. 免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示與C2C12細(xì)胞共培養(yǎng)后的部分MSCs可以表達(dá)MyoD，但未見Myogenin的表達(dá)，考慮與MSCs尚處于誘導(dǎo)分化的早期階段有關(guān). 目前認(rèn)為，通過共培養(yǎng)的方法誘導(dǎo)分化的機(jī)制主要與微環(huán)境的影響、細(xì)胞之間的融合或接觸有關(guān)12.    本研究結(jié)果提示：構(gòu)建綠色熒光蛋白的腺病毒可以

24、有效轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)干細(xì)胞并穩(wěn)定表達(dá)熒光；通過與成肌細(xì)胞共培養(yǎng)，可以激活內(nèi)源性成肌調(diào)節(jié)因子，一定程度上促使骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向肌肉細(xì)胞定向分化. 【參考文獻(xiàn)】 1 Barry FP, Murphy JM. Mesenchymal stem cells: Clinical applications and biological characterization J. Int J Biochem Cell Biol, 2004, 36: 568-584. 2 康新勤, 臧偉進(jìn), 胥曉麗, 等. 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分化特性J. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2004,25(14):1252-1255. 3 滕勇

25、, 胡蘊(yùn)玉, 安書杰, 等. 成人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)及定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞J. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2004,25(16):1492-1495. 4 Majumdar MK, KeaneMoore M, Buyaner D, et al. Characterization and functionality of cell surface molecules on human mesenchymal stem cells J. J Biomed Sci, 2003, 10: 228-241. 5 Ehrhardt D. GFP technology for live cell imaging J. Curr Opin Plant Biol, 2003, 6: 622-628. 6 Volpers C, Kochanek S. Adenoviral vectors for gene transfer and therapy J.