系統(tǒng)性紅斑狼瘡皮損角質(zhì)形成細(xì)胞體外培養(yǎng)及細(xì)胞學(xué)特性觀察

1、系統(tǒng)性紅斑狼瘡皮損角質(zhì)形成細(xì)胞體外培養(yǎng)及細(xì)胞學(xué)特性觀察                  作者：賴寬 曾凡欽 魏菁 郭慶 何嘉輝 譚國(guó)珍 李伯有 【摘要】  【目的】 體外培養(yǎng)系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)皮損部位角質(zhì)形成細(xì)胞(KC)，觀察其細(xì)胞學(xué)特性。 【方法】 原代培養(yǎng)SLE皮損和正常皮膚的角質(zhì)形成細(xì)胞，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)，免疫熒光法進(jìn)行角蛋白檢測(cè)并計(jì)算細(xì)胞純度;兩步消化法純化細(xì)胞;CCK-8(cell co

2、unting Kit-8)評(píng)價(jià)細(xì)胞的增殖情況，繪制生長(zhǎng)曲線。流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)周期和凋亡情況。【結(jié)果】 使用K-SFM(serum-free keratinocyte medium)無(wú)血清培養(yǎng)基能成功體外培養(yǎng)SLE皮損的角質(zhì)形成細(xì)胞，呈鋪路石樣。結(jié)合人工純化，能達(dá)到 > 95%的純度;與正常對(duì)照相比，SLE皮損角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期較遲(7 d vs. 4 d)，但進(jìn)入后增長(zhǎng)迅速，S期比例為： (40.68 ± 1.81)% vs. (34.43 ± 1.24)%(P < 0.05);凋亡率高：(6.08 ± 0.72)% vs. (4.32

3、 ± 0.44)%(P < 0.05)。【結(jié)論】 SLE皮損角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)難度大，細(xì)胞的生物學(xué)行為存在異常，可能為SLE發(fā)病的獨(dú)立、始發(fā)因素，其致病機(jī)制值得深入研究和探討。 【關(guān)鍵詞】  SLE; 角質(zhì)形成細(xì)胞; CCK-8; 凋亡; 細(xì)胞周期 Abstract： 【Objective】 To observe the cytologic characteristics of keratinocytes (KC) from lesion of systemic lupus erythematosus (SLE) patients in vitro. 【Methods】

4、 KC from lesions of SLE patients and healthy people (control group) were cultured in vitro and identified by detecting Pan cytokeratin with immunofluorescence. Features of the keratinocytes were analyzed with invert microscope. Two-step digestion when passaging was used to purify cell line. CCK-8 wa

5、s used to assay growth kinetics of the keratinocytes and come up with a growing curve after continuous analysis for two weeks. Cell circle and apoptosis were observed by flow cytometry. 【Results】 KC was cultured in vitro successfully. Concerning passage 2， over 95% of the cells from primary culture

6、were positive for cytokeratin. Comparing with KC from healthy people， KC from SLE lesions needed more time (7 d vs. 4 d) to reach exponential growth phase (EGP)， but grew faster in EGP. Both cell count at S phase and apoptosis rate of KC from SLE lesions elevated， when comparing with that of the con

7、trol group. 【Conclusion】 Keratinocytes from lesions of SLE patients are abnormal cytologically. It might be a vital cause of skin lesion of SLE， and a priming of SLE.    皮膚損害具有特征性而常見。據(jù)統(tǒng)計(jì)，55% 85% SLE患者出現(xiàn)皮膚損害1，這種損害出現(xiàn)得早2，往往在系統(tǒng)損害發(fā)生之前就出現(xiàn)，故為狼瘡早期診斷的重要線索。SLE可出現(xiàn)多種皮損，主要為紅斑，包括常見的碟形紅斑、播散性紅斑，

8、肢端紅斑等，發(fā)病機(jī)制尚未明朗，相關(guān)研究少。對(duì)狼瘡皮損發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)有助于進(jìn)一步解析狼瘡的發(fā)病機(jī)理，為狼瘡的診斷及治療提供依據(jù)和參考。本課題組之前通過(guò)蛋白組研究發(fā)現(xiàn)3：SLE皮損角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)多種異常蛋白，推測(cè)與狼瘡的發(fā)病相關(guān)。紅斑狼瘡皮膚損害究竟是繼發(fā)癥狀還是始發(fā)、獨(dú)立的致病因素，值得深入研究和探討。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)原代培養(yǎng)系統(tǒng)性紅斑狼瘡皮損的角質(zhì)形成細(xì)胞，觀察其細(xì)胞學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)SLE患者皮損角質(zhì)形成細(xì)胞的生物學(xué)行為存在異常，可能為狼瘡皮疹發(fā)生的重要原因，也可能與狼瘡的發(fā)病密切相關(guān)。 1 材料和方法 1.1 材 料 1.1.1 標(biāo) 本 10例SLE皮損標(biāo)本取自我科門診或住院患者，均為確診SLE的女

9、性患者(系統(tǒng)性紅斑狼瘡1982年診斷標(biāo)準(zhǔn))，且具有皮膚損害(紅斑)，平均年齡28.3(S = 5.1)歲，標(biāo)本均取自背部，狼瘡帶試驗(yàn)(lupus band test，LBT)陽(yáng)性;10例正常表皮標(biāo)本取自我院門診手術(shù)室，為接受手術(shù)治療的脂肪瘤或粉瘤女性患者，平均年齡27.4(S = 5.5)歲，標(biāo)本也均取自背部，表皮健康。患者知情并同意。 1.1.2 主要設(shè)備 美國(guó)Shellab CO2培養(yǎng)箱;日本Nikon 熒光倒置顯微鏡;流式細(xì)胞儀(FACScan，BD Biosciences); Labsystems Dragon酶標(biāo)儀(Wellscan MK 3)。 1.1.3 試 劑 Dispase(

10、分散酶)、K-SFM(serum-free keratinocyte medium)購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司;鼠抗人角蛋白一抗(mouse anti-Pan cytokeratin)及熒光二抗購(gòu)自武漢博士德公司;CCK-8(cell counting kit-8)購(gòu)自日本同仁公司;凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自?shī)W地利Bender Medsystems公司。 1.2 方 法 1.2.1 角質(zhì)形成細(xì)胞的原代培養(yǎng) 標(biāo)本去除皮下組織后剪成8 mm × 3 mm大小，稀釋5倍的雙抗PBS(含青霉素/鏈霉素，500 U/mL)浸泡1 h后，PBS清洗3次。加入1.6 U/mL dispase中4 消化過(guò)夜。第

11、2天剝離表皮置于2.5 g/L胰蛋白酶 + 0.2 g/L EDTA(1：1)中消化10 min，含100 mL/L FBS(fetal bovine serum，胎牛血清)的DMEM培養(yǎng)基終止消化，反復(fù)吹打后過(guò)篩，得角質(zhì)形成細(xì)胞懸液，低速離心(1 000 × g， 5 min)，K-SFM重懸后，按1 × 105/mL濃度接種6孔板，置于37 、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。    1.2.2 細(xì)胞傳代及純化 細(xì)胞培養(yǎng)至 > 70%融合時(shí)予傳代，先用2.5 g/L胰蛋白酶預(yù)消化6 min，在成纖維細(xì)胞、老化的角質(zhì)形成細(xì)胞(貼壁

12、能力差)被消化而浮起，具活力的角質(zhì)形成細(xì)胞(貼壁能力強(qiáng))收縮、變圓，但尚未浮起時(shí)，吸走消化液，以去除成纖維細(xì)胞及老化的角質(zhì)形成細(xì)胞;然后再用2.5 g/L胰蛋白酶 + 0.2 g/L EDTA(1 1) 混合液消化3 min， > 90% 角質(zhì)形成細(xì)胞浮起時(shí)，含血清(FBS 100 mL/L)完全DMEM培養(yǎng)基終止消化。經(jīng)PBS洗滌后，K-SFM重懸，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，接種、傳代。 1.2.3 角質(zhì)形成細(xì)胞的鑒定及純度計(jì)算 胰酶消化第一代原代細(xì)胞接種于48孔板，于指數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)：40 g/L多聚甲醛溶液固定細(xì)胞后，10 mL/L的triton處理5 min，30 mL/L B

13、SA(bovine serum albumin，牛血清白蛋白) 37 封閉半小時(shí)后加抗人角蛋白一抗(mouse anti-Pan cytokeratin)，4 過(guò)夜，PBS洗3次，二抗孵育1 h，DAPI染色5 min后，熒光顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)。純度評(píng)價(jià)：隨機(jī)取5個(gè)互不重疊的高倍視野(200 ×)，分別于綠色和藍(lán)色熒光下，計(jì)算(胞漿)免疫熒光陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和總的細(xì)胞數(shù)(細(xì)胞核數(shù))，并根據(jù)結(jié)果計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例。 1.2.4 生長(zhǎng)曲線 第二代角質(zhì)形成細(xì)胞以5 × 103/孔接種于96 孔板，每孔加CCK-8 10 L，37 孵育3 h后，酶標(biāo)儀檢測(cè)D (450 nm)。

14、每48 h檢測(cè)一次，連續(xù)14 d于同一時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行觀察，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。 1.2.5 細(xì)胞周期及凋亡 使用流式細(xì)胞儀分析第二代指數(shù)生長(zhǎng)期角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡情況。首先按2.5 × 104/cm2密度接種6孔板，培養(yǎng)至第7天時(shí)(70%融合)消化細(xì)胞，制備成濃度為1 × 106/mL單細(xì)胞懸液，70%凍乙醇 -20 過(guò)夜，第2天PI(碘化丙啶)染色后，流式細(xì)胞儀進(jìn)行DNA含量測(cè)定，細(xì)胞周期分析。凋亡檢測(cè)則用binding buffer制成2 × 105/mL濃度細(xì)胞懸液，采用FITC標(biāo)記的AnnexinV(鈣磷脂結(jié)合蛋白)和PI雙染后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。每組平

15、衡實(shí)驗(yàn)3次。 1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x ± s表示，使用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗(yàn)，P < 0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié) 果 2.1 角質(zhì)形成細(xì)胞的原代培養(yǎng) 原代培養(yǎng)約第24小時(shí)可見圓形或橢圓形角質(zhì)形成細(xì)胞貼壁，同時(shí)可見少量蜘蛛狀或樹根狀細(xì)胞(圖1)。48 h小集落形成。集落逐漸增大，向外擴(kuò)增、延伸，并互相融合，最終可連接成片，呈典型的“鋪路石”狀(圖2)。達(dá)70%融合時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代后，細(xì)胞生長(zhǎng)加快。    2.2 角質(zhì)形成細(xì)胞的鑒定和純度計(jì)算 角質(zhì)形成細(xì)胞胞漿顯示亮綠色熒光(圖 3)。

16、熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)并進(jìn)行純度計(jì)算，SLE皮損角質(zhì)形成細(xì)胞和正常對(duì)照組的陽(yáng)性率分別為：(96.8 ± 1.9)% vs.(97.5 ± 1.27)%(t = -1.04，P > 0.05)。 2.3 生長(zhǎng)曲線 對(duì)比SLE皮損角質(zhì)形成細(xì)胞和正常對(duì)照組角質(zhì)形成細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(圖 4)，SLE皮損角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期慢(7 d vs. 4 d)，但進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期后，其增殖能力較正常皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞強(qiáng)，生長(zhǎng)迅速(曲線斜率大)。 2.4 細(xì)胞周期及凋亡分析 與正常皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞相比，SLE皮損角質(zhì)形成細(xì)胞 S 期細(xì)胞比例為：(40.68 ± 1.81)% vs.

17、(34.43 ± 1.24)% (t = 9.005，P < 0.01)(圖5A，B);同時(shí)，指數(shù)生長(zhǎng)期凋亡率為：(6.08 ± 0.72)% vs.(4.32 ± 0.44)%(t = 6.606，P < 0.01)(圖6A，B)。 3 討 論 作為系統(tǒng)性紅斑狼瘡最常見的損害之一，皮膚損害因出現(xiàn)早，且與病情密切相關(guān)4，在狼瘡的診斷及治療中有著重要的意義。皮損的狀況可以直接反映狼瘡的活動(dòng)情況，為判斷病情，也為療效的觀察提供了重要的臨床線索。在狼瘡皮損發(fā)病機(jī)制的研究方面，過(guò)去集中在免疫復(fù)合物的沉積5-6，及其繼發(fā)的血管病變。本科室先前研究發(fā)現(xiàn)：皮損內(nèi)沉積

18、的DNA抗原與循環(huán)免疫復(fù)合物中的抗原并不完全相同7，提示皮膚組織的異?？赡転橐l(fā)紅斑狼瘡的獨(dú)立因素，是狼瘡引起皮膚損害，還是皮膚改變誘發(fā)了狼瘡?值得深入研究。我們利用蛋白組技術(shù)對(duì)系統(tǒng)性狼瘡皮損角質(zhì)形成細(xì)胞的蛋白質(zhì)進(jìn)行全面分析發(fā)現(xiàn)3：與正常相比較，紅斑狼瘡患者皮損角質(zhì)形成細(xì)胞中存在多種異常蛋白，提示紅斑狼瘡皮損角質(zhì)形成細(xì)胞存在異常，可能為狼瘡皮損乃至狼瘡發(fā)病的重要因素。為進(jìn)一步了解系統(tǒng)性紅斑狼瘡皮損角質(zhì)形成細(xì)胞的異常情況，掌握其生物學(xué)特性，本研究通過(guò)體外培養(yǎng)系統(tǒng)性紅斑狼瘡皮損部位的角質(zhì)形成細(xì)胞，觀察其細(xì)胞學(xué)特性，并與正常皮膚來(lái)源的角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)行比較。 因?yàn)闃?biāo)本量少(一般從病理取材的過(guò)程中取得)

19、，且本身處于病態(tài)(基底細(xì)胞液化)，所以SLE皮損角質(zhì)形成細(xì)胞原代培養(yǎng)難度大，適當(dāng)增加標(biāo)本量，取低年齡段患者( < 30歲)及盡量縮短胰酶的消化時(shí)間有助于提高成功率。使用dispase可以很好地分離真表皮(推薦4 消化過(guò)夜)，得到純度較高的角質(zhì)形成細(xì)胞，傳代過(guò)程中，通過(guò)不含EDTA的胰酶預(yù)消化，去除樹根狀細(xì)胞和老化的角質(zhì)形成細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的人工純化，并且可以減少消化對(duì)細(xì)胞的損傷，提高傳代后的貼壁率。實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)角蛋白的熒光染色、計(jì)數(shù)，證實(shí)第二代角質(zhì)形成細(xì)胞純度 > 95%，SLE組和正常對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。    通過(guò)CCK-8觀

20、察角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖情況并繪制生長(zhǎng)曲線我們發(fā)現(xiàn)：相同條件下，SLE皮損的角質(zhì)形成細(xì)胞較正常角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期慢(7 d vs. 4 d)，但一旦進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，其增殖速度較正常角質(zhì)形成細(xì)胞快。細(xì)胞周期分析也支持這一結(jié)果，檢測(cè)指數(shù)生長(zhǎng)期中角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)：SLE皮損角質(zhì)形成細(xì)胞處于S期細(xì)胞比例高，提示增長(zhǎng)、分裂較正常角質(zhì)形成細(xì)胞快。凋亡分析發(fā)現(xiàn)，與正常角質(zhì)形成細(xì)胞相比，SLE皮損角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡率高，這可能與快速增殖有關(guān)8。結(jié)合先前研究結(jié)果，我們可以假設(shè)：SLE皮損角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期后，處于異常的高增長(zhǎng)與高凋亡狀態(tài)，其凋亡所產(chǎn)生的細(xì)胞碎片、成分(含有多種異常蛋白)成為自

21、身抗原，經(jīng)過(guò)抗原提呈系統(tǒng)的處理、提呈，激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，引起自身免疫的發(fā)生。進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期緩慢可能與繼發(fā)的炎癥攻擊和損傷有關(guān)。因此，角質(zhì)形成細(xì)胞的異常生物學(xué)行為可能是SLE發(fā)病(或SLE皮損發(fā)病)的原發(fā)、始動(dòng)因素，值得進(jìn)一步深入研究。 本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞學(xué)的角度研究了SLE皮損角質(zhì)形成細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本生物學(xué)特性，為進(jìn)一步研究狼瘡皮損乃至狼瘡的發(fā)病提供一些基礎(chǔ)的信息，為下一步研究作鋪墊。 【參考文獻(xiàn)】  曾凡欽，許德清. 紅斑狼瘡 M. 北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2003：253.Vilar MJ， Bezerra EL， Sato EI. Skin is the most freque

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