第十二屆“挑戰(zhàn)杯”全國(guó)大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品

1、目錄摘要:2Abstract:31 緒論41.1京尼平的特性41.2 京尼平的制備及應(yīng)用現(xiàn)狀41.3 京尼平的制備和應(yīng)用的研究意義42 實(shí)驗(yàn)儀器與材料62.1實(shí)驗(yàn)儀器62.2實(shí)驗(yàn)材料63 原理與方法73.1原理73.2 方法73.2.1固定化酶的制備黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)-葡萄糖苷酶 -葡萄糖苷酶和菌絲的共固定化83.3 固定化酶催化梔子苷水解條件的優(yōu)化：83.4 京尼平的純化及結(jié)晶83.5 京尼平與氨基酸制備梔子藍(lán)色素93.6 京尼平作為交聯(lián)劑94 結(jié)果與分析104.1京尼平的制備實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析104.2 京尼平純化實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析104.2.1 樹脂吸附京尼平效果分析1

2、04.2.2 京尼平結(jié)晶114.2.3 京尼平純度測(cè)定114.3 京尼平與氨基酸制備梔子藍(lán)色素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析124.4 京尼平與賴氨酸顯色反應(yīng)過(guò)程中吸光度的變化：134.4 京尼平作為交聯(lián)劑實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與分析145 討論15參考文獻(xiàn)：15附錄：已錄用文獻(xiàn)161高色價(jià)梔子藍(lán)色素的制備及其穩(wěn)定性研究162京尼平的分離純化及高效液相色譜法測(cè)定223高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定京尼平和梔子苷28京尼平的制備，純化及應(yīng)用摘要:目的 （一）通過(guò)對(duì)京尼平制備，純化條件的實(shí)驗(yàn)研究，摸索出穩(wěn)定生產(chǎn)高純度京尼平的條件。（二）通過(guò)對(duì)京尼平特性的了解和進(jìn)一步研究，開發(fā)出其新的應(yīng)用領(lǐng)域，讓其更好的造福人類。方法 本實(shí)驗(yàn)研究的內(nèi)

3、容及步驟包括：固定化-葡萄糖苷酶的條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，-葡萄糖苷酶水解梔子苷條件的實(shí)驗(yàn)，京尼平的純化實(shí)驗(yàn)，京尼平制備梔子藍(lán)色素條件實(shí)驗(yàn)，京尼平用作生物交聯(lián)劑的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果 京尼平是可以通過(guò)-葡萄糖苷酶在55、pH=5.0，水解梔子苷制得的，轉(zhuǎn)化液經(jīng)樹脂HPD700吸附洗脫和結(jié)晶處理后，京尼平純度可得到98%以上，京尼平在適當(dāng)條件下與Lys、Arg反應(yīng)制得的梔子藍(lán)色素與等量的其他氨基酸相比色價(jià)最高，在作為固定化酶交聯(lián)劑方面，京尼平與戊二醛相比，前者所得固定化酶具有酶活損失率低，使用周期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)所用的方法可以制的高純度的京尼平，京尼平與氨基酸反應(yīng)可以得到高色價(jià)梔子藍(lán)色素，并且發(fā)現(xiàn)它有著傳統(tǒng)交

4、聯(lián)劑無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。Preparation of genipin, purification and application Abstract:objective genipin preparation,purification conditions experimental study, and explore the stable production of high purity genipin,Further study the application of genipin. Methods The experiment including: hydrolysis of genipin

5、 high enzyme activity of the immobilized enzyme, -glucosidase geniposide conditions of hydrolysis, conversion of liquid genipin purified preparation of genipin Conditions of gardenia blue pigment, crosslinker genipin for Experimental Biology. Results Genipin can be achieved through -glucosidase in 5

6、5, pH5.04 geniposide hydrolysis system, the transformation solution was obtained after adsorption resin HPD7100 more than 98% of genipin, genipin and Lys, Arg Preparation of plain blue gardenia highest price, in the immobilized enzyme as a crosslinking agent when compared with genipin and glutaralde

7、hyde immobilized enzyme lost little activity, the use of the advantages of a longer time. Conclusion The method used in this study can be made of high purity genipin, genipin reaction with the amino acids can be High Gardenia blue pigment, and found it an unparalleled advantage in a traditional cros

8、s-linking agent. 1 緒論1.1京尼平的特性 京尼平（genipin）來(lái)源于茜草科植物梔子，它是一種環(huán)烯醚萜類的白色化合物（結(jié)構(gòu)如圖1-1）。京尼平可以解除線粒體解耦聯(lián)蛋白2（Uncoupled Protein 2, UCP2）對(duì)胰島素釋放的抑制，改善II型糖尿病癥狀1，有望成為糖尿病治療的新型藥物。另外，京尼平在生物材料2,3、藥物合成4、藥物控釋5等領(lǐng)域也有廣泛應(yīng)用。也可以用于食品工業(yè)生產(chǎn)梔子藍(lán)色素6,7；它能與含氨基的化合物進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，細(xì)胞毒性小，而且相容性好。 京尼平分子式 京尼平結(jié)晶照片圖 1-1 京尼平1.2 京尼平的制備及應(yīng)用現(xiàn)狀參考已發(fā)表的專利、文獻(xiàn)，目前京尼

9、平的生產(chǎn)主要是通過(guò)微生物發(fā)酵工程，如利用青霉菌產(chǎn)生的-葡萄糖苷酶水解梔子苷，再用大孔樹脂吸附，洗脫液用硅膠柱進(jìn)一步純化，最后結(jié)晶和重結(jié)晶得到京尼平9,10，各步驟選用方法材料和反應(yīng)條件的控制是關(guān)鍵。目前報(bào)道的京尼平可應(yīng)用到與蛋白質(zhì)、膠原、明膠和殼聚糖等交聯(lián)制作生物材料，如人造骨骼、傷口包扎材料等，其毒性遠(yuǎn)低于戊二醛和其他常用化學(xué)交聯(lián)劑11,12。也可用于治療肝臟疾病、降壓、通便、緩解II型糖尿病的癥狀等。京尼平也可用做指紋采集試劑和制備高色價(jià)梔子藍(lán)色素。京尼平還可用作藥物合成的中間體、皮革鞣制工藝的綠色鞣劑等131.3 京尼平的制備和應(yīng)用的研究意義如上所述，京尼平有如此之多的應(yīng)用價(jià)值，但是由于

10、目前京尼平的制備技術(shù)不成熟，導(dǎo)致成本過(guò)高，限制了京尼平應(yīng)用到各個(gè)領(lǐng)域去，所以探索出一條簡(jiǎn)單制備京尼平的技術(shù)迫在眉睫。京尼平可以用作制備高色價(jià)的梔子藍(lán)色素，梔子藍(lán)色素是一種安全無(wú)毒的食用天然色素，它耐熱、耐光、耐酸堿，pH適應(yīng)范圍廣，易溶解于水和低醇，可替代化學(xué)合成藍(lán)色素單獨(dú)使用，也可以與紅、黃類色素調(diào)配成綠、紫、棕等色調(diào)混合使用，在國(guó)外被廣泛應(yīng)用于食品、藥品及化妝品等產(chǎn)品的著色，具有很高的應(yīng)用價(jià)值14,15。但是目前應(yīng)用的微生物發(fā)酵梔子制備梔子藍(lán)色素，不僅污染大，而且引入雜質(zhì)多，導(dǎo)致所得梔子藍(lán)色素的色價(jià)不高，而直接用京尼平為原料與氨基酸反應(yīng)就可以避免這些缺點(diǎn)，從而得到高色價(jià)梔子藍(lán)色素。2 實(shí)驗(yàn)

11、儀器與材料2.1實(shí)驗(yàn)儀器 分析天平（JA3003）、層析柱（上海煊盛生化科技有限公司）、Olympus CX41顯微攝像系統(tǒng)、上海新苗DNP-9052BS-III電熱恒溫培養(yǎng)箱和DHG-9073BS-III恒溫鼓風(fēng)干燥箱、無(wú)菌操作臺(tái)、高效液相色譜（日本島津）、UV751GD紫外分光光度計(jì)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮儀器有限工日）、數(shù)顯恒溫水浴鍋、錐形瓶等 高效液相色譜 層析柱2.2實(shí)驗(yàn)材料98%梔子苷（臨川之信生物科技有限公司）、黑曲霉（中科院）、pda培養(yǎng)基、海藻酸鈉（上海國(guó)藥試劑）、戊二醛、明膠 、乙酸、氫氧化鈉、甲醇、乙醇、丙酮、乙醚 等氨基酸: Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln

12、、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val（上海源聚生物科技有限公司）大孔樹脂HPD100、HPD300、HPD400、HPD700（滄州寶恩化工）；大孔樹脂HZ201、HZ801、802、803（上海華震科技貿(mào)易公司）3 原理與方法3.1原理京尼平（Genipin）是梔子苷經(jīng)-葡萄糖苷酶水解后的產(chǎn)物。因此，我們以高純梔子苷為原料，采用-葡萄糖苷酶水解（原理見圖3-1），再經(jīng)吸附、洗脫、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、重結(jié)晶、低溫干燥而制得。在制備的過(guò)程中我們分別對(duì)反應(yīng)的最適PH、溫度、反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行了試驗(yàn)，得出最適條件。圖 3-1 反應(yīng)式由于京尼

13、平分子中隱含有獨(dú)特的戊二醛結(jié)構(gòu)，可以與伯氨基化合物發(fā)生反應(yīng)生成藍(lán)色化合物（反應(yīng)機(jī)理見圖3-2），所以可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出一種氨基酸與京尼平在特定條件反應(yīng)制備相對(duì)較高的梔子藍(lán)色素。圖3-2 京尼平與氨基交聯(lián)京尼平可以與蛋白質(zhì)、膠原、明膠和殼聚糖等交聯(lián)，將京尼平用于固定化酶的交聯(lián)，與傳統(tǒng)交聯(lián)劑戊二醛作比較，比較其交聯(lián)效果。 3.2 方法本項(xiàng)目所研究的內(nèi)容涉及到這幾個(gè)方面:固定化酶制備京尼平及其條件的探索及優(yōu)化實(shí)驗(yàn)；京尼平純化條件探索及優(yōu)化實(shí)驗(yàn) ；氨基酸與京尼平反應(yīng)制備梔子藍(lán)色素的條件探索實(shí)驗(yàn)；京尼平作為交聯(lián)劑制備固定化-葡萄糖苷酶。3.2.1固定化酶的制備黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)-葡萄糖苷酶 通過(guò)參

14、考文獻(xiàn)得出黑曲霉產(chǎn)-葡萄糖苷酶的最佳培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件麥麩發(fā)酵培養(yǎng)基：麥麩20g/L (NH4)2SO4 6 gL，葡萄糖 5g/L 蛋白胨 4g/L KH2PO4 5 gL， MgSO4 1 gL， 吐溫（適量加入）搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：在250 mL三角瓶中加入7O mL麥麩培養(yǎng)基，接人種子培養(yǎng)液，搖瓶培養(yǎng)4 d，然后過(guò)濾收集菌絲，并用少量蒸餾水洗滌菌絲，除去菌種表面少量培養(yǎng)基，再用等體積的0.85NaCl溶液懸浮菌絲體 16。 -葡萄糖苷酶和菌絲的共固定化取海藻酸鈉6g放入100水中，在高溫度下煮透使海藻酸鈉使其均勻溶解與水中，放在室溫下靜置室溫，向中所得菌絲培養(yǎng)液取1

15、00ml并加入明膠和0.5%的戊二醛充分混勻后放入冰箱交聯(lián)2h小時(shí)，取出上述交聯(lián)后菌絲培養(yǎng)液與煮好的海藻酸鈉混合均勻之后用注射器制出直徑約20mm的球狀顆粒酶放入3%CaCl2 100ml中充分鈣化兩小時(shí)，取出濾干保存?zhèn)溆谩y(cè)得酶活最佳pH為4.5，固定化酶活最適溫度為5517,18。3.3 固定化酶催化梔子苷水解條件的優(yōu)化：3.3.1 取共固定化酶10g加入1%的梔子苷溶液30ml， pH調(diào)到7，分別在25、35、45、55、65、80水解，反應(yīng)2h取樣稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)化率。3.3.2 取共固定化酶10g加入1%的梔子苷溶液30ml，由3.31的最佳條溫度，pH分別為4、5、6、7、8、

16、9，反應(yīng)2h取樣稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)化率。 3.3.3 取共固定化酶10g加入1%的梔子苷溶液30ml，在2.32的最佳pH和3.31的最佳條溫度的條件下水解，每隔一個(gè)小時(shí)取一次樣，取樣稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)化率。3.4 京尼平的純化及結(jié)晶3.4.1 選取8種樹脂，分別稱取5g，用無(wú)水乙醇處理一個(gè)小時(shí)，取9個(gè)100ml錐形瓶，編號(hào)19，將處理好的樹脂分別加到18號(hào)錐形瓶中，9號(hào)做空白參照，加入經(jīng)水解后得到的京尼平原溶液20 mL，室溫振蕩吸附12 hr。然后按文獻(xiàn)19方法分別取2 mL吸附前和吸附后的京尼平原溶液，加入2 mL精氨酸80水浴顯色1 hr，測(cè)定590 nm處的吸光度值。3.4.2

17、將得到的京尼平粉末分別溶解到甲醇、乙醇、丙酮、乙醚中直到飽和，觀察出結(jié)晶的時(shí)間及晶體的量，用高效液相色譜檢測(cè)每種方法所得晶體的純度。3.5 京尼平與氨基酸制備梔子藍(lán)色素3.5.1 精確稱取京尼平6.69g，用pH7.0的乙酸-氫氧化鈉溶液溶解，定容后得到0.1mol/L的京尼平溶液300mL。再根據(jù)氨基酸分子量的不同，稱取一定數(shù)量的20種氨基酸，分別用pH7.0的乙酸-氫氧化鈉溶液溶解，定容后得到0.1mol/L的各種氨基酸溶液各10mL。分別取10mL 0.1mol/L的京尼平溶液與10mL 0.1mol/L的氨基酸溶液混合，80水浴反應(yīng)，每隔1hr取樣用紫外可見分光光度計(jì)掃描最大吸收波長(zhǎng)及

18、吸光度值，直到吸光度值不再增大，即停止反應(yīng)。按文獻(xiàn)方法測(cè)定色價(jià)19。3.5.2分別取50mL 0.1mol/L的京尼平溶液與100mL 0.1mol/L的賴氨酸溶液混合，參考文獻(xiàn)方法20顯色，即顯色溫度為80，顯色時(shí)間為16hr。分別取混合后0min，20min，16hr的樣品，用紫外可見分光光度計(jì)掃描，得到掃描曲線和最大吸收波長(zhǎng)及吸光度值。3.6 京尼平作為交聯(lián)劑發(fā)酵液過(guò)濾后濾液用DNS法檢測(cè)-葡萄糖苷酶酶活16。取50ml濾液加入終濃度為1%的京尼平交聯(lián)過(guò)夜，再與50ml濃度為6%的海藻酸鈉溶液混勻，然后用注射器緩慢滴到3%氯化鈣溶液中，硬化30min后分離固定化酶和氯化鈣溶液，分別測(cè)定兩

19、者酶活。以1%戊二醛為對(duì)照組，按同樣方法交聯(lián)后，分別測(cè)定固定化酶和氯化鈣溶液的酶活。4 結(jié)果與分析4.1京尼平的制備實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析按方法3.3.1,3.3.2,3.3.3，得出各種條件下-葡萄糖苷酶水解梔子苷的轉(zhuǎn)化率見表1。溫度、 時(shí)間、 PH / 轉(zhuǎn)化率 溫度（） 時(shí)間（h） PH25 23.5% 1h 36.5% 3.0 36.5%35 46.5% 2h 66.5% 4.0 43.5%45 70.6% 3h 86.4% 4.5 93.7%55 96.5% 4h 98.5% 5.0 97.8%65 58.7% 5h 99.6% 6.0 85.5%80 13.0% 6h 99.7% 8.0 2

20、5.5% 表一 水解轉(zhuǎn)化率從表1列出了在不同PH下固定化-葡萄糖苷酶水解濃度為1%梔子苷液中的轉(zhuǎn)化率的改變情況?？梢钥闯鲈谒嵝郧闆r下由于酶處于強(qiáng)酸或強(qiáng)堿的酸性環(huán)境中構(gòu)像發(fā)生改變，從而影響酶水解底物的反應(yīng)。另外也可看出固定化-葡萄糖苷酶在催化梔子苷的反應(yīng)中溫度對(duì)反應(yīng)的影響很大。當(dāng)酶與底物作用時(shí)，低溫將會(huì)抑制酶的活性而高溫則會(huì)引起酶的構(gòu)象嚴(yán)重畸變失活從而影響反應(yīng)的進(jìn)程。 在固定化-葡萄糖苷酶催化梔子苷反應(yīng)生成京尼平的過(guò)程中，隨著反應(yīng)的進(jìn)行底物濃度在不斷的降低，反應(yīng)速率也在不變化。所以討論反應(yīng)什么時(shí)候結(jié)束尤為重要。表1所示的反應(yīng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響反應(yīng)了催化的進(jìn)程，并得出經(jīng)過(guò)3h后底物基本被轉(zhuǎn)化完全。

21、4.2 京尼平純化實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.2.1 樹脂吸附京尼平效果分析按3.4.1方法，檢測(cè)經(jīng)樹脂吸附后液體在590nm下的吸光度，數(shù)據(jù)見表2.大孔樹脂吸附前A590nm（稀釋10倍）吸附后A590nm(稀釋2倍)吸附率HPD1000.360.46374.27%HPD3000.360.47673.55%HPD4000.360.35980.05%HPD7000.360.06396.50%HZ2010.360.66363.16%HZ8010.360.47373.72%8020.360.46074.45%8030.360.43076.11%表2 樹脂吸附京尼平試驗(yàn)數(shù)據(jù)由以上數(shù)據(jù)可以看出HPD700吸附京

22、尼平的效果最好。轉(zhuǎn)化液經(jīng)HPD700的吸附洗脫，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到京尼平粉末（見圖4-1） 圖 4-1 京尼平粉末4.2.2 京尼平結(jié)晶按方法3.4.2，京尼平粉末在甲醇中和乙醇中結(jié)晶效果差不多，出晶體的時(shí)間再3個(gè)小時(shí)左右，晶體量多，在丙酮中出的晶體最好，但是晶體量不多而且一天才能出晶體，乙醚效果最差。由于甲醇不安全，丙酮的出晶體時(shí)間長(zhǎng)和量不多，所以乙醇用作京尼平的結(jié)晶最好，顯微攝像系統(tǒng)下的乙醇結(jié)晶圖見4-2 圖4-2 京尼平晶體4.2.3 京尼平純度測(cè)定樣品制備:精密稱取京尼平20mg，用流動(dòng)相（甲醇與50mmol NaH2PO4水溶液比例為40：60）溶解后置于100ml 容量瓶中，定容，得到

23、0.2mg/ml的京尼平樣品。色譜條件:波長(zhǎng)238nm，大連依利特Hypersil C8柱（5mm*200mm;5um），流動(dòng)相為甲醇：50mmol NaH2PO4水溶液，比例為40：60，流速為0.6ml/min。進(jìn)樣量為10ul。檢測(cè)結(jié)果:用峰面積對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，京尼平純度大于98%。4.3 京尼平與氨基酸制備梔子藍(lán)色素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析按方法3.5.1，將不同氨基酸分別與京尼平反應(yīng)，測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收波長(zhǎng)和吸光度值，結(jié)果見表3。測(cè)定反應(yīng)后產(chǎn)物的色價(jià)，結(jié)果見表3。序號(hào)氨基酸總類最大吸收波長(zhǎng)maxmax的吸光度值色價(jià)E1%1cm1Ala (丙氨酸)5991.0041222Arg (精氨酸)

24、6002.9361653Asn天冬酰胺6080.312524Asp天冬氨酸5880.190365Cys(半胱氨酸)5990.414656Gln(谷氨酰胺)5990.613787Glu(谷氨酸)6031.3151258Gly (甘氨酸)5991.4501379His(組氨酸)5980.8539510Ile(異亮氨酸)6000.4947311Leu(亮氨酸)5990.5648112Lys (賴氨酸)5913.96418013Met(甲硫氨酸)6120.6058514Phe(苯丙氨酸6050.6769115pro(脯氨酸)0.079 16Ser(絲氨酸)6000.6218617Thr(蘇氨酸)601

25、0.3015318Trp(色氨酸)5870.3445919Tyr(酪氨酸)5910.3145220Val(纈氨酸)6010.4957321空白對(duì)照0.070 表3不同氨基酸與京尼平的呈色反應(yīng)結(jié)果從表可以知大部分氨基酸與京尼平的反應(yīng)產(chǎn)物最大吸收波長(zhǎng)都在595600nm之間，只有Pro與Trp 呈色效果不明顯。賴氨酸和精氨酸與氨基酸反應(yīng)的到梔子藍(lán)色素的色價(jià)高。圖4-3是賴氨酸與京尼平反應(yīng)到的梔子藍(lán)色素。 圖4-3 梔子藍(lán)色素4.4 京尼平與賴氨酸顯色反應(yīng)過(guò)程中吸光度的變化：按方法3.5.2采用紫外可見分光光度計(jì)監(jiān)測(cè)賴氨酸與京尼平的顯色反應(yīng)進(jìn)程，分別用全波長(zhǎng)掃描混合后0min，20min，16hr的

26、3個(gè)樣品，得到3條掃描曲線如圖4-4所示。圖4-4京尼平與賴氨酸顯色0min、20min和16hr紫外可見光譜掃描曲線圖由圖4-3可知，混合后0min的樣品在238nm處有一吸收峰，反應(yīng)20min后在291nm處出現(xiàn)一個(gè)新的吸收峰，16hr后238nm處的吸收峰消失，出現(xiàn)590nm吸收峰。由掃描結(jié)果圖可知，京尼平與賴氨酸反應(yīng)是個(gè)緩慢的過(guò)程，首先生成一個(gè)在291nm有吸收峰的中間產(chǎn)物，然后才生成梔子藍(lán)色素。4.4 京尼平作為交聯(lián)劑實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與分析按3.6方法京尼平戊二醛分別用于固定化酶交聯(lián)，結(jié)果比較如表4 京尼平組戊二醛組顏色深藍(lán)色淡黃色質(zhì)地柔軟有彈性柔軟有彈性固定化酶總酶活 1138

27、.7U/h 524.3U/h酶活回收率 86.7%51.2% 表4 京尼平、戊二醛交聯(lián)試驗(yàn)由表4可知，京尼平用作固定化酶交聯(lián)劑時(shí)，除了有傳統(tǒng)交聯(lián)劑的特性，它用作固定化酶交聯(lián)時(shí)酶活損失少，回收率比戊二醛高30%多。圖4-5是京尼平與戊二醛交聯(lián)效果圖比較。 圖4-5 固定化酶5 討論（1）通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，采用固定化-葡萄糖苷酶催化梔子苷制備京尼平的方法確實(shí)為一種合理的催化反應(yīng)，同傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵產(chǎn)酶進(jìn)行液體水解梔子苷的方法相比具有高效、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，分析其原因，可能與實(shí)驗(yàn)過(guò)程中更好地利用固定化酶的使用周期長(zhǎng)，不會(huì)產(chǎn)生副產(chǎn)物且催化過(guò)程中不會(huì)帶入雜質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，大大簡(jiǎn)化了京尼平的純化工藝，為制得高純度的

28、京尼平提供了條件。（2）在京尼平的純化試驗(yàn)過(guò)程中通過(guò)對(duì)多種樹脂對(duì)京尼平的吸附、洗脫試驗(yàn)，得到了吸附效果好，易洗脫并在洗脫的過(guò)程中不會(huì)帶有雜質(zhì)，這也為后面京尼平的進(jìn)一步精制提供了條件。在京尼平的精制的過(guò)程中通過(guò)對(duì)京尼平的極性，溶解性等多種化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)出多種適合其結(jié)晶的條件，并進(jìn)行京尼平的結(jié)晶條件的優(yōu)化。最終得到能短時(shí)間內(nèi)得到大量且純度高達(dá)98%的京尼平晶體。（3）在梔子藍(lán)色素的制備方面，我們通過(guò)對(duì)20種氨基酸與京尼平呈色反應(yīng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其反應(yīng)效果最好的氨基酸賴氨酸，并對(duì)賴氨酸與京尼平的反應(yīng)進(jìn)程進(jìn)行了細(xì)化研究，最終發(fā)現(xiàn)梔子藍(lán)色素的制備過(guò)程有中間產(chǎn)物存在，這位今后的制備高色價(jià)的梔子藍(lán)色素

29、提供了大量的數(shù)據(jù)。（4）在京尼平作為交聯(lián)劑的應(yīng)用方面，我們通過(guò)其與戊二醛對(duì)比，發(fā)現(xiàn)京尼平做為交聯(lián)劑所得固定化-葡萄糖苷酶的酶活更高，這也填補(bǔ)了京尼平作為交聯(lián)劑制備固定化酶的空白?？梢灶A(yù)測(cè)京尼平將作為一種天然、高效的交聯(lián)劑被廣大科研工作者運(yùn)用。參考文獻(xiàn)：1 MI F L,SHYU S S,PENG C K.Characterization of ring-opening polymerization of genipin and pH-dependent cross-linking reactions between chitosan and genipinJ.Journal of Polyme

30、r Science ,2005,43(10):19852000.2孫秀娟,范代娣,朱晨輝,等.類人膠原蛋白-透明質(zhì)酸血管支架的性能及生物相容性J.生物工程學(xué)報(bào),2009, 25(4):5913Kuo YC,Yeh CF,Yang JT.Differentiation of bone marrow stromal cells in poly(lactide-co-glycolide)/chitosan scaffoldsJ.Biomaterials,2009,30:66044邵日鳳,孫科,鄒澄,等.梔子苷元衍生物的格氏反應(yīng)J.云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,32(5):365Song F,Zhang

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32、62-2648 MUZZARELLI R A A. Genipin-crosslinked chitosan hydrogels as biomedical and pharmaceutical aidsJ. Carbohydrate Polymers,2009,77(1):1-9.9 TSAI T H,WESTLY J,LEE T F,et al.Identification and determination ofgeniposide,genipin,gardenoside,and geniposidic acid from herbs by HPLC/photodiode-array d

33、etectionJ. Journal of Liquid Chromatography,1994,17(10):21992205.10YAOX S,Wu L J,Wu J Z.Natural medicinal chemistryM.4th ed.Beijing:Peoples Medicinal Publishing House,2004:220.11 金勛杰等.京尼平交聯(lián)明膠特性隨時(shí)間變化的研究.生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志, 2008,1 12 Yao C.H,et al.Cavarial Bone Response to Tricalcium Phosphate-Genipin Cro

34、sslinked Gelatin Composite. Biomaterials 2005, 26, 306513丁克毅.京尼平與皮膠原的反應(yīng)性研究.中國(guó)皮革,2007.5 14Park Y S,Lee C M,Cho M H,et al. Physical stability of the blue pigments formed from geniposide of gardenia fruits: effects of pH, temperature, and lightJ. Journal of Agricultural Food and Chemistry,2001,49:

35、430-43215 Lone Jespersen,et. Heat and light stability of three natural blue colorants for use in confectionery and beveragesJ. European Food Research and Technology,2004,(11):16 16 羅建平，王貴娟，潘利華黑曲霉發(fā)酵麥麩生產(chǎn)口一葡萄糖苷酶的工藝優(yōu)化及動(dòng)力學(xué)研究EJ農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2007，23(12)：252 25717 趙林果 李麗娟.海藻酸鈉固定化-葡萄糖苷酶的研究. 生物加工過(guò)程2007年 5卷 4期25-3118

36、 朱均均, 江小華. 固定化-葡萄糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì). 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2007 年5 月第31 卷第3 期29-3319姚中銘、呂曉玲、諸樹成.梔子黃色素提取工藝的研究-微波提取法與傳統(tǒng)浸提法的比較J.天津輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào),2001,16(4):2120梁華正,樂長(zhǎng)高，廖曉峰.京尼平甙水解物與谷氨酸鈉反應(yīng)生成梔子藍(lán)色素的研究J.食品工業(yè)科技,2004,25(7):110附錄：已錄用文獻(xiàn)1高色價(jià)梔子藍(lán)色素的制備及其穩(wěn)定性研究高色價(jià)梔子藍(lán)色素的制備及其穩(wěn)定性研究徐尤智1，梁華正1*，陳賀1,2，賀玉蘭1，李媛1（1.東華理工大學(xué)生物系，江西撫州，344000 2.臨川之信生物科技有限公司，江西撫

37、州，344000）摘要： 研究20種氨基酸與京尼平的呈色反應(yīng)及部分反應(yīng)產(chǎn)物的穩(wěn)定性。分別將20種氨基酸與京尼平在80反應(yīng)16hr，再用HPD100大孔樹脂吸附梔子藍(lán)色素，然后用80%乙醇水溶液洗脫色素，洗脫液在50進(jìn)行減壓干燥，得到深藍(lán)色粉末，測(cè)定其色價(jià)，然后研究固體狀態(tài)的梔子藍(lán)色素的光照穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性。20種氨基酸與京尼平反應(yīng)后生成的梔子藍(lán)色素最大吸收波長(zhǎng)大都在590600nm之間，其中賴氨酸色價(jià)E1%1cm最高，達(dá)180，其次是精氨酸和甘氨酸，脯氨酸呈色效果最差；通過(guò)穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，太陽(yáng)光和日光燈照射對(duì)3種梔子藍(lán)色素穩(wěn)定性影響較小，紫外線影響稍大。賴氨酸與京尼平反應(yīng)生成的梔子藍(lán)色素

38、固體粉末低溫穩(wěn)定性好，高溫下穩(wěn)定性下降。賴氨酸、精氨酸和甘氨酸與京尼平反應(yīng)生成的梔子藍(lán)色素色價(jià)高，穩(wěn)定性好，有較好的應(yīng)用價(jià)值。關(guān)鍵詞：梔子藍(lán)色素；京尼平；氨基酸；色價(jià)Study on preparation and stabilityof high color value gardenia blueXU You-zhi1 LIANG Hua-zheng1* CHEN He1,2 HE Yu-lan1 LI Yuan1 (East China Institute of Technology，Biology Department，F(xiàn)uzhou,Jiangxi,3440002.Linchuan Zh

39、ixin Biotechnology Co., Ltd.,Fuzhou 34400,China)Abstract:The color reaction of 20 amino acids with genipin were studied,and the stability of the reaction products gardenia blue were studied too. We use 20 amino acids to react with genipin respectively at 80 for 16hr, HPD100 resin to adsorb the garde

40、nia blue,then use 80% ethanol to elute,the elution were dried at 50,the gardenia blue were obtained.We also studied the stability of solid gardenia blue to light,UV and temperature.The results showed that the max of the reaction products are almost between 590-600nm ,the color of the reaction produc

41、ts of Lys, Arg and glycine with genipin are strong, but the color of the reaction products of Pro with genipin is very weak.The results of stability experiments showed, the solid gardnia blue is stable to light or heat,but little poor to UV.Key words: Gardenia blue; Genipin; Amino acid; Color value中

42、圖分類號(hào)：TS202.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：梔子藍(lán)色素（gardenia blue）是一種天然水溶性色素，它耐熱、耐光、耐酸堿，pH適應(yīng)范圍廣，廣泛應(yīng)用于食品、藥品及化妝品等的著色1,2。梔子藍(lán)色素的制備方法一般采用產(chǎn)-葡萄糖苷酶的微生物發(fā)酵梔子黃色素廢液，將其中的梔子苷水解為京尼平，再與氨基酸反應(yīng)而制得，該方法制備的梔子藍(lán)色素純度不高、色價(jià)低，原因在于發(fā)酵液中有多種氨基酸存在，它們可以與京尼平發(fā)生顯色反應(yīng)，并且發(fā)酵液成份復(fù)雜，給梔子藍(lán)色素的提純帶來(lái)困難3,4。另外，也有報(bào)道直接采用-葡萄糖苷酶水解梔子苷得到京尼平，再與氨基酸反應(yīng)顯色得到梔子藍(lán)色素5,6，這種方法的缺點(diǎn)在于水解液中-葡

43、萄糖苷酶可以與水解生成的京尼平反應(yīng)，造成較大的浪費(fèi)。京尼平與氨基酸的顯色反應(yīng)機(jī)理如圖1所示7,8。圖1京尼平與氨基酸的反應(yīng)機(jī)理示意圖本文研究了提純后的京尼平與20種氨基酸顯色反應(yīng)，制備得到高色價(jià)的梔子藍(lán)色素產(chǎn)品，并研究了產(chǎn)物的穩(wěn)定性，為梔子藍(lán)色素的生產(chǎn)應(yīng)用打好基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 材料與試劑京尼平（98%，臨川之信生物科技有限公司）；Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val（分析純，上海源聚生物科技有限公司）；大孔吸附樹脂HPD100（滄州寶恩化工有限公司）；其他試劑均為

44、分析純，所用水為蒸餾水。1.2 主要儀器 UV-260紫外可見分光光度計(jì)(日本島津)；PHS-2F數(shù)字酸度計(jì)（上海雷磁公司）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）；電熱真空干燥箱ZK-82B（上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司）。1.3 實(shí)驗(yàn)方法1.3.1 京尼平與氨基酸溶液的配制：精密稱取京尼平22.623g，用50mM的pH7.0乙酸-乙酸鈉緩沖溶液溶解，定容后得0.1mol/L的京尼平溶液1000mL。分別稱取20種氨基酸一定量，用蒸餾水溶解后定容，配制成0.1mol/L的氨基酸溶液各100mL。1.3.2氨基酸與京尼平的顯色反應(yīng)：分別取50mL 0.1mol/L的京尼平溶液與100mL 0.

45、1mol/L的20種不同的氨基酸溶液混合，參考文獻(xiàn)方法9顯色，即顯色溫度為80，顯色時(shí)間為16hr。1.3.3 紫外可見分光光度計(jì)監(jiān)測(cè)氨基酸與京尼平的顯色反應(yīng)進(jìn)程按方法1.3.2進(jìn)行氨基酸與京尼平顯色反應(yīng)，分別取混合后0min，20min，16hr的樣品，用紫外可見分光光度計(jì)掃描，得到掃描曲線和最大吸收波長(zhǎng)及吸光度值。1.3.4梔子藍(lán)色素色價(jià)的測(cè)定：按方法1.3.2將京尼平分別與20種氨基酸進(jìn)行顯色反應(yīng)，顯色反應(yīng)完成后，將反應(yīng)液用HPD100大孔樹脂吸附梔子藍(lán)色素，然后用80%乙醇水溶液洗脫色素，洗脫液在50進(jìn)行減壓干燥，得到深藍(lán)色固體，稱量，測(cè)定其色價(jià)。梔子藍(lán)色素色價(jià)E1%1cm可按下式計(jì)算

46、10：E1%1cm（590 nm）=AV/100mE1%1cm：表示用1的比色皿，波長(zhǎng)為590nm，梔子藍(lán)色素溶液濃度為1%時(shí)的色價(jià) A：梔子藍(lán)色素溶液的A590nm值 V：梔子藍(lán)色素溶液的體積，單位mLm：梔子藍(lán)色素質(zhì)量，單位g1.3.5梔子藍(lán)色素色價(jià)光照穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)按方法1.3.2，分別將賴氨酸、精氨酸和甘氨酸與京尼平進(jìn)行顯色反應(yīng)，然后按方法1.3.4制得3種梔子藍(lán)色素粉末，各取1.0 g平鋪成1cm2，分別用自然太陽(yáng)光暴曬、日光燈照射或紫外線照射，每隔一定時(shí)間后取樣50mg，配制成溶液并測(cè)其吸光度值，計(jì)算色素殘存率。1.3.6梔子藍(lán)色素色價(jià)溫度穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)按方法1.3.2，將賴氨酸與京尼平進(jìn)

47、行顯色反應(yīng)，然后按方法1.3.4制得梔子藍(lán)色素粉末，取1.0 g平鋪成1cm2，置于30、60、90的恒溫箱中保存，每隔一定時(shí)間后取樣50mg，配制成溶液并測(cè)其吸光度值，計(jì)算色素殘存率。2 結(jié)果與討論2.1 京尼平與賴氨酸顯色反應(yīng)過(guò)程中吸光度的變化：按方法1.3.3采用紫外可見分光光度計(jì)監(jiān)測(cè)賴氨酸與京尼平的顯色反應(yīng)進(jìn)程，分別用全波長(zhǎng)掃描混合后0min，20min，16hr的3個(gè)樣品，得到3條掃描曲線如圖2所示。圖2京尼平與賴氨酸顯色0min、20min和16hr紫外可見光譜掃描曲線圖由圖2可知，混合后0min的樣品在238nm處有一吸收峰，反應(yīng)20min后在291nm處出現(xiàn)一個(gè)新的吸收峰，16

48、hr后238nm處的吸收峰消失，出現(xiàn)590nm吸收峰。由掃描結(jié)果圖可知，京尼平與賴氨酸反應(yīng)是個(gè)緩慢的過(guò)程，首先生成一個(gè)在291nm有吸收峰的中間產(chǎn)物，然后才生成梔子藍(lán)色素。2.2京尼平與20種氨基酸顯色反應(yīng)產(chǎn)物的色價(jià)及最大吸收波長(zhǎng)按方法1.3.2將20種氨基酸分別與京尼平反應(yīng)，測(cè)定反應(yīng)終點(diǎn)時(shí)溶液的最大吸收波長(zhǎng)和吸光度值，結(jié)果見表1。然后按方法1.3.4測(cè)定不同氨基酸顯色所得的梔子藍(lán)色素的色價(jià)，結(jié)果見表1。表1 不同氨基酸與京尼平的呈色反應(yīng)結(jié)果序號(hào)氨基酸總類最大吸收波長(zhǎng)maxmax處吸光度值（×200）色價(jià)E1%1cm（590 nm）1Ala (丙氨酸)5991.041222Arg (

49、精氨酸)5962.931653Asn天冬酰胺6010.3152.24Asp天冬氨酸5950.1936.55Cys(半胱氨酸)5970.4165.66Gln(谷氨酰胺)5990.6178.57Glu(谷氨酸)6001.311258Gly (甘氨酸)5931.451379His(組氨酸)5980.8595.810Ile(異亮氨酸)6000.4973.311Leu(亮氨酸)5990.5681.512Lys (賴氨酸)5903.9618013Met(甲硫氨酸)6020.6585.814Phe(苯丙氨酸6050.6791.715pro(脯氨酸)/0.00 /16Ser(絲氨酸)6000.6286.617

50、Thr(蘇氨酸)6010.3053.518Trp(色氨酸)5870.3459.519Tyr(酪氨酸)5910.3152.820Val(纈氨酸)6010.4973.621空白對(duì)照/0.00 /由表1可知，大部分氨基酸與京尼平的反應(yīng)產(chǎn)物最大吸收波長(zhǎng)都在590600nm之間，呈亮麗的藍(lán)色。呈色較深的氨基酸有賴氨酸、精氨酸、甘氨酸、谷氨酸和丙氨酸，呈色較淺的氨基酸有天冬氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸和酪氨酸，脯氨酸幾乎不顯色。反應(yīng)液用HPD100大孔樹脂吸附梔子藍(lán)色素，然后用80%乙醇水溶液洗脫色素，洗脫液經(jīng)50減壓干燥，得到的固體色價(jià)最高的為賴氨酸，其次是精氨酸和甘氨酸。2.3京尼平與3種氨基酸顯色反應(yīng)產(chǎn)物

51、的穩(wěn)定性梔子藍(lán)色素的穩(wěn)定性研究已有報(bào)道1,2，但一般都是以梔子藍(lán)色素溶液為考察對(duì)象，本實(shí)驗(yàn)主要研究固體狀態(tài)的梔子藍(lán)色素的穩(wěn)定性，并主要研究其對(duì)光照和溫度的穩(wěn)定性。2.3.1 光照條件對(duì)梔子藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響 室外光照對(duì)梔子藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響按方法1.3.5將賴氨酸、精氨酸和甘氨酸與京尼平反應(yīng)生成的3種梔子藍(lán)色素粉末，各取1.0 g平鋪置于室外，用自然太陽(yáng)光暴曬，光照強(qiáng)度平均1200lx，每暴曬1d后取樣，配制成溶液并測(cè)其吸光度值，結(jié)果如表2。由表2可知，7d后3種梔子藍(lán)色素的殘留值都在90以上。表2 室外太陽(yáng)光對(duì)3種氨基酸與京尼平反應(yīng)產(chǎn)物穩(wěn)定性的影響光照時(shí)間(d)01234567

52、7d殘存率（）賴氨酸0.6990.6910.6780.6810.6550.6440.6390.63390.56精氨酸0.5650.5630.5510.5450.5360.5330.5340.52893.36甘氨酸0.3050.3030.3010.2950.2890.2860.2870.28091.80 室內(nèi)光照對(duì)梔子藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響按方法1.3.5將制得賴氨酸、精氨酸和甘氨酸與京尼平反應(yīng)生成的3種梔子藍(lán)色素粉末，各取1.0 g平鋪置于室內(nèi)40瓦日光燈處光照，光照強(qiáng)度為300lx，每照4d后取樣，配制成溶液并測(cè)其吸光度值，結(jié)果如表3。由圖3可知，28d后藍(lán)色素的殘留量在97以上。

53、表3 日光燈對(duì)3種氨基酸與京尼平反應(yīng)產(chǎn)物穩(wěn)定性的影響光照時(shí)間(d)048121620242828d殘存率（）賴氨酸0.6990.6970.6940.6900.6890.6870.6840.68197.42精氨酸0.5650.5660.5620.5630.5580.5600.5560.55798.58甘氨酸0.3050.3020.3030.3050.3010.2890.2980.29998.0 紫外線對(duì)梔子藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響按方法1.3.5 將制得賴氨酸、精氨酸和甘氨酸與京尼平反應(yīng)生成的梔子藍(lán)色素粉末，各取1.0 g平鋪置于室內(nèi)40瓦紫外燈30厘米處照射，每照1hr后取樣，配制成溶液并測(cè)其吸光度值，結(jié)果如表4。由表4可知，6hr后藍(lán)色素的殘留量均在89以上。表4 紫外線對(duì)3種氨基酸與京尼平反應(yīng)產(chǎn)物穩(wěn)定性研究光照時(shí)間（hr）01234566hr殘存率（）賴氨酸0.6990.6860.6730.6610.6480.6300.