科學(xué)儀器學(xué)離心機

1、第六章 離心分離技術(shù) 離心技術(shù)(centrifugal technique)是根據(jù)顆粒在作勻速圓周運動時受到一個外向的離心力的行為而發(fā)展起來的一種分離技術(shù)。這項技術(shù)應(yīng)用很廣，諸如分離出化學(xué)反應(yīng)后的沉淀物、天然的生物大分子、無機物、有機物。在生物化學(xué)以及其它的生物學(xué)領(lǐng)域常用來收集細胞、細胞器及生物大分子物質(zhì)。6.1 基本原理6.1.1 離心力(centrifugal force，F(xiàn)c) 離心作用是根據(jù)在一定角度速度下作圓周運動的任何物體都受到一個向外的離心力進行的。離心力(Fc)的大小等于離心加速度2X與顆粒質(zhì)量m的乘積，即： Fcm2X 其中是旋轉(zhuǎn)角速度，以弧度秒為單位；X是顆粒離開旋轉(zhuǎn)中心的

2、距離，以cm為單位：m是質(zhì)量，以克為單位。6.1.2 相對離心力(relative centrifugal force，RCF) 由于各種離心機轉(zhuǎn)子的半徑或者離心管至旋轉(zhuǎn)軸中心的距離不同，離心力隨之變化，因此在文獻中常用“相對離心力”或“數(shù)字×g”表示離心力，只要RCF值不變，一個樣品可以在不同的離心機上獲得相同的結(jié)果。 RCF就是實際離心場轉(zhuǎn)化為重力加速度的倍數(shù)。 RCF = F離心力/F重力 = m2X/mg = 2X/g =（2n/60）2·X/980=X·n2·1.118×10-5 式中X為離心轉(zhuǎn)子的半徑距離，以cm為單位；g為地球重力

3、加速度(980cmsec2)；n為轉(zhuǎn)子每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)(rpm)。 在上式的基礎(chǔ)上，Dole和Cotzias制作了與轉(zhuǎn)子速度和半徑相對應(yīng)的離心力的轉(zhuǎn)換列線圖，見圖32。在用圖32將離心機轉(zhuǎn)數(shù)換成相對離心力時，先在離心機半徑標尺上取已知的離心機半徑和在轉(zhuǎn)數(shù)標尺上取已知的離心機轉(zhuǎn)數(shù)，然后將這兩點間劃一條直線，在圖中間RCF標尺上的交叉點，即為相應(yīng)的離心力數(shù)值。圖32 離心力的轉(zhuǎn)換列線圖例如，已知離心機轉(zhuǎn)數(shù)為2500rpm，離心機的半徑為7.7cm，將兩點連接起來交于RCF標尺，此交點500×g即是RCF值。6.1.3 沉降系數(shù)(sedimentation coefficient，s) 根據(jù)1

4、924年Svedberg對沉降系數(shù)下的定義：顆粒在單位離心力場中粒子移動的速度。S = （1/2X）·（dx/dt） =（1/2dt）·（dx/X）積分得：S = 2.303·（logX2-logX1）/2（t2-t1）若用2n/60表示，則 S = 2.1×102log（X2/X1）/n2（t2-t1） 式中X1為離心前粒子離旋轉(zhuǎn)軸的距離；X2為離心后粒子離旋轉(zhuǎn)軸的距離。S實際上時常在10-13秒左右，故把沉降系數(shù)10-13秒稱為一個Svedberg單位，簡寫S，量綱為秒。6.1.4 沉降速度(sedimentation velocity) 沉降速度是

5、指在強大離心力作用下，單位時間內(nèi)物質(zhì)運動的距離。 dx/dt = 2r2（p-m）/9·2X = d2（p-m）/18 ·2X 式中r為球形粒子半徑，d為球形粒子直徑；為流體介質(zhì)的粘度；p為粒子的密度；m為介質(zhì)的密度。 從上式可知，粒子的沉降速度與粒子直徑的平方、粒子的密度和介質(zhì)密度之差成正比；離心力場增大，粒子的沉降速度也增加，將此式代入上項沉降系數(shù)公式中，則S的表示式也可表示為： S = （1/2X）·（dx/dt）= d2（p-m）/18從該式中可看出，（1）當p >m ，則S>O，粒子順著離心方向沉降。（2）當p =m ，則S= 0，粒子到達某

6、一位置后達到平衡。（3）當p <m ，則S<O，粒子逆著離心方向上浮。6.1.5 沉降時間(sedimentation time，Ts) 在實際工作中，常常遇到要求在已有的離心機上把某一種溶質(zhì)從溶液中全部沉降分離出來的問題，這就必須首先知道用多大轉(zhuǎn)速與多長時間可達到目的。如果轉(zhuǎn)速已知，則需解決沉降時間來確定分離某粒子所需的時間。根據(jù)沉降系數(shù)(S)式可得： S = （1/2X）·（dx/dt） dt =（1/2S）·（dx/X）積分得： t2-t1 =（1/2S）·ln（X2/X1） 式中X2為離心轉(zhuǎn)軸中心至離心管底內(nèi)壁的距離；X1為離心轉(zhuǎn)軸至樣品溶液彎

7、月面之間的距離，那么樣品粒子完全沉降到底管內(nèi)壁的時間(t2-t1)用Ts表示則上式可改為： TS = （1/S2）·ln（XMAX/XMIN） 式中Ts以小時為單位，S以Svedberg為單位。6.1.6 K系數(shù)(k factor) K系數(shù)是用來描述在一個轉(zhuǎn)子中，將粒子沉降下來的效率。也就是溶液恢復(fù)成澄清程度的一個指數(shù)，所以也叫“cleaning factor”。原則上，K系數(shù)愈小的，愈容易，也愈快將粒子沉降。 K = 2.53×1011ln（Rmax/Rmin）/（rpm）2 其中Rmax為轉(zhuǎn)子最大半徑；Rmin為轉(zhuǎn)子最小半徑。由其公式可知，K系數(shù)與離心轉(zhuǎn)速及粒子沉降的路

8、徑有關(guān)。所以K系數(shù)是一個變數(shù)。當轉(zhuǎn)速改變，或者離心管的溶液量不同，即粒子沉降的路徑改變時，K系數(shù)就改變了。通常，離心機的轉(zhuǎn)子說明書中提供的K系數(shù)，都是根據(jù)最大路徑及在最大轉(zhuǎn)速下所計算出來的數(shù)值。如果已知粒子的沉降系數(shù)，再利用當時條件下的K系數(shù)，就可以估計離心分離的時間。例如要離心一個沉降系數(shù)為80S的Polysome，采用的轉(zhuǎn)子的K系數(shù)是323，那么預(yù)計沉降到管底所需的離心時間是T = kS = 4h，利用此公式預(yù)估的離心時間，對水平式轉(zhuǎn)子最適合，對固定角式轉(zhuǎn)子而言，實際時間將比預(yù)估的時間來得快些。6.2 離心機分類 離心機分為二大類，即制備性和分析性離心機。6.2.1 制備性離心機制備性離心

9、機又可分為三類：1、普通離心機 最大轉(zhuǎn)速6000 rpm左右，最大相對離心力近6000×g，容量為幾十毫升至幾升，分離形式是固液沉降分離，轉(zhuǎn)子有角式和外擺式，其轉(zhuǎn)速不能嚴格控制，通常不帶冷凍系統(tǒng)，于室溫下操作，用于收集易沉降的大顆粒物質(zhì)，如紅血球、酵母細胞等。這種離心機多用交流整流子電動機驅(qū)動，電機的碳刷易磨損，轉(zhuǎn)速是用電壓調(diào)壓器調(diào)節(jié)，起動電流大，速度升降不均勻，一般轉(zhuǎn)頭是置于一個硬質(zhì)鋼軸上，因此精確地平衡離心管及內(nèi)容物就極為重要，否則會損壞離心機。2、高速冷凍離心機 最大轉(zhuǎn)速為2000025000rpm（r/min），最大相對離心力為89000×g，最大容量可達3升，分離

10、形式也是固液沉降分離，轉(zhuǎn)頭配有各種角式轉(zhuǎn)頭、蕩平式轉(zhuǎn)頭、區(qū)帶轉(zhuǎn)頭、垂直轉(zhuǎn)頭和大容量連續(xù)流動式轉(zhuǎn)頭、一般都有制冷系統(tǒng)，以消除高速旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)頭與空氣之間摩擦而產(chǎn)生的熱量，離心室的溫度可以調(diào)節(jié)和維持在040C，轉(zhuǎn)速、溫度和時間都可以嚴格準確地控制，并有指針或數(shù)字顯示，通常用于微生物菌體、細胞碎片、大細胞器、硫酸銨沉淀和免疫沉淀物等的分離純化工作，但不能有效地沉降病毒、小細胞器(如核蛋白體)或單個分子。3、超速離心機 轉(zhuǎn)速可達5000080000 rpm，相對離心力最大可達510000×g，最著名的生產(chǎn)廠商有美國的貝克曼公司和日本的日立公司等，離心容量由幾十毫升至2升，分離的形式是差速沉降分離和

11、密度梯度區(qū)帶分離，離心管平衡允許的誤差要小于0.1克。超速離心機的出現(xiàn)，使生物科學(xué)的研究領(lǐng)域有了新的擴展，它能使過去僅僅在電子顯微鏡觀察到的亞細胞器得到分級分離，還可以分離病毒、核酸、蛋白質(zhì)和多糖等。6.2.2 分析性超速離心 與制備性超速離心不同的是：分析性超速離心主要是為了研究生物大分子的沉降特性和結(jié)構(gòu)，而不是專門收集某一特定組份。因此它使用了特殊的轉(zhuǎn)子和檢測手段，以便連續(xù)地監(jiān)視物質(zhì)在一個離心場中的沉降過程，見圖34。1測定生物大分子的相對分子量 測定相對分子量主要有三種方法，沉降速度、沉降平衡和接近沉降平衡。其中應(yīng)用最廣的是沉降速度，超速離心在高速中進行，這個速度使得任意分布的粒子通過溶

12、劑從旋轉(zhuǎn)的中心輻射地向外移動，在清除了粒子的那部分溶劑和尚含有沉降物的那部分溶劑之間形成一個明顯的界面，該界面隨時間的移動而移動，這就是粒子沉降速度的一個指標，然后用照相記錄，即可求出粒子的沉降系數(shù)。 S = （1/2X）·（dx/dt） 分子或粒子的相對分子量則可從Svedberg方程式來確定： M = RTS/D（1-）式中M：該分子不含水的相對分子量；R：氣體常數(shù)；T：絕對溫度；S：分子的沉降系數(shù)；：分子的微分比容(當一克溶質(zhì)加到一個大體積的溶液中所占有的體積)；：溶劑的密度。2生物大分子的純度估計 分析性超速離心已廣泛地應(yīng)用于研究DNA制劑、病毒和蛋白質(zhì)的純度。用沉降速度的技

13、術(shù)來分析沉降界面是測定制劑均質(zhì)性的最常用方法之一，出現(xiàn)單一清晰的界面一般認為是均質(zhì)的，如有雜質(zhì)則在主峰的一側(cè)或二側(cè)出現(xiàn)小峰。3分析生物大分子中的構(gòu)象變化 分析性超速離心已成功地用于檢測大分子構(gòu)象的變化，例如DNA可能以單股或雙股出現(xiàn)，其中每一股在本質(zhì)上可能是線性的，也可能是環(huán)狀的，如果遇到某種因素(溫度或有機溶劑)DNA分子可能發(fā)生一些構(gòu)象上的變化，這些變化也許可逆、也許不可逆，這些構(gòu)象上的變化可以通過檢查樣品在沉降速度上的差異來證實。 圖33 分析型超速離心機6. 3離心機轉(zhuǎn)頭 1、角式轉(zhuǎn)頭：角式轉(zhuǎn)頭是指離心管腔與轉(zhuǎn)軸成一定傾角的轉(zhuǎn)頭。它是由一塊完整的金屬制成的，其上有412個裝離心管用的機

14、制孔穴，即離心管腔，孔穴的中心軸與旋轉(zhuǎn)軸之間的角度在2040度之間，角度越大沉降越結(jié)實，分離效果越好。這種轉(zhuǎn)頭的優(yōu)點是具有較大的容量，且重心低，運轉(zhuǎn)平衡，壽命較長，顆粒在沉降時先沿離心力方向撞向離心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一側(cè)就會出現(xiàn)顆粒沉積，此現(xiàn)象稱為“壁效應(yīng)”，壁效應(yīng)容易使沉降顆粒受突然變速所產(chǎn)生的對流擾亂，影響分離效果。圖34 角式轉(zhuǎn)頭分離效果2、水平式轉(zhuǎn)頭：這種轉(zhuǎn)頭是由吊著的4或6個自由活動的吊桶（離心套管）構(gòu)成。當轉(zhuǎn)頭靜止時，吊桶垂直懸掛，當轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)速達到每分鐘200到800轉(zhuǎn)時，吊桶蕩至水平位置，這種轉(zhuǎn)頭最適合做密度梯度區(qū)帶離心，其優(yōu)點是梯度物質(zhì)可放在保持垂直的離心管中，離

15、心時被分離的樣品帶垂直于離心管縱軸，而不像角式轉(zhuǎn)頭中樣品沉淀物的界面與離心管成一定角度，因而有利于離心結(jié)束后由管內(nèi)分層取出已分離的各樣品帶。其缺點是顆粒沉降距離長，離心所需時間也長，水平式轉(zhuǎn)頭離心效果見下圖。3、垂直轉(zhuǎn)頭：其離心管是垂直放置，樣品顆粒的沉降距離最短，離心所需時間也短，適合用于密度梯度區(qū)帶離心，離心結(jié)束后液面和樣品區(qū)帶要作九十度轉(zhuǎn)向，因而降速要慢，垂直轉(zhuǎn)頭離心效果見下圖。圖35 三種類型離心機轉(zhuǎn)頭及離心管6. 4 離心管：離心管主要用塑料和不銹鋼制成，塑料離心管常用材料有聚乙烯（PE），聚碳酸酯（PC），聚丙烯（PP）等，其中PP管性能較好。塑料離心管的優(yōu)點是透明（或半透明），硬

16、度小，可用穿刺法取出梯度。缺點是易變形，抗有機溶劑腐蝕性差，使用壽命短。不銹鋼管強度大，不變形，能抗熱，抗凍，抗化學(xué)腐蝕。但用時也應(yīng)避免接觸強腐蝕性的化學(xué)藥品，如強酸、強堿等。塑料離心管都有管蓋，離心前管蓋必須蓋嚴，倒置不漏液。管蓋有三種作用：防止樣品外泄。用于有放射性或強腐蝕性的樣品時，這點尤其重要。防止樣品揮發(fā)。支持離心管，防止離心管變形。6.5 離心分離方法6.5.1 差速離心法 利用不同的粒子在離心力場中沉降的差別，在同一離心條件下，沉降速度不同，通過不斷增加相對離心力，使一個非均勻混合液內(nèi)的大小、形狀不同的粒子分部沉淀。操作過程中一般是在離心后用傾倒的辦法把上清液與沉淀分開，然后將上

17、清液加高轉(zhuǎn)速離心，分離出第二部分沉淀，如此往復(fù)加高轉(zhuǎn)速，逐級分離出所需要的物質(zhì)。 差速離心的分辨率不高，沉淀系數(shù)在同一個數(shù)量級內(nèi)的各種粒子不容易分開，常用于其他分離手段之前的粗制品提取。例如用差速離心法分離已破碎的細胞各組份 圖36 差速離心法分離已破碎的細胞各組份 6.5.2 速率區(qū)帶離心法 速率區(qū)帶離心法是在離心前于離心管內(nèi)先裝入密度梯度介質(zhì)(如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等)，待分離的樣品鋪在梯度液的頂部、離心管底部或梯度層中間，同梯度液一起離心。離心后在近旋轉(zhuǎn)軸處(X1)的介質(zhì)密度最小，離旋轉(zhuǎn)軸最遠處(X2)介質(zhì)的密度最大，但最大介質(zhì)密度必須小于樣品中粒子的最小密度，即p >m。

18、這種方法是根據(jù)分離的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子處于不同的密度梯度層內(nèi)分成一系列區(qū)帶，達到彼此分離的目的。梯度液在離心過程中以及離心完畢后，取樣時起著支持介質(zhì)和穩(wěn)定劑的作用，避免因機械振動而引起已分層的粒子再混合。由于p >m可知S>0，因此該離心法的離心時間要嚴格控制，既有足夠的時間使各種粒子在介質(zhì)梯度中形成區(qū)帶，又要控制在任一粒子達到沉淀前。如果離心時間過長，所有的樣品可全部到達離心管底部，離心時間不足，樣品還沒有分離。由于此法是一種不完全的沉降，沉降受物質(zhì)本身大小的影響較大，一般是應(yīng)用在物質(zhì)大小相異而密度相同的情況。常用的梯度液有Ficoll、Per

19、coll及蔗糖。6.5.3 等密度離心法等密度離心法是在離心前預(yù)先配制介質(zhì)的密度梯度，此種密度梯度液包含了被分離樣品中所有粒子的密度，待分離的樣品鋪在梯度液頂上或和梯度液先混合，離心開始后，當梯度液由于離心力的作用逐漸形成底濃而管頂稀的密度梯度，與此同時原來分布均勻的粒子也發(fā)生重新分布。當管底介質(zhì)的密度大于粒子的密度，即p <m時粒子上浮；在彎頂處p >m時，則粒子沉降，最后粒子進入到一個它本身的密度位置即p =m時，dx/dt為零，粒子不再移動，粒子形成純組份的區(qū)帶，與樣品粒子的密度有關(guān)，而與粒子的大小和其他參數(shù)無關(guān)，因此只要轉(zhuǎn)速、溫度不變，則延長離心時間也不能改變這些粒子的成帶

20、位置。 一般在物質(zhì)的大小相近，而密度差異較大時應(yīng)用此法。常用的梯度液是CsCl。6.6 梯度溶液的制備 1. 梯度材料的選擇原則 作為一種理想的梯度材料應(yīng)具備以下幾點：（1）與被分離的生物材料不發(fā)生反應(yīng)即完全惰性，且易與所分離的生物粒子分開。（2）可達到要求的密度范圍，且在所要求的密度范圍內(nèi)，粘度低，滲透壓低，離子強度和pH變化較小。（3）不會對離心設(shè)備發(fā)生腐蝕作用。（4）容易純化，價格便宜或容易回收。（5）濃度便于測定，如具有折光率。（6）對于超速離心分析工作來說，它的物理性質(zhì)、熱力學(xué)性質(zhì)應(yīng)該是已知的。這些條件是理想條件，完全符合每種性能的梯度材料幾乎是沒有的。下面介紹幾種基本上符合上述原則

21、的梯度材料：（1）糖類：蔗糖、甘油、聚蔗糖(Ficoll)、右旋糖酐、糖原。（2）無機鹽類：CsCl、RbCl、NaCl、KBr等。（3）有機碘化物：三碘苯甲酰、葡萄糖胺等。（4）硅溶膠：如Percoll。（5）蛋白質(zhì)：如牛血清白蛋白。（6）重水。（7）非水溶性有機物：如氟代碳等。2. 梯度材料的應(yīng)用范圍(1)蔗糖：水溶性大，性質(zhì)穩(wěn)定，滲透壓較高，其最高密度可達1.33g/ml，且由于價格低容易制備，是現(xiàn)在實驗室里常用于細胞器、病毒、RNA分離的梯度材料，但由于有較大的滲透壓，不宜用于細胞的分離。 (2)聚蔗糖：商品名Ficoll，常采用Ficoll-400也就是相對分子量為400000，F(xiàn)i

22、coll滲透壓低，但它的粘度卻特別高，為此常與泛影葡胺混合使用以降低粘度。主要用于分離各種細胞包括血細胞、成纖維細胞、腫瘤細胞、鼠肝細胞等。 (3)氯化銫：是一種離子性介質(zhì)、水溶性大，最高密度可達1.91g/ml。由于它是重金屬鹽類，在離心時形成的梯度有較好的分辨率，被廣泛地用于DNA、質(zhì)粒、病毒和脂蛋白的分離，但價格較貴。 (4)鹵化鹽類：KBr和NaCl可用于脂蛋白分離，KI和NaI可用于RNA分離，其分辨率高于銫鹽。NaCl梯度也可用于分離脂蛋白，NaI梯度可分離天然或變性的DNA。 (5)Percoll：是商品名，它是一種SiO2膠體外面包了一層聚乙烯吡咯酮(PVP)，滲透壓低，它對生

23、物材料的影響小，而且顆粒穩(wěn)定，在冷卻和凍融情況下還是穩(wěn)定的，其粘度高，且在酸性pH和高離子強度下不穩(wěn)定。它可用于細胞、細胞器和病毒的分離。3密度梯度超速離心方法將二個不同濃度的梯度液分裝于梯度混合器中，右側(cè)為高濃度梯度液，左側(cè)為低濃度梯度液，打開二室間的控制閥，右室在磁力攪拌器攪動下，打開梯度加液閥，緩緩的將梯度液沿管壁加入離心管中，此時由于右室液平面下降，而左室的液體不斷的補充，使離心管中的液體從高濃度向低濃度產(chǎn)生線性梯度。密度梯度離心管制備后，將需分離的樣品小心的加在離心管的上方，然后裝到水平式轉(zhuǎn)頭上開始離心，離心過程中，樣品中的成份根據(jù)其密度不同而在相應(yīng)的梯度液中沉降下來，產(chǎn)生清晰的分離

24、條帶，離心完成后取出離心管，可用以下幾種方法收集不同區(qū)帶的樣品組份：(1) 用注射器和滴管由離心管上部吸出。(2) 有針刺穿離心管底部滴出。(3) 用針刺穿離心管區(qū)帶部份的管壁，把樣品區(qū)帶抽出。(4) 用一根細管插入離心管底，泵入超過梯度介質(zhì)最大密度的取代液，將樣品和梯度介質(zhì)壓出，用自動部分收集器收集，見圖37。6.7 離心操作的注意事項：高速與超速離心機是生化實驗教學(xué)和生化科研的重要精密設(shè)備，因其轉(zhuǎn)速高，產(chǎn)生的離心力大，使用不當或缺乏定期的檢修和保養(yǎng)，都可能發(fā)生嚴重事故，因此使用離心機時都必須嚴格遵守操作規(guī)程。1. 使用各種離心機時，必須事先在天平上精密地平衡離心管和其內(nèi)容物，平衡時重量之差

25、不得超過各個離心機說明書上所規(guī)定的范圍，每個離心機不同的轉(zhuǎn)頭有各自的允許差值，轉(zhuǎn)頭中絕對不能裝載單數(shù)的管子，當轉(zhuǎn)頭只是部分裝載時，管子必須互相對稱地放在轉(zhuǎn)頭中，以便使負載均勻地分布在轉(zhuǎn)頭的周圍。2. 裝載溶液時，要根據(jù)各種離心機的具體操作說明進行，根據(jù)待離心液體的性質(zhì)及體積選用適合的離心管，有的離心管無蓋，液體不得裝得過多，以防離心時甩出，造成轉(zhuǎn)頭不平衡、生銹或被腐蝕，而制備性超速離心機的離心管，則常常要求必須將液體裝滿，以免離心時塑料離心管的上部凹陷變形。每次使用后，必須仔細檢查轉(zhuǎn)頭，及時清洗、擦干，轉(zhuǎn)頭是離心機中須重點保護的部件，搬動時要小心，不能碰撞，避免造成傷痕，轉(zhuǎn)頭長時間不用時，要涂

26、上一層上光臘保護，嚴禁使用顯著變形、損傷或老化的離心管。3. 若要在低于室溫的溫度下離心時。轉(zhuǎn)頭在使用前應(yīng)放置在冰箱或置于離心機的轉(zhuǎn)頭室內(nèi)預(yù)冷。4. 離心過程中不得隨意離開，應(yīng)隨時觀察離心機上的儀表是否正常工作，如有異常的聲音應(yīng)立即停機檢查，及時排除故障。5.每個轉(zhuǎn)頭各有其最高允許轉(zhuǎn)速和使用累積限時，使用轉(zhuǎn)頭時要查閱說明書，不得過速使用。每一轉(zhuǎn)頭都要有一份使用檔案，記錄累積的使用時間，若超過了該轉(zhuǎn)頭的最高使用限時，則須按規(guī)定降速使用。 圖37 密度梯度超速離心方法實驗二十二 序列超速離心分離血漿脂蛋白【目的與要求】了解超速離心分離技術(shù)的原理，掌握制備性分離血漿脂蛋白的方法?！驹怼炕驹硪姷?/p>

27、六章6.1、6.2節(jié)。本實驗采用正常人抗凝血漿，以NaBr為密度介質(zhì)，利用各脂蛋白顆粒密度不同，經(jīng)過序列超速離心大量制備各種血漿脂蛋白，經(jīng)透析脫鹽、PEG20000濃縮后保存?zhèn)溆?。【操作步驟】1 血漿制備：取獻血員全血400mL，EDTANa2抗凝，2000rpm離心15min，分離血漿。根據(jù)血漿體積，加入0.015%的苯甲基氟磺酰（PMSF），防止脂蛋白變性。 2CM和VLDL分離：血漿中加入適量的NaBr，調(diào)節(jié)密度至1.019g/ml，分置于離心管（38.5ml/管）中，加蓋，用1.019g/ml密度液平衡，放入RP 50T轉(zhuǎn)頭，在10下40，000rpm（145，000×g）離

28、心20小時。CM和VLDL浮于離心管上層，用吸管小心吸取。3 LDL分離：下層溶液中加入適量的NaBr，調(diào)節(jié)密度至1.060g/ml，分置于離心管中，加蓋，用1.060g/ml密度液平衡，放入RP 50T轉(zhuǎn)頭，在10下40，000rpm（145，000×g）離心20小時。LDL浮于離心管上層，用吸管小心吸取。4 Lp（a）和HDL分離：下層溶液中加入適量的NaBr，調(diào)節(jié)密度至1.125g/ml，分置于離心管中，加蓋，用1.125g/ml密度液平衡，放入RP 50T轉(zhuǎn)頭，在10下45，000rpm（185,000×g）離心24小時。Lp（a）、HDL和少量LDL浮于離心管上層

29、，用吸管小心吸取。5 HDL分離：下層溶液中加入適量的NaBr，調(diào)節(jié)密度至1.21g/ml，分置于離心管中，加蓋，用1.21g/ml密度液平衡，放入RP 50T轉(zhuǎn)頭，在10下45，000rpm（185，000×g）離心24小時。HDL浮于離心管上層，用吸管小心吸取。下層含有總量的50%的游離apoA-，可用于分離apoA-。6 透析：已分離好的各部分脂蛋白含有大量的NaBr，需要透析脫鹽。將各種脂蛋白溶液分別裝入透析袋中，對抗0.01mol/L PBS（pH7.4）溶液透析，每6小時更換1次透析液，共3次，第3次可透析過夜。7 濃縮：透析過夜的脂蛋白溶液連同透析袋一起放入盛有40%的

30、PEG20000的燒杯中，濃縮至適當體積。注：也可以透析和濃縮一步進行，即將分離后的脂蛋白溶液裝入一端接有梨形瓶的透析袋中(此透析袋能抵抗1個以上大氣壓)，透析袋浸入2000ml裝有0.01mol/L PBS（pH7.4）透析液的量筒中，梨形瓶的另一端通入氮氣，施加1個大氣壓(760mmHg)的氮氣后將梨形瓶的一端扎死，為了使透析效率增加，透析過程使用磁力攪拌，并不斷更換透析液。當樣品被濃縮至一定濃度(或體積)后停止透析，取出樣品。【試劑】1 NaBr2 密度液：以NaBr與雙蒸水配制，以比重計測定密度。配制成1）1.019g/ml； 2）1.060g/ml；3）1.125g/ml；4）1.21g/ml 四種密度液。3 苯甲基氟磺酰（PMSF）4 0.01mol/L PBS（pH7.4） 5 40% PEG20000【材料】1